歐 亞，元小冬，張麗麗

(華北理工大學附屬開灤總醫(yī)院，河北 唐山063000)

神經(jīng)干細胞的發(fā)現(xiàn)打破了神經(jīng)元不能再生的傳統(tǒng)觀念。目前研究資料表明，脂肪間充質干細胞(ADSC)是一種具有多向分化潛能的干細胞，它不僅可以在體外分化為脂肪細胞、成骨細胞、軟骨細胞和成肌細胞等中胚層來源的細胞，而且還可以橫向分化為神經(jīng)細胞和神經(jīng)膠質細胞，成為研究神經(jīng)系統(tǒng)退行性疾病的靶向細胞[1,2]。而作為中樞神經(jīng)系統(tǒng)膠質細胞中數(shù)量最多、體積最大的星形膠質細胞，其分泌的神經(jīng)營養(yǎng)因子等活性物質在腦內(nèi)廣泛分布，對神經(jīng)細胞有一定的營養(yǎng)作用，在保護神經(jīng)細胞、促進軸突生長、神經(jīng)損傷修復和維持正常的腦功能中有重要意義[3,4]。其中，膠質源性神經(jīng)營養(yǎng)因子(GDNF)作為GDNF家族中首次被發(fā)現(xiàn)的神經(jīng)營養(yǎng)因子，在多種膠質細胞中，尤其是星形膠質細胞中充分表達[5]。其神經(jīng)營養(yǎng)活性較高，不僅可以在保護多巴胺運動神經(jīng)元方面發(fā)揮作用，同時，對于中樞及外周的運動、感覺、交感神經(jīng)元等具有同等的營養(yǎng)作用。本研究通過對誘導過程中星形膠質細胞的GDNF檢測，探討在此過程中形成的星形膠質細胞是否具有神經(jīng)營養(yǎng)功能，以及GDNF對誘導過程所起到的作用。

1 材料與方法

1.1實驗取材本研究所用的脂肪組織為華北理工大學附屬開灤總醫(yī)院美容整形中心和唐山金榮整形美容醫(yī)院健康成人腹部皮下吸脂整形術后的脂肪組織廢棄物。此項研究經(jīng)志愿者同意并經(jīng)華北理工大學倫理委員會批準。

1.2ADSC的體外提取、培養(yǎng)脂肪組織取材后，應用Ye等人[6]的方法，將細胞置于恒溫培養(yǎng)箱中進行培養(yǎng)。隨后每3天換液1次，大約在10-14天細胞長滿瓶底，按照1∶2比例進行傳代，之后繼續(xù)應用培養(yǎng)液進行培養(yǎng)。

1.3ADSC向星形膠質細胞誘導分化收集生長狀態(tài)良好的第3-6代ADSC，制成細胞爬片，待細胞生長至70%左右融合時，開始應用以IBMX為主要成分的化學誘導劑進行誘導分化[7]，依據(jù)誘導分化反應時間分別分為誘導48 h組、誘導7 d組、誘導14 d組、誘導 21 d組。同時，選取按常規(guī)培養(yǎng)無誘導劑的未誘導細胞作為對照組。

1.4光學顯微鏡及透射電子顯微鏡下觀察誘導后細胞形態(tài)倒置相差顯微鏡下觀察未誘導及誘導48 h、7 d、1 4d和21 d時的細胞形態(tài)并攝片。消化、離心收集誘導分化48 h的成人ADSC。3%戊二醛、1%餓酸固定，丙醛脫水，環(huán)氧樹脂包埋，超薄切片機切片，2%醋酸鈾和枸櫞酸鉛染色，透射電鏡下觀察細胞超微結構、拍照記錄。未誘導的ADSC作為對照。

1.5免疫熒光細胞化學染色法檢測GFAP、GDNF及GFAP/GDNF共表達取未誘導及誘導后48 h、7 d、14 d、21 d細胞制作爬片，行免疫熒光GFAP、GDNF染色及GFAP和GDNF共染色。一抗分別為鼠抗人GFAP單克隆抗體、兔抗人GDNF多克隆抗體及二者的混合工作液。操作按試劑盒說明書進行。熒光顯微鏡下觀察并攝片。GFAP染色陽性細胞胞質為棕黃色，GDNF染色陽性細胞胞質為綠色，GFAP/GDNF共染色陽性細胞胞質為黃色。計算GFAP、GDNF及GFAP/GDNF共染色陽性細胞百分比。

1.6統(tǒng)計學方法所有實驗數(shù)據(jù)通過Excel 2003 建立數(shù)據(jù)庫，采用SPSS13.0統(tǒng)計軟件包進行統(tǒng)計，所得數(shù)據(jù)以均數(shù)±標準差表示，同一組內(nèi)不同時間點間的比較采用單因素方差分析，以P<0.05為差異具有統(tǒng)計學意義。

2 結果

2.1成人ADSC的原代及傳代培養(yǎng)

剛提取的成人ADSC呈類圓形、黑點狀，于體外培養(yǎng)24 h內(nèi)開始貼壁，而未貼壁細胞為圓形亮點狀，之后隨逐漸換液脫離培養(yǎng)瓶。貼壁細胞隨培養(yǎng)時間延長逐漸伸展，由圓形、類圓形逐漸伸展為短梭形或多角形，胞核居中，可見1-2個核仁(圖1a)。培養(yǎng)48 h時，多數(shù)ADSC胞體變?yōu)殚L梭形，呈類似于成纖維細胞樣形態(tài)。7-10 d左右細胞增殖速度加快，鏡下可見大量梭形細胞呈漩渦狀排列，細胞生長到14 d可達到90%融合。傳代后12 h內(nèi)細胞基本貼壁，24 h呈成纖維細胞樣形態(tài)。傳至第3-6代時，細胞形態(tài)基本均勻，呈長梭形(圖1b)，雜質細胞基本去除，此時細胞增生活躍，3-6天即可鋪滿整個瓶底。

2.2ADSC誘導過程中細胞形態(tài)學變化

誘導至5 h時，ADSC形態(tài)逐漸開始發(fā)生變化，胞體折光性逐漸增強，胞質以胞核為中心向內(nèi)回縮，ADSC的原始外部胞膜輪廓逐漸模糊。16 h左右細胞胞體折光性顯著增強，呈圓形或多邊形，胞漿回縮更為明顯。低倍鏡下可見細胞伸出多條突起，但高倍鏡下發(fā)現(xiàn)細胞這些突起為胞漿不均勻回縮所致，且某些細胞仍能看到ADSC細胞膜的原始外部輪廓(圖2a)。48 h，光鏡下可見典型的星形膠質細胞形態(tài)，即胞體圓形，伸出多條細長突起，部分一級突起伸出多條次級突起，胞核圓形，居中，可見到1-2個核仁，但部分細胞的突起末端分化不完全(圖2b)。此后至誘導后14 d，細胞形態(tài)基本保持不變(圖2c)。21 d時，胞體折光性減弱，呈三角形或不規(guī)則形，部分突起回縮，僅有2-3條較短突起。28 d時，大量細胞脫落、死亡。

圖a為原代培養(yǎng)3 d時細胞，貼壁細胞呈黑點狀；b為成人ADSC傳代至第3代3 d時，成纖維細胞樣形態(tài)，并呈旋渦狀生長。

圖1成人ADSC原代及傳代培養(yǎng)后倒置相差顯微鏡下的細胞形態(tài)變化特征

圖a箭頭所示為未分化完全細胞；圖b為誘導后48h細胞；圖c為誘導后14 d細胞。

2.3成人ADSC在誘導后的超微結構變化

透射電鏡下可見，經(jīng)化學誘導后的星形膠質細胞胞體基本呈圓形或橢圓形，表面有較多突起；核呈卵圓形(圖3a)，具有1-2個核仁，常染色質多，異染色質少；胞質中可見較多核糖體及溶酶體，有大量交錯排列的膠質原纖維(圖3b)。

2.4誘導后細胞GFAP、GDNF免疫熒光表達

未誘導ADSC無GFAP、GDNF及GFAP/GDNF共染色陽性細胞。誘導后開始出現(xiàn)GFAP、GDNF及GFAP/GDNF共染色陽性細胞，且GFAP、GDNF及GFAP/GDNF共染色陽性細胞百分比隨誘導時間延長逐漸升高，誘導7 d時GFAP/GDNF共染色陽性細胞百分比達到峰值(P<0.05)，誘導14 d時GFAP、GDNF染色陽性細胞百分比達到峰值(P<0.05)，之后逐漸下降。相同時間點比較，GFAP陽性細胞百分比>GDNF陽性細胞百分比>FAP/GDNF共染色陽性細胞百分比，P<0.05。見表1。

圖b箭頭所示為星形膠質細胞中的膠質原纖維結構。

圖(a1)-(e4)分別為未誘導組、誘導48h、7d、14d和21d組細胞GFAP、GDNF和GFAP/GDNF的表達結果。綠色為GFAP陽性表達部位，紅色為GDNF陽性表達部位，藍色細胞核，黃色為GFAP和GDNF陽性共表達部位。

圖4ADSC誘導后GFAP、GDNF免疫熒光表達

表1 誘導過程中各時間點細胞GFAP、GDNF及GFAP/GDNF共染色陽性細胞百分比

注：各組之間GFAP陽性率均有統(tǒng)計學差異(P<0.05)，各組之間GDNF陽性率均有統(tǒng)計學差異(P<0.05)，各組之間GFAP/GDNF共表達率均有統(tǒng)計學差異(P<0.05)。誘導48 h組的GFAP/GDNF共表達率小于該組的GFAP表達陽性率和GDNF表達陽性率，且均有統(tǒng)計學差異(P<0.05)；誘導7 d、14 d和21 d組的細胞同樣存在此種現(xiàn)象。

3 討論

以阿爾茨海默病(AD)和帕金森病(PD)為代表的神經(jīng)退行性疾病是目前嚴重影響人類生存和生活質量的一大類常見疾病。而神經(jīng)干細胞的發(fā)現(xiàn)打破了神經(jīng)元不能再生的傳統(tǒng)觀念。國內(nèi)外有研究者已將ADSC成功誘導分化為神經(jīng)元和星形膠質細胞等各種神經(jīng)細胞[8-14]。

星形膠質細胞是膠質細胞中數(shù)量最多、具有重要功能的細胞，可以通過分泌多種神經(jīng)因子來實現(xiàn)對神經(jīng)元的營養(yǎng)修復作用。星形膠質細胞分泌的神經(jīng)營養(yǎng)因子等活性物質在腦內(nèi)廣泛分布，對神經(jīng)細胞有一定的營養(yǎng)作用，在保護神經(jīng)細胞、促進軸突生長、神經(jīng)損傷修復和維持正常的腦功能中有重要意義。星形膠質細胞可分泌的多種神經(jīng)營養(yǎng)物質，包括膠質源性神經(jīng)營養(yǎng)因子(GDNF)、腦源性神經(jīng)營養(yǎng)因子(BDNF)、神經(jīng)生長因子(NGF)、睫狀神經(jīng)營養(yǎng)因子(CNTF)等。其中GDNF是眾多學者研究最多的神經(jīng)營養(yǎng)因子之一，該種神經(jīng)因子在中樞神經(jīng)系統(tǒng)中分布廣泛,在個體的整個發(fā)育期都有廣泛的表達。GDNF因來源于神經(jīng)膠質細胞，且最早由Lin等[15]從大鼠膠質細胞B49的條件培養(yǎng)液中分離出來，故被命名為膠質細胞源性神經(jīng)營養(yǎng)因子。有研究表明，GDNF可以促進骨髓基質干細胞向神經(jīng)細胞轉化，可以增強內(nèi)源性神經(jīng)干細胞增殖和分化[16,17]。我們的實驗研究發(fā)現(xiàn)，由ADSC誘導分化而來的星形膠質細胞隨誘導時間的延長，GFAP、GDNF及GFAP/GDNF共染色陽性細胞百分比逐漸升高，誘導7 d時GFAP/GDNF共染色陽性細胞百分比達到峰值，說明此時分化成功的星形膠質細胞最具功能代表性，同時不斷分泌GDNF，此后在相對于初始誘導劑的誘導環(huán)境中，GDNF的濃度明顯增高，我們推測這又間接促使ADSC向星形膠質細胞分化。誘導14 d時GFAP、GDNF染色陽性細胞百分比達到高峰，即在不斷新生星形膠質細胞的同時，GDNF也逐漸增高，二者互相影響，直至14 d后二者比例下降。但有報道顯示，GDNF可以部分抑制細胞周期蛋白，從而阻止細胞增生進程[18]，這是否是導致減少誘導14 d后星形膠質細胞數(shù)量的原因目前還不得而知。