張聰聰 程乃萱 陳博雅 李玉琳 杜 杰

急性心肌梗死是一種高發(fā)病率和高致死性疾病。冠狀動(dòng)脈血管閉塞后，心肌細(xì)胞缺血缺氧導(dǎo)致大量的死亡，進(jìn)而發(fā)生心室結(jié)構(gòu)和功能的改變，最終導(dǎo)致心力衰竭[1]。因此有效的預(yù)防心肌細(xì)胞死亡可以提高心肌梗死的預(yù)后。精胺(spermine, SP)是細(xì)胞中普遍存在的一類脂肪胺類小分子化合物，也可從食物中攝取，主要參與多胺代謝。近年來(lái)研究顯示,SP可以參與細(xì)胞的自噬、凋亡、增殖等多種生物學(xué)過(guò)程[2-3]，但其是否影響心肌梗死后的心臟重構(gòu)過(guò)程尚不清楚。本研究以小鼠冠狀動(dòng)脈前降支結(jié)扎的方法構(gòu)建小鼠急性心肌梗死模型[4]，并給予SP喂水處理后觀察SP對(duì)小鼠心肌梗死后心功能和心臟重構(gòu)的影響并探討其可能的作用機(jī)制。

材料與方法

1. 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 SPF級(jí),C57BL/6J小鼠,40只，雄性，10周齡，體質(zhì)量20～23g，由首都醫(yī)科大學(xué)附屬北京安貞醫(yī)院實(shí)驗(yàn)動(dòng)物房提供。購(gòu)自北京華阜康生物科技股份有限公司，生產(chǎn)許可證號(hào):SCXK(京)2014-0004，使用許可證號(hào): SCXK(京)2015-0023。小鼠隨機(jī)分為三組: 對(duì)照組(10只)，模型組(15只)和SP處理組(15只)。

2. 主要試劑 精胺(Sigma，美國(guó))，反轉(zhuǎn)錄試劑盒(Promega，美國(guó))，realtime-PCR試劑盒(TaKaRa，日本)，氯化三苯四唑(triphenyl tetrazolium chloride，TTC)染色劑(Sigma，美國(guó))，天狼猩紅染色液(中杉金橋，中國(guó))，小鼠IL-6、TNF-α和IL-1β ELISA檢測(cè)試劑盒(R&D，美國(guó))。

3. 冠狀動(dòng)脈前降支結(jié)扎誘導(dǎo)小鼠心肌梗死模型制備 小鼠異氟烷麻醉后仰臥固定在鼠板上，在小鼠心臟部位第三四肋間隙位置做一約1.5cm縱向切口，用3-0 絲線打一荷包松結(jié)備用，鈍性分離胸大肌肉與肋骨外肌肉; 于第三四肋間穿破胸膜和心包膜，左手迅速將心臟擠出，在小鼠左心耳下緣下2mm處以6-0絲線結(jié)扎冠狀動(dòng)脈，可見(jiàn)左心室前壁顏色由鮮紅變?yōu)榘底现辽n白色; 快速將心臟推入胸腔，擠出胸內(nèi)氣體，打緊荷包關(guān)胸，摘除麻醉面罩，等待小鼠自然蘇醒。假手術(shù)組手術(shù)時(shí)絲線僅穿過(guò)左冠狀動(dòng)脈主干而不結(jié)扎冠狀動(dòng)脈。所有小鼠均普通飲食飼養(yǎng)，自由進(jìn)食、進(jìn)水。

4. 小鼠心功能測(cè)定 于MI術(shù)后7d通過(guò)小動(dòng)物超聲進(jìn)行小鼠心功能測(cè)定，主要檢測(cè)指標(biāo)如下：室間隔厚度(interventricular septum，IVS)、左心室后壁厚度(left ventricular posterior wall thickness，LVPW)、左心室舒張末期內(nèi)徑(left ventricular end-diastolic dimension, LVEDD)、左心室收縮末期內(nèi)徑(left ventricular end-systolic dimension, LVEDS)、左心室舒張末期容積(left ventricular end-diastolic volume, LVESV)、左心室收縮末期容積(left ventricular end-systolic volume, LVEDV)、左心室射血分?jǐn)?shù)(left ventricular ejection fraction，LVEF)、左心室縮短分?jǐn)?shù)(left ventricular fractional shortening，LVFS)。

5. 心臟組織病理切片的制備 術(shù)后28天收取小鼠心臟組織，使用10%中性甲醛固定后，常規(guī)石蠟包埋，4μm切片。天狼星紅染色：切片經(jīng)二甲苯和梯度乙醇脫蠟至水，天狼星紅染色液室溫染色30min，自來(lái)水洗去浮色，無(wú)水乙醇5mL, 2次，二甲苯透明，中性樹(shù)膠封片。WGA染色：切片經(jīng)二甲苯和梯度乙醇脫蠟至水，檸檬酸緩沖液(pH=6.0)抗原修復(fù)90s，1 x PBS緩沖液洗3遍，羊血清封閉液室溫封閉30min，WGA工作液(10μg/mL, Sigma,美國(guó))37℃,孵育60min，1× PBS緩沖液洗3遍，DAPI封片。使用電子熒光顯微鏡(Nikon，日本)進(jìn)行病理圖像采集，使用NIS Br 3.0軟件進(jìn)行圖像分析。

6. realtime-PCR檢測(cè)小鼠心臟組織凋亡相關(guān)基因和炎癥相關(guān)基因的mRNA水平 取相同質(zhì)量50 mg 的心臟組織放入勻漿器內(nèi)，加入1 mL Trizol(Invitrogen，美國(guó))提取RNA，用Nanodrop 2000(Thermo，美國(guó))測(cè)定RNA 的濃度和OD260 /280 比值。各樣本均按5μg RNA 相對(duì)應(yīng)的體積(n μL) 根據(jù)反轉(zhuǎn)錄試劑盒說(shuō)明書進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄，轉(zhuǎn)錄體系為20 μL 體系，將混合好的液體放置在PCR儀中，反應(yīng)條件為42℃, 60min;95℃ 5min。將反轉(zhuǎn)好的cDNA按照realtime-PCR試劑盒說(shuō)明書進(jìn)行PCR，使用Bio-RAD CFX ConnectPCR儀進(jìn)行反應(yīng)，反應(yīng)條件為95℃, 2min→95℃, 15s;60℃, 30s(40個(gè)循環(huán))→60℃, 5s，每個(gè)循環(huán)增加0.5℃～95℃。以GAPDH作為內(nèi)參?；虻谋磉_(dá)水平以得到的相應(yīng)的Ct 值用2 (CtGAPDH-Ct目標(biāo)基因) 法進(jìn)行計(jì)算。引物序列分別為: Bcl2∶5’-AACATCGCCCTGTGGATGAC-3’(上游)，5’- AAACAGAGGTCGCATGCTGG -3’(下游)；Bcl-xL：5’-AGTAAACTGG GGTCGCATCG-3’(上游)，5’- GCCATCCAACTTGCAATCCG -3’(下游)；IL-6∶5’-GGTGACAACCACGGCCTTCCC-3’(上游)，5’- AAGCCTCCGACTT GTGAAGT GGT -3’(下游)；TNF-α：5’- TAGCCCACGTCGTAGCAAAC -3’(上游)，5’- ACAAGGTACAACCCATCGGC -3’(下游)；IL-1β：5’-CGTGGACCTTCCAG GATGAG-3’(上游)，5’-CATCTCGGAGCCTGTAGTGC -3’(下游)；GAPDH：5’- CATGGCCTTCCGTGTTCCTA -3’(上游)，5’-GCGGCACGTCAGATCCA -3’(下游)。

7. 心臟組織TTC染色檢測(cè)心肌細(xì)胞活力 于術(shù)后1d各組小鼠摘取心臟，迅速放在負(fù)20℃凍存15分鐘，自心尖至心底垂直與心臟長(zhǎng)軸橫切成約1mm厚組織切片，將切片置于1% TTC溶液中,37℃,溫孵15 min，心臟整體及染色后組織切片進(jìn)行拍照，分析死亡心肌(白色)占左心室面積比例。

8. 血清炎癥因子TNF-α、IL-6 和IL-1β的檢測(cè) 在收取小鼠血液待其凝固后，3 000轉(zhuǎn)/min離心10分鐘，吸取上層血清凍于-80℃待檢測(cè)。分別使用TNF-α、IL-6 和IL-1β的ELISA試劑盒檢測(cè)血清中炎癥因子的水平，步驟參照說(shuō)明書進(jìn)行，使用酶標(biāo)儀(Biotek，美國(guó))進(jìn)行數(shù)據(jù)的讀取和分析。

9.統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 應(yīng)用SPSS 19.0統(tǒng)計(jì)軟件對(duì)實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。首先進(jìn)行正態(tài)分布檢驗(yàn)，符合正態(tài)分布計(jì)量數(shù)據(jù)以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示，兩組之間的比較采用非配對(duì)t檢驗(yàn)，多組之間的比較采用One-way ANOVA。不符合正態(tài)分布的數(shù)據(jù)兩組之間比較使用非參數(shù)檢驗(yàn)。分類變量以頻數(shù)(百分比) 表示,兩組小鼠之間的存活率比較使用χ2檢驗(yàn)。以P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

結(jié) 果

1.小鼠心肌梗死術(shù)后存活情況 冠狀動(dòng)脈前降支結(jié)扎手術(shù)后存活小鼠只數(shù)分別為：對(duì)照組10只；模型組13只，死亡2只的原因?yàn)檫M(jìn)針過(guò)深刺破心臟引起失血性休克；SP組14只，死亡1只的原因?yàn)閿D出心臟過(guò)程中器械誤觸破血管導(dǎo)致死亡。術(shù)后28d統(tǒng)計(jì)各組的存活率為：對(duì)照組存活10只(存活率100%)，模型組存活9只(存活率69.23%)，分別在術(shù)后3d死亡1只，術(shù)后4d死亡2只，5d死亡1只，死亡4只小鼠尸檢均發(fā)現(xiàn)有血胸認(rèn)定為是心臟破裂死亡；SP組存活13只(存活率92.85%，與模型組相比P=0.12)，在術(shù)后4d死亡1只，尸檢發(fā)現(xiàn)有血胸，認(rèn)定為心臟破裂死亡。

2.心功能的改變 MI術(shù)后7d檢測(cè)三組心功能各項(xiàng)指標(biāo)，其中模型組較對(duì)照組的LVEF值和LVFS值顯著降低(P<0.01)，而SP組的LVEF值和LVFS值較模型組顯著增加(P<0.05)。提示SP處理可以改善心肌梗死后的心功能，結(jié)果見(jiàn)表1。

表1 三組小鼠心功能比較

注:與對(duì)照組相比，*P<0.05；與模型組相比，#P<0.05

3.心臟重構(gòu)的情況 心肌梗死后28d心臟組織使用天狼星紅染色觀察各組心臟梗死瘢痕的面積。發(fā)現(xiàn)與假手術(shù)組相比，模型組小鼠的梗死瘢痕面積增加(P<0.01)，但是SP組小鼠心臟組織中梗死瘢痕面積顯著小于模型小鼠組(P<0.01)。使用WGA染色法觀察非梗死區(qū)心肌細(xì)胞代償性肥大的情況，發(fā)現(xiàn)模型組小鼠的心肌細(xì)胞顯著大于假手術(shù)組(P<0.01)，但是SP組小鼠的心肌細(xì)胞顯著小于模型組小鼠(P<0.01，圖1)。提示SP處理可以減輕心肌梗死后的心臟重構(gòu)。

圖1 精胺處理減輕心肌梗死后的心臟重構(gòu)程度 A:天狼星紅染色觀測(cè)心肌梗死后瘢痕組織，紅色染色為膠原(40x)及膠原陽(yáng)性面積占左心室面積的比例的統(tǒng)計(jì)圖。B:WGA染色觀測(cè)心肌細(xì)胞的面積(400×)及心肌細(xì)胞橫截面面積的統(tǒng)計(jì)圖。 注: **P<0.01

4.心肌細(xì)胞凋亡的情況 心肌梗死后心肌細(xì)胞缺血缺氧發(fā)生大面積的凋亡，因此我們使用TTC染色法測(cè)定了心肌梗死后1d梗死區(qū)心肌細(xì)胞的活力，并使用realtime-PCR的方法檢測(cè)凋亡相關(guān)基因(Bcl2，Bcl-xL)的表達(dá)情況。結(jié)果如圖2所示，SP組TTC陰性區(qū)域面積顯著小于模型組(P<0.05)。SP組小鼠心臟組織中抗凋亡基因Bcl2，Bcl-xL的mRNA水平高于模型組(P<0.05)。提示SP處理可減少梗死后心肌細(xì)胞因缺氧引起的凋亡。

5.炎癥反應(yīng) 結(jié)果如圖3所示，SP組小鼠梗死后1天心臟組織中IL-6、TNF-α和IL-1β的mRNA水平均低于模型組小鼠(P<0.05)，同時(shí)血清中IL-6、TNF-α和IL-1β的表達(dá)也顯著低于模型組小鼠血清(P<0.05)。提示SP處理可以減輕心肌梗死后的炎癥反應(yīng)。

圖2 精胺處理促進(jìn)心肌細(xì)胞的存活 A:心肌梗死后1天心臟組織進(jìn)行TTC染色(紅色為存活心肌，白色為已死亡心肌)。B: realtime-PCR法檢測(cè)Bcl2和Bcl-xL的表達(dá)。注:*P<0.05；**P< 0.01

圖3 精胺處理減少心臟炎癥反應(yīng) A:使用realtime-PCR法檢測(cè)各炎癥因子水平。B:使用ELISA 法檢測(cè)各炎癥因子蛋白水平。注:*P<0.05

討 論

心肌梗死及其并發(fā)癥(猝死，室壁瘤，心臟破裂，心力衰竭等)嚴(yán)重危害國(guó)民健康和生命[5-8]。冠狀動(dòng)脈阻塞引起心肌梗死后，心肌細(xì)胞發(fā)生凋亡、壞死，活化的肌成纖維細(xì)胞產(chǎn)生新的細(xì)胞外基質(zhì)替代梗死心肌形成室壁瘤。但新形成的室壁瘤區(qū)域并無(wú)有效的收縮功能，為了保證全身供血的有效性，非梗死區(qū)存活的心肌細(xì)胞會(huì)發(fā)生代償性的心肌肥大，從而維持心功能[9]。我們?cè)诒狙芯恐邪l(fā)現(xiàn)精胺處理組小鼠在心肌梗死后心功能顯著高于模型組小鼠，而且心臟擴(kuò)張程度小于模型組小鼠。進(jìn)一步對(duì)心臟重構(gòu)相關(guān)的指標(biāo)的檢測(cè)結(jié)果顯示精胺處理組小鼠梗死瘢痕面積小于模型組小鼠，非梗死區(qū)心肌細(xì)胞代償性肥大程度低于模型小鼠。以上結(jié)果提示精胺可以在心肌梗死后心臟重構(gòu)過(guò)程中發(fā)揮保護(hù)性作用。

發(fā)生心肌梗死后，缺血區(qū)心肌細(xì)胞由于供氧的缺乏，導(dǎo)致細(xì)胞內(nèi)未折疊或錯(cuò)誤折疊蛋白積聚、鈣穩(wěn)態(tài)失衡,觸發(fā)內(nèi)質(zhì)網(wǎng)未折疊蛋白反應(yīng)，激活內(nèi)質(zhì)網(wǎng)特異性分子伴侶GRP78并促使真核細(xì)胞翻譯起始因子2α亞單位eIF2α發(fā)生磷酸化,進(jìn)而使未折疊或錯(cuò)誤折疊蛋白恢復(fù)正確構(gòu)象、抑制蛋白質(zhì)合成,對(duì)細(xì)胞起保護(hù)作用。若應(yīng)激時(shí)間延長(zhǎng)則會(huì)激活內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激凋亡信號(hào)通路蛋白capase-12和GADD153/CHOP,誘導(dǎo)細(xì)胞發(fā)生凋亡壞死[10]。多胺包括腐胺、精脒、精胺，廣泛存在于哺乳類動(dòng)物的各種組織細(xì)胞內(nèi)。近年來(lái)研究發(fā)現(xiàn)精胺在多種心臟疾病(老年性心肌病、病毒性心肌炎、糖尿病心肌病等)的病理生理過(guò)程中起重要作用[11-13]。在腦缺血再灌注損傷過(guò)程中，精胺可以通過(guò)清除氧自由基，穩(wěn)定核苷酸從而發(fā)揮保護(hù)腦的缺血性損傷的作用[14]。在病毒性心肌炎時(shí)，精胺可以減少心肌細(xì)胞中GRP78的表達(dá)，并抑制內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激激活的凋亡分子CHOP、caspase-12的表達(dá)從而減輕心肌細(xì)胞的凋亡和壞死[15]。在本研究中發(fā)現(xiàn)精胺處理可減少缺血后心肌細(xì)胞的死亡，同時(shí)上調(diào)抗凋亡分子Bcl-2，Bcl-xL的表達(dá)，提示精胺的保護(hù)作用主要通過(guò)促進(jìn)心肌細(xì)胞在缺血缺氧環(huán)境下的存活發(fā)揮。

凋亡壞死的心肌細(xì)胞可以釋放死亡相關(guān)模式分子，通過(guò)Toll樣受體(TLRs)激活成纖維細(xì)胞和心臟原位巨噬細(xì)胞，促進(jìn)其釋放趨化因子(CCL2，CCL3等)，招募更多的炎癥細(xì)胞浸潤(rùn)至受損部位[16-17]。壞死的心肌細(xì)胞還可以釋放TNF-α，IL-6等細(xì)胞因子進(jìn)一步激活招募進(jìn)心臟的單核巨噬細(xì)胞發(fā)揮炎癥放大作用[18]。心肌梗死后炎癥反應(yīng)一方面可以清除壞死的心肌細(xì)胞，另一方面調(diào)控心臟重構(gòu)過(guò)程[19]。本研究中發(fā)現(xiàn)，與模型組相比，精胺處理可顯著降低心臟組織以及循環(huán)血清中炎癥因子IL-6、TNF-α和IL-1β的水平。證明了精胺可以抑制缺血區(qū)的炎癥反應(yīng)，從而在心肌梗死后發(fā)揮保護(hù)性作用。

綜上所述，在小鼠心肌梗死后使用精胺處理可以促進(jìn)心肌細(xì)胞在缺血缺氧環(huán)境下的存活，從而減輕心臟炎癥反應(yīng)，進(jìn)一步減輕心臟重構(gòu)程度，提高心功能，為心肌梗死的治療提供新思路。