張靜玲，王克利，閆雙寶

(1.北京科技大學(xué)醫(yī)院 內(nèi)科，北京100088；2.火箭軍總醫(yī)院 骨科，北京100088)

槲皮素(Quercetin)是一種具有多種生物活性的黃酮類化合物，廣泛存在于許多膳食植物(水果、蔬菜、谷物等)中，以中蕎麥、西紅柿、山碴、洋蔥中含量較高。許多中草藥如羅布麻、槐米、側(cè)柏葉、高良姜、款冬花、桑寄生、三七、銀杏等均含有槲皮素。張曉琳等[1]發(fā)現(xiàn)，50-200 μmol/L槲皮素在體外可劑量依賴地抑制神經(jīng)膠質(zhì)瘤細(xì)胞株，并具有神經(jīng)元保護(hù)作用。研究表明，口服槲皮素可明顯抑制大鼠、小鼠結(jié)直腸癌生長(zhǎng)，抑制其凋亡[2,3]。本研究旨在探討槲皮素抑制骨肉瘤細(xì)胞MG-63增殖及促進(jìn)其凋亡作用，為探討槲皮素抗腫瘤作用提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1骨肉瘤細(xì)胞株MG-63的培養(yǎng)

人骨肉瘤細(xì)胞株MG-63購(gòu)自武漢普諾賽生命科技有限公司。MG-63細(xì)胞用含10%胎牛血清的MEM培養(yǎng)液于37℃、5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，取處于對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期細(xì)胞用于實(shí)驗(yàn)研究。

1.2試劑與儀器

胎牛血清、MEM培養(yǎng)液及TRIzol為Gibco產(chǎn)品;MTT、DMSO及胰酶購(gòu)自北京鼎國(guó)科技有限公司;細(xì)胞凋亡檢測(cè)試劑盒為深圳碧云天公司產(chǎn)品;二步法RT-qPCR法檢測(cè)試劑盒、哺乳動(dòng)物總蛋白提取試劑盒、Bradford蛋白定量試劑盒均為北京全式金生物技術(shù)有限公司產(chǎn)品;抗人GAPDH、caspase 3及其前體抗體產(chǎn)自北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司;PVDF膜為美國(guó)Millipore公司產(chǎn)品;其他試劑均為進(jìn)口或國(guó)產(chǎn)分析純。

酶聯(lián)免疫檢測(cè)儀由美國(guó)MD公司生產(chǎn);流式細(xì)胞儀為美國(guó)BD公司產(chǎn)品;凝膠成像系統(tǒng)為上海天能產(chǎn)品。

1.3細(xì)胞增殖活力檢測(cè)

以MTT法檢測(cè)細(xì)胞增殖活力。將處于對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的MG-63以1×103/孔接種于96孔板，待細(xì)胞貼壁后，分別用常規(guī)培養(yǎng)液及含20、40和80 μmol/L槲皮素的MEM培養(yǎng)液200 μl處理24 h、48 h及72 h，加入20 μl MTT溶液，以150 μl DMSO溶解沉淀，以酶聯(lián)免疫檢測(cè)儀于OD490 nm處測(cè)量各孔的吸光值。根據(jù)各組細(xì)胞OD值計(jì)算藥物對(duì)細(xì)胞生長(zhǎng)的抑制率，實(shí)驗(yàn)設(shè)6個(gè)復(fù)孔并重復(fù)3次。

1.4流式細(xì)胞術(shù)(FCM)檢測(cè)細(xì)胞凋亡

處于對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的MG-63細(xì)胞以1×106接種于6孔板，分別以無(wú)血清MEM培養(yǎng)液及含40 μmol/L槲皮素的MEM無(wú)血清培養(yǎng)液培養(yǎng)48 h后，用0.25%胰蛋白酶溶液消化、70%乙醇固定，用Anexin V和PI對(duì)其進(jìn)行染色，用流式細(xì)胞術(shù)分析各組細(xì)胞凋亡情況。實(shí)驗(yàn)設(shè)3個(gè)復(fù)孔并重復(fù)3次。

1.5逆轉(zhuǎn)錄-定量聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(RT-qPCR)

以二步法RT-qPCR法檢測(cè)MG-63細(xì)胞caspase 3 mRNA的相對(duì)表達(dá)量。將處于對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的MG-63細(xì)胞按1.3分組培養(yǎng)，以TRIzol法按說明書提取MG-63細(xì)胞總RNA，進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄，然后以caspase 3特異性引物進(jìn)行PCR。以GAPDH做為內(nèi)參，按2-ΔΔCT計(jì)算caspase 3相對(duì)表達(dá)量。ΔΔCT=[Ct(槲皮素組caspase 3)-Ct(槲皮素組GAPDH)]-[Ct(對(duì)照組caspase 3)-Ct(對(duì)照組GAPDH)]。GAPDH引物序列為：5’-GTTACCAGGGCTGCCTTCTC-3’，5’-GATGGTGATGGGTTTCCCGT-3’;caspase 3引物序列為：5’-CGGAGCTTGGAACGCGA-3’，5’-ACACAAGCCCATTTCAGGGTA-3’。

1.6WesternBlot檢測(cè)

用Western Blot檢測(cè)各組MG-63細(xì)胞caspase 3及其前體表達(dá)情況。將處于對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的MG-63細(xì)胞按1.3分組培養(yǎng)后，按哺乳動(dòng)物總蛋白提取試劑盒說明書進(jìn)行MG-63細(xì)胞總蛋白提取，并用Bradford法進(jìn)行蛋白定量，取50 μg細(xì)胞總蛋白(20 μl)進(jìn)行SDS-PAGE電泳、轉(zhuǎn)膜后，以特異性caspase 3及其前體進(jìn)行Western Blot檢測(cè)，經(jīng)ECL發(fā)光后用凝膠成像系統(tǒng)檢測(cè)。以GAPDH做為內(nèi)參照，計(jì)算caspase 3及其前體的相對(duì)表達(dá)量。

1.7數(shù)據(jù)處理與分析

2 結(jié)果

2.1槲皮素對(duì)MG-63細(xì)胞增殖活力影響

不同濃度(0、20、40、80 μmol/L)槲皮素作用MG-63細(xì)胞一定時(shí)間(24、48、72 h)后，以MTT法分析各組細(xì)胞增殖能力，計(jì)算其抑制率，結(jié)果見表1，80 μmol/L槲皮素處理MG-63細(xì)胞24 h后，抑制率為76.2%±6.2%，明顯低于正常對(duì)照組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05);不同劑量槲皮素處理MG-63細(xì)胞48 h后，各劑量槲皮素處理組細(xì)胞抑制率均明顯低于正常對(duì)照組，且呈現(xiàn)明顯的劑量依賴性，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)；不同劑量槲皮素處理MG-63細(xì)胞72 h后，各劑量槲皮素處理組細(xì)胞抑制率均明顯低于正常對(duì)照組，且40 μmol/L和80 μmol/L槲皮素處理組抑制率明顯低于20 μmol/L槲皮素處理組(P<0.05)。

以上結(jié)果可見，MG-63細(xì)胞用槲皮素處理48 h后，槲皮素對(duì)其增殖活力呈現(xiàn)了較好的劑量依賴作用，而40 μmol/L處理MG-63 48 h時(shí)間，其抑制率為66.8%±8.6%，故以下研究將采用此濃度和處理時(shí)間進(jìn)行。

表1 不同濃度對(duì)MG-63細(xì)胞增殖抑制作用結(jié)果

與相同時(shí)間點(diǎn)對(duì)照組比較，*P<0.05;與相同時(shí)間點(diǎn)20 μmol/L槲皮素處理組比較，#P<0.05;與相同時(shí)間點(diǎn)40 μmol/L槲皮素處理組比較，ΔP<0.05。

2.2槲皮素對(duì)MG-63細(xì)胞凋亡影響

FCM檢測(cè)結(jié)果顯示，正常培養(yǎng)的MG-63細(xì)胞凋亡率為9.8%±0.7%，40 μmol/L槲皮素處理MG-63細(xì)胞48 h后，MG-63細(xì)胞凋亡率達(dá)46.2%±6.2%，明顯高于正常對(duì)照組，二者差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。

2.3槲皮素對(duì)MG-63細(xì)胞caspase3表達(dá)影響

RT-qPCR結(jié)果顯示，槲皮素處理后MG-63細(xì)胞caspase 3 mRNA相對(duì)表達(dá)量是對(duì)照組的1.5倍左右(1.50±0.18)，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。

Western blot結(jié)果顯示，槲皮素處理后，MG-63細(xì)胞caspase 3前體相對(duì)表達(dá)量為0.86±0.11，明顯高于常規(guī)培養(yǎng)的MG-63細(xì)胞，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05);對(duì)水解后的caspase 3，其在槲皮素處理后的MG-63細(xì)胞相對(duì)表達(dá)量亦明顯高于未處理組的MG-63細(xì)胞，二者差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05);進(jìn)一步分析結(jié)果顯示，在槲皮素處理后的MG-63細(xì)胞，caspase 3裂解比例(caspase 3cleaved-/pro-)亦明顯增加，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，見圖1,表2。

圖1 槲皮素對(duì)MG-63細(xì)胞caspase 3表達(dá)影響

表2 槲皮素對(duì)MG-63細(xì)胞caspase 3表達(dá)影響

與對(duì)照組比較，*P<0.05。

3 討論

槲皮素作為一種自然界天然存在的黃酮類化合物，具有抗炎、抗病毒、抗腫瘤、抗氧化、保護(hù)心血管、免疫抑制和維持血糖等穩(wěn)定強(qiáng)大的生物活性和廣泛的藥理作用，對(duì)感染，心血管疾病、糖尿病、腫瘤和自身免疫病等疾病的治療及預(yù)防具有重要的臨床意義[4]。研究表明，槲皮素可以通過多條信號(hào)通路影響腫瘤細(xì)胞的增殖、轉(zhuǎn)移、凋亡、代謝，對(duì)直結(jié)腸癌、胃癌、乳腺癌及白血病等多種腫瘤均有抑制作用[5]。本研究發(fā)現(xiàn)，20-80 μmol/L槲皮素均可抑制MG-63細(xì)胞的增殖活力，且在48 h時(shí)，槲皮素抑制MG-63細(xì)胞增殖活力作用具有明顯劑量依賴作用，細(xì)胞凋亡檢測(cè)結(jié)果顯示，40 μmol/L槲皮素可明顯促進(jìn)骨肉瘤細(xì)胞的凋亡，表明槲皮素具有促進(jìn)MG-63凋亡、抑制其增殖活力作用。

Caspase家族在介導(dǎo)細(xì)胞凋亡的過程中起著非常重要的作用，其中caspase-3為關(guān)鍵的執(zhí)行分子，參與多種因素誘導(dǎo)的細(xì)胞凋亡。正常組織中，Caspase 3以無(wú)活性的酶原形式存在，主要分布于胞漿內(nèi)，凋亡早期，Caspase 3即被激活，活化的Caspase-3由兩個(gè)大亞基(17 KD)和兩個(gè)小亞基(12 KD)組成，裂解相應(yīng)的胞漿胞核底物，最終導(dǎo)致細(xì)胞凋亡。本研究發(fā)現(xiàn)，槲皮素可刺激MG-63細(xì)胞Caspase 3的mRNA表達(dá)，同時(shí)，Western Blot分析結(jié)果顯示，槲皮素處理后，MG-63細(xì)胞caspase 3前體相對(duì)表達(dá)量明顯高于常規(guī)培養(yǎng)的MG-63細(xì)胞，而水解后的caspase 3相對(duì)表達(dá)量亦明顯高于常規(guī)培養(yǎng)的MG-63細(xì)胞，同時(shí)，caspase 3裂解比例(caspase 3cleaved-/pro-)明顯增加，表明刺激MG-63細(xì)胞轉(zhuǎn)錄和表達(dá)caspase 3，加速其裂解，槲皮素抑制MG-63細(xì)胞增殖活力作用可能與其激活caspase 3通路有關(guān)。