黃艷艷，李 悅,2，張 琳，王進圣，吳福杰，吳家強*，劉思當

(1.山東省農(nóng)業(yè)科學院畜牧獸醫(yī)研究所，山東省畜禽疫病防治與繁育重點實驗室，濟南 250100； 2.山東農(nóng)業(yè)大學動物科技學院，泰安 271018； 3.山東鳳祥股份有限公司，陽谷 252300)

禽流感病毒(avian influenza virus，AIV)可導致家禽和野鳥的禽流感[1-3]。據(jù)病毒兩種表面糖蛋白——血凝素(hemaglutinin，HA)和神經(jīng)氨酸酶(neuraminidase, NA)抗原性的不同，將禽源AIVs劃分為16種HA亞型和9種NA亞型。已知的HA和NA亞型均可在野鳥中分離到，因此普遍認為野鳥是AIVs的天然宿主[4-5]。AIVs基因組由8個 獨立的基因片段(PB2、PB1、PA、HA、NP、NA、M和NS)組成，病毒主要通過點突變和基因重組的方式發(fā)生變異，導致抗原漂移和抗原轉換[6-8]。

我國于1994年首次在廣東發(fā)病雞群中分離到H9N2亞型AIV[9]。該亞型AIV致病性低，早期感染易被忽視，在雞群中持續(xù)流行和傳播，成為國內(nèi)家禽的主要AIV流行亞型。該亞型病毒感染可引起雞呼吸道炎癥、免疫力下降和生產(chǎn)性能降低。感染雞群易并發(fā)或繼發(fā)其他疾病(如雞傳染性支氣管炎和慢性呼吸道病)，導致發(fā)病率和死亡率大幅增加。國內(nèi)預防家禽H9N2亞型禽流感的主要手段是疫苗免疫。血凝素蛋白是AIV重要的免疫保護性抗原，在疫苗免疫后雞體能夠產(chǎn)生相應抗體，因此生產(chǎn)中普遍通過血凝抑制試驗(hemagglutination inhibitation test，HI)檢測雞血清抗體水平，評價疫苗免疫效果。

系統(tǒng)進化分析發(fā)現(xiàn)，我國H9N2亞型AIV各基因隸屬于多個亞系，包括A/chicken/Shanghai/F/98-like亞系、A/Quail/HongKong/G1/97-like亞系、A/Duck/HongKong/Y280/97-like亞系和A/duck/HongKong/Y439/97-like亞系(表1，B～E)[10-11]。病毒8個基因片段重排頻繁，導致病毒基因型眾多[10, 12]。但是，自2010年以來G57基因型成為主要流行基因型。該基因型毒株最早于2007年分離自江蘇和江西的雞群， 2009年起迅速傳播開來[13]。本研究對2017年新分離自山東的6株雞源H9N2亞型AIVs進行了系統(tǒng)進化、分子特征和抗原性差異分析，旨在明確病毒的系統(tǒng)進化狀態(tài)和抗原變異情況。

1 材料與方法

1.1 病毒、抗原和雞胚

6株H9N2亞型AIV毒株(表1)由本課題組分離、鑒定和保存。病毒于2017年2-4月分離自山東省聊城市一個發(fā)病肉雞場，分離方法如下。病料采集后經(jīng)研磨、離心、濾膜過濾和雙抗處理后接種9～11 日齡的SPF雞胚。雞胚培養(yǎng)96 h后收獲尿囊液，HA和HI試驗驗證病毒為H9亞型AIVs，擴增HA和NA基因并測序，鑒定為H9N2亞型。將病毒保存于-80 ℃冰柜備用。血凝抑制試驗用H9抗原來自疫苗生產(chǎn)用滅活抗原，由某疫苗公司提供；9～11日齡SPF雞胚，購自山東省農(nóng)業(yè)科學院家禽研究所SPF雞研究中心。

1.2 主要試劑

Trizol為Invitrogen公司產(chǎn)品；PrimeScript One Step RT-PCR Kit為TaKaRa公司產(chǎn)品；PCR產(chǎn)物純化試劑盒、膠回收試劑盒和質(zhì)粒提取試劑盒購自Qiagen公司；pUC57載體、DH5α感受態(tài)細胞購自上海生物工程有限公司(Sangon)；IPTG (異丙基硫代-β-半乳糖苷)、X-gal (5-嗅-4-氯-3-吲哚-β-D-半乳糖苷)和氨芐青霉素購自寶生物工程(大連)有限公司；胰蛋白胨、酵母提取物和瓊脂粉購自OXOID公司；其他試劑均為國產(chǎn)分析純。

1.3 RNA提取和RT-PCR

應用Trizol法提取含毒尿囊液的總RNA，溶解于20 μL的TE緩沖液中。以RNA為模板，分別使用病毒8個基因片段的特異引物[14]進行RT-PCR。采用25 μL反應體系：RNase Free dH2O 5.5 μL，10×Buffer 12.5 μL，Prime Script RTase 0.5 μL，F(xiàn)orward Primer 0.75 μL，Reverse Primer 0.75 μL RNA樣品 5 μL。循環(huán)參數(shù)：50 ℃反轉錄 30 min；94 ℃預變性 5 min；94 ℃ 45 s，53 ℃ 45 s，72 ℃ 1.5 min擴增35個循環(huán)；最后72 ℃延伸10 min結束反應。

1.4 擴增產(chǎn)物的純化、克隆和測序

取3 μL擴增產(chǎn)物進行1%瓊脂糖凝膠電泳，若電泳影像為單一目的大小的條帶，則采用PCR產(chǎn)物純化試劑盒回收和純化擴增產(chǎn)物；若電泳影像為包含目的片段的非單一條帶，則凝膠回收目的條帶，使用凝膠回收試劑盒純化目的基因。將純化的基因與pUC57載體連接，轉化大腸桿菌DH5α感受態(tài)細胞，進行細菌培養(yǎng)并提取質(zhì)粒。通過菌液PCR方法初步鑒定陽性質(zhì)粒，每個基因取3個陽性質(zhì)粒做雙向測序(上海華大基因有限公司)。

1.5 序列測定及分析

基因測序結果使用DNAStar的Lasergene v7.1軟件包進行序列的翻譯(Editseq軟件)、編輯(Seqman軟件)、比對以及關鍵氨基酸位點變異分析(MegAlign軟件)。通過NCBI Blastn搜索和下載各病毒基因的最相似序列(10～20條/基因)，與國內(nèi)H9N2亞型AIV各進化分支的經(jīng)典參考序列一起，使用MEGA7.0軟件分別以Neighbor-joining(NJ)法和Maximum-likelihood法繪制各基因的系統(tǒng)進化樹。系統(tǒng)進化分析所使用的基因ORF區(qū)域分別如下：PB2 1 418—2 272 bp、PB1 1 315—2 208 bp、PA112—1 209 bp、HA52—880 bp、NP89—1 453 bp、NA205—1 347 bp、M68—784 bp以及NS120—827 bp。

1.6 交叉血凝抑制試驗檢測HA抗原性差異

分別使用本研究中的病毒分離株SD210、SD217和SD227抗原以及該養(yǎng)殖場使用的H9N2亞型疫苗株抗原制備4單位病毒，進行交叉血凝抑制試驗(HI)，檢測和比較不同抗原與疫苗免疫雞血清(1 000份)的反應性。

2 結 果

2.1 H9N2亞型AIV分離株的基因同源性分析

本研究獲得了6株H9N2亞型AIV的基因序列信息(GenBank登錄號見表1)。表1列出了6株病毒(A1～6)及其基因的GenBank登陸號，以及系統(tǒng)進化分析使用的經(jīng)典參考毒株B～E。G57代表一株隸屬于G57基因型的H9N2參考毒株。

Pairwise-distance分析表明，6株分離毒株各基因的相似性在93.4%～100%(表2)。

表1本研究中的H9N2禽流感病毒分離株和經(jīng)典參考毒株

Table1H9N2AIVisolatesandclassicreferencevirusesinthisstudy

組別GroupH9N2 AIV毒株H9N2 AIV strain簡稱AbbreviationHA效價HA titerGenBank登陸號GenBank accession No.A1A/chicken/ShanDong/210WZ/2017CK SD 210WZ 178MF795007～142A/chicken/ShanDong/217YY/2017CK SD 217YY 177MF795039～463A/chicken/ShanDong/227AC/2017CK SD 227AC 178MF795015～224A/chicken/ShanDong/306SZ/2017CK SD 306SZ 179MF795031～385A/chicken/ShanDong/321ZL/2017CK SD 321ZL 178MF795023～30

(轉下頁 Carried forward)

表2顯示了6株病毒分離株的基因型分類，分離株間的基因同源性(A)以及分離株和經(jīng)典參考毒株(B～E和G57)的基因相似性分析結果。其中，A為6株分離株，B為CK SH F 98，C為QL HK G1 97，D為DK HK Y439 97，E為DK HK Y280 97，G57表示一株G57基因型參考株，“-”表示該基因類型來源不明。

表2H9N2亞型禽流感病毒分離株基因型和基因相似性分析結果

Table 2 The result of genotype and genic homogenous analyses of H9N2-subtype AIV isolates%

表3列出了與H9N2分離株各基因相似性最高的部分參考毒株的基因信息。其中，病毒分離株1～6分別為CK SD 210WZ 17、CK SD 217YY 17、CK SD 227AC 17、 CK SD 306SZ 17、 CK SD 321ZL 17和CK SD 413ZDM 17。NCBI Blastn分析 表明，與各分離株基因同源性最高的參考序列主要來自2014年以來的病毒，基因相似性均在98%以上(表3)，其中，分離株HA和PA基因與A/duck/Japan/AQ-HE5/2015 (H9N2)相應基因的相似性最高，分離株PB2、PB1、NA、M和NS基因分別與2016年來自江西贛州的幾株病毒相應基因的同源性最高(表3)。這些參考株分離自包括山東、河北、上海、江蘇、浙江、江西、湖南、廣東和日本等在內(nèi)的廣泛地理區(qū)域。

2.2 H9N2亞型AIV分離株的系統(tǒng)進化分析

系統(tǒng)進化分析表明(圖1)，NJ法和Maximum-likelihood法構建的進化樹其拓撲結構相同，分離株8個基因片段均與G57基因型參考株處于同一進化亞系。結合系統(tǒng)進化分析(圖1)和基因同源性分析(表2)的結果，以同一亞系內(nèi)基因相似性≥90%為劃分依據(jù)，發(fā)現(xiàn)病毒分離株的PB1、PA、NP和NS基因隸屬于CK SH F 98亞系，M基因?qū)儆赒L HK G1 97亞系，HA和NA基因可勉強劃分到DK HK Y280 97亞系(相似性處于90%臨界點附近)，而分離株PB2基因隸屬于一個與上述4個亞系平行進化的亞系(表2)。

表3與本研究中分離株的基因同源性最高的參考毒株信息

Table3ReferenceviruseswithhighestgenicidentitiestotheH9N2genesinthisstudy

AIV基因片段AIV gene segment分離株Isolate基因相似性最高的病毒序列Ref. gene with top homology to isolate gene 相似性/%SimilarityPB21～6A/chicken/Shanghai/15/2015(H9N2)98.1～99.11～6A/chicken/Ganzhou/GZ140/2016(H9N2)98.1～99.1PB11～6A/chicken/Ganzhou/GZ188/2016(H9N2)99.3～99.6PA1～6A/chicken/Qingdao/017/2014(H9N2)98.5～98.81～6A/duck/Japan/AQ-HE5/2015(H9N2)98.3～98.5HA1～6A/duck/Japan/AQ-HE5/2015(H9N2)98.4～98.7NP1, 3～6A/chicken/Wenzhou/YHQL04/2014(H9N2)98.4～98.52A/chicken/Xigou/1/2011(H9N2)97.7NA1～2A/chicken/Ganzhou/GZ188/2016(H9N2)98.8～99.33～6A/chicken/Ganzhou/GZ86/2016(H9N2)98.9～99.0M1A/chicken/Shanghai/15/2015(H9N2)99.92～6A/chicken/Ganzhou/GZ188/2016(H9N2)99.2～99.6NS1～6A/chicken/Ganzhou/GZ86/2016(H9N2)98.9～99.2

2.3 H9N2 AIV分離株的分子特征分析

對分離株各基因的編碼氨基酸進行預測分析表明，各基因編碼蛋白的長度與以往報道的H9N2病毒分離株一致。PB2、PB1、PA、NP、HA和NA蛋白的長度分別為759、757、716、560、498和466個氨基酸，基質(zhì)蛋白M1和離子通道蛋白M2的長度分別為252和97個氨基酸，而非結構蛋白NS1和NS2蛋白分別為217和121個氨基酸。HA蛋白關鍵氨基酸位點分析表明，6株病毒HA基因裂解位點的氨基酸殘基均為RSSR↓GLF，符合低致病性AIV的分子特征(表4)。構成HA上唾液酸受體結合位點的氨基酸以及HA潛在糖基化位點的氨基酸高度保守，其中CK SD 227AC 17和CK SD 306SZ 17的HA有6個潛在的糖基化位點(NX-T/S，X為除P以外的氨基酸),而其余4個分離株有5個 糖基化位點(表4)。

表4H9N2毒株HA蛋白關鍵氨基酸位點分析

Table4AnalysisofkeysitesofaminoacidresiduesofHAprotein(H9N2isolates)

病毒VirusHA裂解位點HA cleavage site 受體結合位點Receptor combination site潛在糖基化位點Potential glycosylation site10916116319119820220329-31141-143298-300305-307492-494551-553CK SD 210WZ 17RSSR↓GLFYWTNTLYNSTNVSNSTNVS NGTCK SD 217YY 17RSSR↓GLFYWTNTLYNSTNVSNSTNVS NGTCK SD 227AC 17RSSR↓GLFYWTNTLYNSTNVSNSTNVS NGTNGSCK SD 306SZ 17RSSR↓GLFYWTNTLYNSTNVSNSTNVS NGTNGSCK SD 321ZL 17RSSR↓GLFYWTNTLYNSTNVSNSTNVS NGTCK SD 413ZDM 17RSSR↓GLFYWTNTLYNSTNVSNSTNVS NGTCK SH F 98RSSR↓GLFYWTNALYNSTNVSNTTNVS NGTNGSDK HK Y280 97RSSR↓GLFYWTNVLYNSTNVSNTTNVSNGTQL HK G1 97RSSR↓GLFYWTHELYNSTNVTNSTNVS NGTDK HK Y439 97ASNR↓GIFYWTHELYNSTNVTNTTNVS NGT

(轉下頁 Carried forward)

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顯示了H9N2亞型AIVs的PB2、PB1、PA、HA、NP、NA、M和NS基因系統(tǒng)進化樹(NJ法)。其中，本研究中的6株病毒分離株以圓點表示，4個經(jīng)典參考毒株(CK SH F 98、QL HK G1 97、DK HK Y439 97和DK HK Y280 97)以三角形表示，G57亞型參考株以矩形表示Fig.1 showed the phylogenetic trees of the 8 AIV genes (PB2, PB1, PA, HA, NP, NA, M and NS). The 6 viruses labeled in circle were the isolates in this study. The 4 viruses labeled in triangle were classical reference viruses (CK SH F 98, QL HK G1 97, DK HK Y439 97 and DK HK Y280 97). The virus labeled in rectangular was a G57-genotype reference virus圖1 H9N2亞型AIV各基因系統(tǒng)進化樹Fig.1 The phylogenetic trees of genes of H9N2 avian influenza viruses in this study

與AIV抗藥性相關的蛋白位點分析表明，本研究中的6株H9N2分離株M2蛋白的第26—34位氨基酸殘基序列為LVVAANIIG，均存在S31N變異，表明病毒均對離子通道蛋白抑制劑耐藥[15]；分離株NA蛋白不存在R292K變異，表明病毒對神經(jīng)氨酸酶抑制劑敏感[16]。此外，分離病毒其他蛋白未見有對哺乳動物模型致病性增強的單個氨基酸變異，如PB2蛋白的E627K變異和D701N變異、PB1-F2蛋白的N66S變異或NS1蛋白的D92E變異[17-20]。

2.4 AIV分離毒株的HA抗原性差異分析

對1 000份免疫雞血清進行交叉血凝抑制試驗(HI)檢測的結果表明，以分離株SD210為抗原比疫苗株抗原測得的免疫雞血清HI效價平均低2 log2； 而以分離株SD217和SD227為抗原比疫苗株抗原測得的血清HI效價平均低1～2 log2。表5顯示了其中20份血清的HI檢測結果。

表5分別以H9N2亞型病毒分離株和疫苗株為抗原的血凝抑制試驗結果

Table5ResultsofHItestswithH9N2isolatesorthevaccinevirusasantigenslog2

3 討 論

本研究對2017年上半年自山東省肉雞場分離到的6株H9N2亞型AIVs進行了基因組序列測定、進化分析和HA抗原性差異分析，為H9N2亞型AIVs的分子演化和抗原變異提供最新的流行病學資料。從病毒分離時間上來看，與分離毒株基因相似性最高(≥98%)的參考基因大多來自2014—2016年。相比之下，分離毒株與20世紀末分離的系統(tǒng)進化經(jīng)典參考毒株相似性較低，其中PB2基因與4株參考株基因相似性均已低于90%，HA和NA基因與經(jīng)典株基因相似性最高者也僅90%左右(表2)。表明國內(nèi)H9N2病毒流行株不斷累積基因變異，與經(jīng)典株的基因分化不斷加劇。另外，從病毒基因型上來看，國內(nèi)H9N2亞型禽流感病毒基因型自2009年起多樣性驟減，G57成為絕對優(yōu)勢流行基因型[13]。本研究中的H9N2分離株在系統(tǒng)進化分類上同屬于G57基因型，表明該基因型病毒繼續(xù)在山東省肉雞群中流行。

AIV的HA蛋白在合成之初以多肽HA0的形式存在，然后在適當?shù)牡鞍姿饷傅淖饔孟铝呀鉃镠A1和HA2。含單堿性氨基酸裂解位點基序的HA蛋白僅能被特異性蛋白酶(如胰酶)所裂解，因這類酶在鳥類的分布局限在呼吸道和腸道，病毒感染后僅產(chǎn)生溫和或無癥狀感染；而另一方面，裂解位點為多堿性氨基酸的HA蛋白可被鳥體內(nèi)廣泛分布的泛素所裂解，從而導致病毒的廣泛復制和多器官感染[21-22]。本研究中分離株HA蛋白裂解位點基序的單堿基氨基酸表明，各病毒仍屬于低致病性范疇。

目前商品化的流感病毒藥物包括M2抑制劑(金剛烷胺和金剛乙胺)和NA抑制劑(奧司他韋和扎那米韋)[23]。M2或NA蛋白單個氨基酸位點的變異即可導致流感病毒的耐藥性。M2蛋白的L26I、V27I、A30P、S31N或G34E變異可導致AIV對金剛烷胺耐藥性[24]； NA蛋白R292K(以N2序列計數(shù))變異可導致N1、N2和N9亞型AIV對NA抑制劑的耐藥性[16, 25-26]。與耐藥性相關的AIV氨基酸位點分析表明，本研究中的6株H9N2分離株對離子通道蛋白抑制劑耐受，而對神經(jīng)氨酸酶(NA)抑制劑敏感。

反向遺傳學研究表明，PB2蛋白的E627K突變可增強H5N1亞型AIV對小鼠的系統(tǒng)性感染，導致小鼠T細胞活化受損[27-28]；PB2蛋白的D701N突變是促進H5N1亞型AIVs在豚鼠間傳播的必要條件[29]；NS1蛋白的D92E突變可增強H5N1亞型AIVs對豬的致病性[19]。此外，PB1-F2蛋白的N66S突變導致了H5N1/1997和H1N1/1918流感病毒毒株對人致病性的增強[30]。本研究中的6株分離株內(nèi)部蛋白均不存在上述氨基酸變異。

交叉血凝抑制試驗的結果表明，本研究中的H9N2分離株HA蛋白抗原與現(xiàn)有HI用標準抗原略有差異。在養(yǎng)禽生產(chǎn)中，一般將交叉HI效價相差3 log2作為流行株抗原與疫苗株抗原有顯著差異的標準，據(jù)此分析，本研究中的分離株與疫苗株抗原性差異尚不顯著。后續(xù)研究中我們將繼續(xù)對山東省H9N2亞型AIV分子演化和抗原變異進行持續(xù)監(jiān)測，以積累病毒感染、傳播和進化的數(shù)據(jù)，促進AIV的有效防控。

4 結 論

2017年在山東省聊城市該肉雞場流行的6株H9N2亞型禽流感病毒仍然為G57基因型，病毒對離子通道蛋白抑制劑耐藥，病毒分離株的HA抗原反應性與疫苗株差異不顯著。