丁 軍，趙曉靜，虞楷銳，周天明，李慧霞，盛亞敏，陳宜陽(yáng)，劉寶元，孫亞妮，周恩民，趙 欽

(西北農(nóng)林科技大學(xué)動(dòng)物醫(yī)學(xué)院，農(nóng)業(yè)部獸用藥物與診斷技術(shù)陜西科學(xué)觀測(cè)實(shí)驗(yàn)站，楊凌 712100)

戊型肝炎(hepatitis E, HE)是由戊型肝炎病毒(hepatitis E virus, HEV)感染所致的一種人獸共患病，豬和野鹿可能是HEV的自然儲(chǔ)存宿主[1]。據(jù)世界衛(wèi)生組織2017年7月公布的數(shù)據(jù)，全球每年約有2 000萬(wàn)人感染HEV，其中約330萬(wàn)人出現(xiàn)戊肝癥狀，戊型肝炎在2015年造成的死亡約有4.4萬(wàn)例[2]。流行病學(xué)調(diào)查發(fā)現(xiàn)，我國(guó)多數(shù)省份有HE的暴發(fā)，且處于不斷上升的趨勢(shì)[3-4]，戊型肝炎感染已逐漸成為一個(gè)重要的公共衛(wèi)生問(wèn)題。

豬HEV是第一個(gè)動(dòng)物HEV分離株，隨著越來(lái)越多豬HEV分離株的鑒定，現(xiàn)已發(fā)現(xiàn)豬群中主要存在基因3和4型HEV[5-6]，而我國(guó)豬群中流行的HEV主要以基因4型為主[7]。HEV感染豬的臨床癥狀比較溫和，僅引起亞臨床感染，但是，由于其人畜共感染的特性，必須做好豬群中HEV感染的監(jiān)控。目前，豬HEV感染的診斷方法主要是病毒核酸的RT-PCR和血清中豬HEV抗體的ELISA檢測(cè)。但是RT-PCR技術(shù)操作復(fù)雜、成本高，容易污染，而ELISA以其簡(jiǎn)易和高通量的優(yōu)點(diǎn)被廣泛使用[8-10]。此外，目前并沒(méi)有任何商品化的豬HEV疫苗，因此，利用ELISA檢測(cè)豬HEV抗體可以監(jiān)測(cè)豬群中豬HEV感染情況。但是，目前市面上幾種商品化的豬HEV ELISA試劑盒，一類(lèi)使用檢測(cè)人血清中HEV抗體的商品化ELISA試劑盒檢測(cè)豬血清中豬HEV抗體，導(dǎo)致檢測(cè)結(jié)果難以判定；還有一類(lèi)分別采用豬HEV衣殼蛋白不同的抗原肽作為包被抗原，導(dǎo)致不同商品化試劑盒的檢測(cè)結(jié)果符合率較低[11]。因此，急需建立一種準(zhǔn)確性、敏感性和特異性較高的ELISA方法，為豬群中HEV感染的監(jiān)控提供技術(shù)支撐。

本研究以原核表達(dá)并純化的不含有任何標(biāo)簽的豬HEV衣殼蛋白C端268個(gè)氨基酸為包被抗原，通過(guò)優(yōu)化ELISA條件，并評(píng)價(jià)其應(yīng)用性，建立了敏感性和特異性較高的豬HEV抗體間接ELISA檢測(cè)方法。

1 材料與方法

1.1 病毒株和血清

基因4型豬源HEV CHN-SD-sHEV株分離自山東某屠宰場(chǎng)，GenBank登錄號(hào)為KF176351。豬HEV陽(yáng)性血清由本實(shí)驗(yàn)室通過(guò)CHN-SD-sHEV株感染HEV陰性豬制備；91份陰性血清采自HEV RNA和抗體均為陰性的豬；豬繁殖與呼吸綜合征病毒、豬偽狂犬病病毒、豬流行性腹瀉病毒、豬流感病毒和豬細(xì)小病毒的陽(yáng)性血清均由本實(shí)驗(yàn)室從臨床樣品獲得；45份豬HEV感染豬后連續(xù)不同周齡血清也由本實(shí)驗(yàn)室通過(guò)CHN-SD-sHEV感染陰性豬制備；477份臨床豬血清采自陜西省不同地區(qū)的商品化豬場(chǎng)。

1.2 主要試劑

分子生物學(xué)相關(guān)試劑購(gòu)自北京全式金生物技術(shù)有限公司；HRP標(biāo)記的羊抗豬IgG抗體購(gòu)自Sigma公司；TMB顯色液購(gòu)自天根生化科技(北京)有限公司；蛋白定量試劑盒購(gòu)自碧云天生物技術(shù)研究所；三種豬HEV抗體檢測(cè)商品化試劑盒分別購(gòu)自北京萬(wàn)泰生物藥業(yè)、南京森貝伽和上海酶聯(lián)生物科技有限公司。

1.3 包被抗原的制備

1.3.1 豬HEV衣殼蛋白C端268個(gè)氨基酸在大腸桿菌中的原核表達(dá) 利用RT-PCR方法擴(kuò)增編碼豬HEV衣殼蛋白C端268個(gè)氨基酸區(qū)域的核酸序列，然后利用NdeⅠ和XhoⅠ雙酶切、T4連接酶連接至原核表達(dá)載體pET-21b(+)，構(gòu)建重組表達(dá)質(zhì)粒pET-21b-sHEV-ORF2-C。將重組表達(dá)質(zhì)粒轉(zhuǎn)化大腸桿菌BL21(DE3)，IPTG誘導(dǎo)表達(dá)，蛋白命名sHEV-ORF2-C。SDS-PAGE分析蛋白是否表達(dá)。

1.3.2 表達(dá)蛋白的復(fù)性和純化 將超聲裂解后8 mol·L-1尿素溶解的目的蛋白置于透析袋中，將透析袋放入裝有20倍以上蛋白樣品體積的復(fù)性液PBS(pH 7.4)溶液的燒杯中，在4 ℃下，用磁力攪拌器中速地?cái)嚢鑿?fù)性液，以加速溶液的滲透和擴(kuò)散。每隔2～3 h換1次等量新鮮的復(fù)性液，重復(fù)4次。收集復(fù)性后的樣品，經(jīng)4 ℃ 12 000 r·min-1離心10 min， 上清即為目的蛋白的復(fù)性液。

利用AKTA Pure 25蛋白自動(dòng)純化系統(tǒng)和Superdex 200 increase凝膠過(guò)濾柱對(duì)復(fù)性獲得的蛋白進(jìn)行純化，SDS-PAGE分析蛋白純化效果。

1.3.3 表達(dá)蛋白抗原性分析 將重組載體、空載體的大腸桿菌表達(dá)產(chǎn)物，以及純化的蛋白同時(shí)進(jìn)行SDS-PAGE電泳,然后將蛋白質(zhì)濕轉(zhuǎn)，轉(zhuǎn)移至PVDF膜上，利用豬HEV陽(yáng)性血清為一抗，Western blot分析表達(dá)純化的sHEV-ORF2-C蛋白的反應(yīng)原性。

1.4 間接ELISA檢測(cè)方法的建立

1.4.1 間接ELISA方法操作步驟 將復(fù)性、純化的蛋白sHEV-ORF2-C用包被緩沖液稀釋后，包被酶標(biāo)板，每孔100 μL，4 ℃過(guò)夜。棄去包被液，PBST洗滌3次，加入封閉液，每孔200 μL，室溫封閉1 h。PBST洗滌后，分別加入含有10%大腸桿菌裂解液的封閉液稀釋的待檢血清以及豬HEV陽(yáng)性和陰性血清，每孔100 μL，室溫孵育1 h。PBST洗滌后加入辣根過(guò)氧化物酶標(biāo)記羊抗豬IgG，每孔100 μL，室溫孵育1 h。PBST洗滌后加入TMB顯色液，室溫顯色15 min，最后加入3 mol·L-1H2SO4終止液終止反應(yīng)，酶標(biāo)儀測(cè)定OD450 nm值。

1.4.2 最佳ELISA工作條件的確定 采用方陣滴定法確定包被抗原的最佳包被濃度，以及陰性、陽(yáng)性豬血清的最佳稀釋比例，從而確定待檢血清的最佳稀釋比例。通過(guò)優(yōu)化包被緩沖液、最佳封閉液以及最佳二抗工作濃度，最終確定ELISA的最優(yōu)工作條件。

1.4.3 臨界值的確定 取91份豬HEV陰性血清，在已確定的優(yōu)化條件下進(jìn)行ELISA檢測(cè)，經(jīng)統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，得到所有陰性血清的OD450 nm的平均值和標(biāo)準(zhǔn)差。根據(jù)統(tǒng)計(jì)學(xué)原則，ELISA的陰、陽(yáng)性判定值(Cut-off)=所有陽(yáng)性血清OD450 nm平均值+3×標(biāo)準(zhǔn)差。待檢血清OD450 nm值≥ Cut-off值判定為陽(yáng)性，OD450 nm< Cut-off值判定為陰性。

1.5 特異性試驗(yàn)

分別將豬繁殖與呼吸綜合征病毒、豬偽狂犬病病毒、豬流行性腹瀉病毒、豬流感病毒和豬細(xì)小病毒的陽(yáng)性血清按照已建立的ELISA方法進(jìn)行檢測(cè)，同時(shí)設(shè)立豬HEV陰性和陽(yáng)性血清對(duì)照，分析其他重要豬疫病陽(yáng)性血清是否與包被的抗原發(fā)生反應(yīng)。

1.6 敏感性試驗(yàn)

將豬HEV陽(yáng)性血清按照1∶100、1∶200、1∶400、1∶800、1∶1 600、1∶3 200、1∶6 400和1∶12 800稀釋后，用該ELISA檢測(cè)，根據(jù)Cut-off值分析該ELISA的敏感性。

1.7 重復(fù)性試驗(yàn)

板內(nèi)重復(fù)性試驗(yàn)：利用純化的蛋白包被ELISA板，分別隨機(jī)選取4份豬HEV陽(yáng)性和陰性血清，每份樣品設(shè)立3個(gè)重復(fù)孔，按優(yōu)化條件進(jìn)行ELISA操作，計(jì)算同一份樣品OD450 nm值的變異系數(shù)(CV%)，以檢驗(yàn)板內(nèi)檢測(cè)樣品的重復(fù)性。

板間重復(fù)性試驗(yàn)：取三塊酶標(biāo)板，以同一批制備的蛋白包被，同樣利用上述選取的4份豬HEV陽(yáng)性和陰性血清，按優(yōu)化條件進(jìn)行ELISA檢測(cè)，計(jì)算板間相同樣品OD450 nm值的變異系數(shù)(CV%)，以檢驗(yàn)板間檢測(cè)樣品的重復(fù)性。

1.8 對(duì)比試驗(yàn)

利用建立的ELISA方法與萬(wàn)泰HEV抗體檢測(cè)試劑盒、南京森貝咖和上海酶聯(lián)豬HEV抗體檢測(cè)試劑盒同時(shí)對(duì)臨床收集的182份豬血清進(jìn)行檢測(cè)，對(duì)比試驗(yàn)結(jié)果，分析本研究建立的ELISA方法與上述三種商品化試劑盒的符合率。

1.9 臨床應(yīng)用

運(yùn)用建立的ELISA方法，對(duì)實(shí)驗(yàn)室保存的豬HEV感染不同周(0～8周)的45份血清和陜西楊凌區(qū)周邊不同集約化養(yǎng)豬場(chǎng)的477份豬血清進(jìn)行檢測(cè)。

2 結(jié) 果

2.1 SDS-PAGE和Western blot分析蛋白的表達(dá)和純化

將重組表達(dá)質(zhì)粒pET-21b-sHEV-ORF2-C和空載體pET-21b轉(zhuǎn)化至大腸桿菌BL21(DE3)中，IPTG誘導(dǎo)表達(dá)后，SDS-PAGE分析sHEV-ORF2-C蛋白獲得表達(dá)，大小約為40 ku(圖1A)。超聲波裂解菌液，蛋白主要以包涵體的形式存在。通過(guò)蛋白復(fù)性以及分子篩純化后，獲得比較純的目的蛋白。利用豬HEV陽(yáng)性豬血清分析表達(dá)蛋白的抗原性，Western blot結(jié)果證明表達(dá)的蛋白反應(yīng)原性較好(圖1B)。

M.預(yù)染蛋白質(zhì)相對(duì)分子質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)；1. pET-21b(+)空載體誘導(dǎo)表達(dá)；2. 重組質(zhì)粒pET-21b-sHEV-ORF2-C誘導(dǎo)表達(dá)；3. 分子篩純化的目的蛋白；4. 未純化目的蛋白與陽(yáng)性豬血清免疫印跡；5. 純化目的蛋白與陽(yáng)性豬血清免疫印跡M. Prestained protein marker; 1.pET-21b(+) blank vector; 2. Recombinant plasmid pET-21b-sHEV-ORF2-C; 3. Purified protein; 4. Unpurified protein reacting with the positive pig sera; 5. Purified protein reacting with the positive pig sera圖1 SDS-PAGE(A)和Western blot(B)鑒定目的蛋白的表達(dá)Fig.1 Identification of the target protein by SDS-PAGE (A) and Western blot (B)

2.2 抗原最佳包被濃度和血清最佳稀釋度的確定

棋盤(pán)滴定法檢測(cè)結(jié)果顯示，當(dāng)酶標(biāo)板每孔包被抗原200 ng，血清稀釋度為1∶200時(shí)，陽(yáng)性血清OD450 nm值為2.865，陰性血清相應(yīng)值為0.059，陽(yáng)性和陰性血清OD450 nm值相差最大(P/N=48.56)。因此，200 ng為最佳的抗原包被量，1∶200為最佳血清稀釋度(表1)。

2.3 最佳包被緩沖液和封閉液的確定

將純化的抗原分別用0.01 mol·L-1的碳酸鹽緩沖液(pH 9.6)和0.01 mol·L-1的磷酸鹽緩沖液(pH 7.4)包被酶標(biāo)板，4 ℃過(guò)夜。然后再分別用2.5% 脫脂奶粉和5%脫脂奶粉作為封閉液，室溫孵育1 h，其他步驟按照優(yōu)化的ELISA條件檢測(cè)陽(yáng)性和陰性血清。結(jié)果顯示當(dāng)用0.01 mol·L-1的碳酸鹽緩沖液包被，2.5%脫脂奶粉封閉時(shí)，陽(yáng)性血清的OD450 nm值可達(dá)2.145，陰性血清相應(yīng)值為0.054，且此時(shí)陽(yáng)性和陰性血清的OD450 nm值相差最大(P/N=39.85)，因此選擇0.01 mol·L-1碳酸鹽緩沖液作為包被緩沖液，2.5%的脫脂奶粉為封閉液(表2)。

表1間接ELISA最佳抗原包被量和血清最佳稀釋倍數(shù)的確定(OD450 nm)

Table1Determinationofoptimalamountofcoatingantigenanddilutionofsera(OD450 nm)

血清稀釋倍數(shù)Serum dilution包被抗原量/(ng·孔-1)Antigen amount501002004001∶50+1.4681.5681.6321.712-0.0980.0980.0950.098P/N15.0616.0017.1817.381∶100+1.5031.7151.9221.889-0.0790.0670.0670.068P/N19.0325.6028.6927.931∶200+1.8302.0752.8652.124-0.0580.0540.0590.052P/N31.5538.4348.5640.801∶400+1.5411.6981.8131.676-0.0460.0430.0420.043P/N33.1439.4942.6638.98

P/N值系用未修約實(shí)測(cè)值計(jì)算，下表同

P/Nvalue were calculated using the data before rounding off. The same as below

表2最佳包被緩沖液和封閉液的確定(OD450 nm)

Table2Determinationofoptimalcoatingandblockingbuffers(OD450 nm)

包被液Coating buffer封閉液Blocking buffer2.5%脫脂奶粉2.5% dry milk5%脫脂奶粉5% dry milk碳酸鹽緩沖液+2.1451.867Carbonate buffer-0.0540.057P/N39.8532.75磷酸鹽緩沖液+1.5431.378PBS buffer-0.0670.067P/N23.0020.56

2.4 酶標(biāo)二抗最佳工作濃度的確定

將商品化HRP標(biāo)記的羊抗豬二抗，按照說(shuō)明書(shū)分別選取1∶5 000和1∶10 000稀釋?zhuān)肊LISA檢測(cè)陽(yáng)性和陰性豬血清，結(jié)果(表3)顯示當(dāng)二抗稀釋比例為1∶5 000時(shí)，陽(yáng)性和陰性血清OD450 nm值相差最大(P/N=55.87)。因此，HRP標(biāo)記的羊抗豬二抗最佳稀釋比例為1∶5 000。

表3酶標(biāo)二抗最佳稀釋比例的確定(OD450 nm)

Table3Determinationofoptimaldilutionofsecondantibody(OD450 nm)

二抗稀釋倍數(shù)Second antibodies dilution陽(yáng)性Positive陰性NegativeP/N1∶5 0002.9050.05255.871∶10 0002.1190.04745.09

2.5 臨界值的確定

對(duì)91份豬HEV陰性豬血清進(jìn)行ELISA檢測(cè)，OD450 nm值的平均值為0.104，標(biāo)準(zhǔn)差為0.064。根據(jù)公式算得Cut-off值為0.296，即待檢血清OD450 nm值≥0.296時(shí)判定為陽(yáng)性，OD450 nm值<0.296時(shí)則判定為陰性。

2.6 特異性試驗(yàn)

用建立的ELISA方法對(duì)豬繁殖與呼吸綜合征病毒、豬偽狂犬病病毒、豬流行性腹瀉病毒、豬流感病毒和豬細(xì)小病毒的陽(yáng)性血清以及豬HEV的陰性和陽(yáng)性血清進(jìn)行檢測(cè)，其OD450 nm值分別為0.063、0.076、 0.059、0.092、0.067、0.051和2.204。其他病毒的陽(yáng)性血清和豬HEV陰性血清的OD450 nm值均< 0.296，表明建立的ELISA特異性好。

2.7 敏感性試驗(yàn)

將豬HEV陽(yáng)性血清分別進(jìn)行1∶100～1∶12 800 倍比稀釋?zhuān)缓笥媒⒌腅LISA進(jìn)行檢測(cè)，結(jié)果顯示，當(dāng)陽(yáng)性血清1∶6 400稀釋時(shí)，其OD450 nm值仍大于0.296，而1∶12 800稀釋時(shí)，OD450 nm值小于0.296(表4)。

表4間接ELISA敏感性試驗(yàn)結(jié)果(OD450 nm)

Table4SensitivityofthedevelopedindirectELISA(OD450 nm)

血清稀釋倍數(shù)Serum dilution陽(yáng)性血清Positive serum陰性血清Negative serum1∶1002.0810.208 71∶2002.2010.163 41∶4002.0120.121 21∶8001.8360.094 31∶1 6001.2450.079 81∶3 2000.6840.045 61∶6 4000.3470.042 31∶12 8000.0920.032 1

2.8 重復(fù)性試驗(yàn)

板內(nèi)重復(fù)試驗(yàn)是將8份不同豬血清(4份陽(yáng)性和4份陰性血清)，在同一塊酶標(biāo)板上各重復(fù)檢測(cè)3次，計(jì)算標(biāo)準(zhǔn)差。結(jié)果板內(nèi)重復(fù)試驗(yàn)變異系數(shù)最大為7.05%，最小為0.09%，表明同一樣品在同一板內(nèi)檢測(cè)變異系數(shù)很小，重復(fù)性好(表5)。

板間重復(fù)試驗(yàn)是將8份不同的豬血清同時(shí)在3塊酶標(biāo)板上檢測(cè)，每塊板重復(fù)檢測(cè)3次，計(jì)算標(biāo)準(zhǔn)差。結(jié)果顯示每份血清在不同板之間OD450 nm值相差甚微，板間變異系數(shù)最大為7.68%，最小為1.22%，表明同一份樣品在不同酶標(biāo)板之間變異系數(shù)也很小，重復(fù)性好(表5)。

2.9 與商品化試劑盒符合率試驗(yàn)

用本研究建立的ELISA方法和北京萬(wàn)泰、南京森貝咖和上海酶聯(lián)三種商品化豬HEV抗體檢測(cè)試劑盒同時(shí)檢測(cè)182份臨床豬血清，結(jié)果表明建立的ELISA檢測(cè)陽(yáng)性93份，陰性89份；北京萬(wàn)泰商品化試劑盒檢測(cè)陽(yáng)性77份，陰性105份；上海酶聯(lián)商品化試劑盒檢測(cè)陽(yáng)性47份，陰性135份；南京森貝咖商品化試劑盒檢測(cè)陽(yáng)性僅11份，陰性171份。該ELISA方法與三種商品化試劑盒的符合率分別為91.2%、53.3%和51.6%(表6)。

表5間接ELISA板內(nèi)和板間重復(fù)試驗(yàn)結(jié)果

Table5ReproducibilityanalysisofthedevelopedindirectELISA

豬血清編號(hào)Serum No.板內(nèi)變異試驗(yàn)Inter-assay variability板間變異試驗(yàn)Intra-assay variability平均值x-標(biāo)準(zhǔn)差s變異系數(shù)/%CV平均值x-標(biāo)準(zhǔn)差s變異系數(shù)/%CV12.3280.0381.622.3370.0964.1222.1710.0793.562.1600.0743.4232.1120.0914.292.0850.0572.7342.3130.0552.402.2710.0662.9050.0570.0047.050.0590.0032.7860.0710.0023.240.0730.0011.9070.0640.0010.090.0650.0057.6880.0690.0072.340.0690.0011.22

表6間接ELISA與三種商品化試劑盒對(duì)比試驗(yàn)結(jié)果

Table6ComparisonsofthedevelopedindirectELISAwiththethreecommercialkitsfordetectinganti-swineHEVantibodiesinpigsera

檢測(cè)方法Detection methods陽(yáng)性Positive陽(yáng)性符合率/%Positive coincidence陰性Negative陰性符合率/%Negative coincidence總符合率/%Total coincidenceELISA9389北京萬(wàn)泰試劑盒7782.810510091.2上海酶聯(lián)試劑盒4729.013578.753.3南京森貝咖試劑盒118.617196.651.6

2.10 臨床樣品檢測(cè)

應(yīng)用建立的ELISA檢測(cè)豬HEV感染5頭HEV陰性豬后不同周的血清，結(jié)果顯示，感染后第2周，所有豬開(kāi)始HEV抗體轉(zhuǎn)陽(yáng)，其中2頭感染后第7周抗體轉(zhuǎn)陰，而其余3頭豬感染后第8周，ELISA檢測(cè)結(jié)果仍呈陽(yáng)性(圖2)。應(yīng)用建立的ELISA檢測(cè)楊凌周邊10個(gè)集約化豬場(chǎng)共477份血清，檢測(cè)結(jié)果顯示8個(gè)豬場(chǎng)為豬HEV抗體陽(yáng)性，477份血清中210份為陽(yáng)性，陽(yáng)性率為44.03%。不同豬場(chǎng)的檢測(cè)結(jié)果見(jiàn)表7。

3 討 論

戊型肝炎是人畜共患疾病，近幾年發(fā)病率逐年升高，嚴(yán)重危害人類(lèi)健康。豬、野鹿和兔是HEV的自然儲(chǔ)存宿主[1]。1997年Meng等[5]首次從豬體內(nèi)分離獲得豬HEV，并發(fā)現(xiàn)豬HEV可以感染人。因此，密切監(jiān)控豬群中HEV感染具有重要的公共衛(wèi)生意義。目前，對(duì)豬HEV的檢測(cè)技術(shù)主要包括免疫電鏡、巢式RT-PCR和ELISA[12]。其中，ELISA檢測(cè)快速且方便，被廣泛應(yīng)用[10]，但是目前豬HEV抗體檢測(cè)的ELISA方法，一類(lèi)是利用人HEV抗體檢測(cè)的商品化試劑盒通過(guò)二抗(由抗人變?yōu)榭关i)的改變進(jìn)行檢測(cè)，ELISA條件需要重新優(yōu)化，導(dǎo)致結(jié)果難以判定；還有一類(lèi)商品化試劑盒分別采用豬HEV ORF2和ORF3蛋白的不同抗原肽為包被抗原，由于不同抗原肽引發(fā)豬免疫應(yīng)答反應(yīng)的差異性，導(dǎo)致該類(lèi)試劑盒檢測(cè)結(jié)果的符合率差。因此，急需建立一種準(zhǔn)確性、敏感性和特異性較高的ELISA方法。本研究利用原核表達(dá)的豬HEV ORF2蛋白C端268個(gè)氨基酸區(qū)域?yàn)榘豢乖?，通過(guò)優(yōu)化ELISA條件，并分析方法的敏感性和特異性，成功建立了豬HEV抗體檢測(cè)的間接ELISA方法。同時(shí)，利用該方法檢測(cè)豬HEV感染后不同時(shí)間以及臨床收集的豬血清，結(jié)果表明該ELISA方法可以用于豬群中HEV感染的監(jiān)測(cè)。

圖2 間接ELISA檢測(cè)豬HEV攻毒后豬血清中抗體變化規(guī)律Fig.2 Detection of anti-swine HEV IgG antibodies in sera from the challenged pigs by the indirect ELISA

表7間接ELISA檢測(cè)臨床豬血清中豬HEV抗體結(jié)果

Table7Detectionofanti-swineHEVIgGantibodiesintheclinicalpigserafromdifferentflocksbytheindirectELISA

豬場(chǎng)Pig farm樣品總數(shù)Total number陽(yáng)性樣品數(shù)Positive number陽(yáng)性率/%Positive rate畢公482450.00本原483777.08實(shí)訓(xùn)483266.67金鳳483062.50李家481531.25延川4800鳳翔484593.75黃陵45511.11五泉4800姚安482245.83

不同哺乳動(dòng)物HEV分離株主要分為8個(gè)基因型[13]，基因3和4型可感染豬，我國(guó)豬群中主要流行基因4型[6-7]。不同HEV基因型僅有一個(gè)血清型，因此，不同基因型的ORF2蛋白均可以用于檢測(cè)豬血清中的HEV抗體，但也有研究表明不同基因型的ORF2蛋白檢測(cè)的結(jié)果會(huì)有部分差異[11]。我們建立的ELISA方法與北京萬(wàn)泰商品化試劑盒符合率為91.2%，而北京萬(wàn)泰試劑盒是采用基因1型HEV ORF2蛋白為包被抗原，因此，部分不符合的樣品可能是由于不同基因型抗原差異所導(dǎo)致，進(jìn)一步證實(shí)了上述推論。因此，本研究利用我國(guó)豬群中流行的基因4型豬HEV ORF2蛋白為包被抗原，進(jìn)一步提高了豬HEV抗體檢測(cè)的特異性和敏感性。

豬HEV全長(zhǎng)ORF2蛋白包含多個(gè)抗原區(qū)，不同抗原區(qū)刺激機(jī)體免疫應(yīng)答反應(yīng)差異顯著，從而導(dǎo)致利用不同截短的ORF2蛋白為抗原建立的ELISA，相互之間檢測(cè)結(jié)果符合率低[14-16]。本研究建立的ELISA與北京萬(wàn)泰商品化試劑盒符合率較高,為91.2%，而與上海酶聯(lián)和南京森貝咖的商品化試劑盒符合率僅為53.3%和51.6%，查閱試劑盒說(shuō)明書(shū)，發(fā)現(xiàn)北京萬(wàn)泰商品化試劑盒采用的包被抗原為原核表達(dá)的病毒樣顆粒，與本研究所用的抗原相似，故符合率較高，其部分差異可能是由于不同基因型所致；而上海酶聯(lián)試劑盒所用抗原為缺失aa 368-392抗原區(qū)的截短O(píng)RF2蛋白，南京森貝咖的則同時(shí)還缺失了aa 606-660抗原區(qū)。前期研究發(fā)現(xiàn)，上述兩個(gè)抗原區(qū)是HEV主要的顯性抗原區(qū)，刺激機(jī)體產(chǎn)生抗體時(shí)間早、持續(xù)期長(zhǎng)[17]。因此，該兩種試劑盒檢測(cè)豬血清中HEV抗體可能存在大量假陰性。本研究建立的ELISA方法所用的抗原包含了上述兩個(gè)主要顯性抗原區(qū)，從而大大提高了檢測(cè)的精確性。

ELISA方法檢測(cè)抗體所用的包被抗原，一方面可以采用天然病毒顆?；虿《緛唵挝坏鞍?，另一方面可以采用基因工程技術(shù)體外表達(dá)的病毒亞單位蛋白。為便于純化，通常將標(biāo)簽蛋白與目的蛋白進(jìn)行融合表達(dá)，但是由于標(biāo)簽蛋白的抗原性，易造成假陽(yáng)性。前期，我們將豬HEV ORF2蛋白C端268個(gè)氨基酸與His標(biāo)簽進(jìn)行融合表達(dá)，結(jié)果發(fā)現(xiàn)表達(dá)蛋白發(fā)生多聚化，His標(biāo)簽包裝至多聚體內(nèi)部，導(dǎo)致純化蛋白純度不高。隨后利用該融合蛋白建立的豬HEV抗體間接ELISA檢測(cè)方法，檢測(cè)結(jié)果假陽(yáng)性比例高。本研究基于上述問(wèn)題，重新設(shè)計(jì)引物構(gòu)建表達(dá)載體，僅表達(dá)豬HEV ORF2蛋白268個(gè)氨基酸區(qū)域，不帶任何標(biāo)簽，然后通過(guò)蛋白復(fù)性和分子篩純化后，獲得了純度非常高的抗原，成功解決了上述問(wèn)題。已有的血清學(xué)調(diào)查發(fā)現(xiàn)，豬HEV感染在我國(guó)不同地區(qū)的豬群中非常普遍，陽(yáng)性率在30%～100%[18-21]。本研究利用建立的間接ELISA調(diào)查陜西楊凌周邊養(yǎng)豬場(chǎng)豬HEV感染情況發(fā)現(xiàn)，各豬場(chǎng)陽(yáng)性率為0%～93.75%。由于豬HEV的人畜共感染性，所以，需定期監(jiān)控上述豬場(chǎng)中豬HEV感染情況，及時(shí)制定預(yù)防措施，減少對(duì)人傳播的可能。

4 結(jié) 論

利用原核表達(dá)純化的基因4型豬HEV衣殼蛋白為包被抗原，通過(guò)優(yōu)化ELISA條件，以及與商品化豬HEV抗體檢測(cè)試劑盒比較，成功建立豬HEV抗體間接ELISA檢測(cè)方法，該方法具有較好的敏感性和特異性，準(zhǔn)確率較高，適用于臨床血清樣品豬HEV抗體的檢測(cè)和豬HEV感染血清流行病學(xué)的調(diào)查。