任 瞳 李繼勇 張健群 師 闖

鈣化性主動(dòng)脈瓣疾病(calcific aortic valve disease, CAVD)是一類常見的心臟瓣膜疾病，主要表現(xiàn)為瓣膜組織增厚、硬度增加以及鈣化[1]，是提高心血管疾病發(fā)生率和病死率的主要原因[2]，已成為重要的公共衛(wèi)生問題[3-4]。研究發(fā)現(xiàn)，CAVD可在血流動(dòng)力學(xué)沒有顯著梗阻的情況下，使心血管原因死亡的風(fēng)險(xiǎn)提高到50%，極大地加重了社會(huì)和家庭的經(jīng)濟(jì)負(fù)擔(dān)[5]。目前臨床尚無有效的醫(yī)療手段預(yù)防或逆轉(zhuǎn)CAVD 的發(fā)病過程，其發(fā)病機(jī)制亦尚無定論[6]。既往觀點(diǎn)認(rèn)為，CAVD是一種與年齡相關(guān)的退行性病變，但越來越多的證據(jù)表明CAVD不僅與年齡相關(guān)，更是一個(gè)主動(dòng)的與動(dòng)脈粥樣硬化類似的病理生理過程[1]。研究指出阿托伐他汀具有強(qiáng)效降脂功能，還具有抗炎、改善內(nèi)皮細(xì)胞功能和抗氧化應(yīng)激反應(yīng)等作用[7-8]。但目前關(guān)于CAVD早期病理改變的兔模型鮮有報(bào)道。本研究旨在通過建立發(fā)生CAVD早期病理改變的兔模型，觀察實(shí)驗(yàn)個(gè)體中主動(dòng)脈瓣膜的組織學(xué)改變及阿托伐他汀干預(yù)對(duì)兔主動(dòng)脈瓣鈣化性病變炎性指標(biāo)的影響，并探討CAVD相關(guān)的病理機(jī)制及可能的治療靶點(diǎn)，現(xiàn)報(bào)道如下。

材料與方法

1.動(dòng)物模型建立 選擇健康，新西蘭純種，雄性，白兔，45只，體質(zhì)量 2.0～2.5kg，按清潔級(jí)動(dòng)物分籠喂養(yǎng)，適應(yīng)性喂養(yǎng)1周后，隨機(jī)分為三組，正常對(duì)照組(N 組)：15只，喂飼普通顆粒兔飼料；高脂飲食組(HC組)：15只，予高脂飲食喂養(yǎng)；高脂飲食加阿托伐他汀干預(yù)組(AI組)：15只，高脂飲食喂養(yǎng)同時(shí)予阿托伐他汀4mg·kg-1·d-1)灌胃；同期 N、HC 組均分別給予同等劑量0. 9% 氯化鈉溶液灌胃。并將實(shí)驗(yàn)開始及第 4、8、16 周為固定時(shí)間點(diǎn)，各測兔體質(zhì)量一次，以觀察其生長情況并調(diào)整藥物劑量。

2.血標(biāo)本采集及測定 于實(shí)驗(yàn)開始后第 4、8、12 周，抽取空腹兔耳緣靜脈血3～5mL，即刻送首都醫(yī)科大學(xué)附屬安貞醫(yī)院檢驗(yàn)科進(jìn)行指標(biāo)測定，包括：TC、TG、LDL-C、HDL-C、肌酸激酶(CK)、谷丙轉(zhuǎn)氨酶(ALT)及高敏C反應(yīng)蛋白(hs-CRP)。

3.瓣膜標(biāo)本采集、制備及測定 瓣膜標(biāo)本采集于實(shí)驗(yàn)開始后第4周末，于解剖實(shí)驗(yàn)室，對(duì)各組各取一只兔子經(jīng)耳緣靜脈注入苯巴比妥 50 mg / kg 處死，隨即剖開胸部，摘除心臟，并沿著血流方向剪開心臟，暴露各心腔和瓣膜，取得實(shí)驗(yàn)兔的主動(dòng)脈瓣膜；第8周于三組中再各隨機(jī)挑取一只兔子，按上述方法取得主動(dòng)脈瓣膜；第12周取剩余兔子的主動(dòng)脈瓣膜標(biāo)本。所有標(biāo)本均用磷酸鹽緩沖液洗去血漬后，固定于 10% 的甲醛中，經(jīng)過同樣梯度乙醇脫水，二甲苯透明后石蠟包埋，用組織切片機(jī)切 3μm 超薄石蠟切片。

4.標(biāo)本HE染色 利用標(biāo)準(zhǔn)HE染色觀察瓣膜組織構(gòu)架，包括瓣葉的厚度、炎細(xì)胞及纖維細(xì)胞的數(shù)量、鈣化情況、膽固醇結(jié)晶、泡沫細(xì)胞和毛細(xì)血管等的出現(xiàn)。

5.免疫組織化學(xué)染色 將石蠟切片脫蠟至水，抗原修復(fù)，阻斷內(nèi)源性過氧化物酶，血清封閉，加一抗(TNF，型號(hào)JM6183，比例1∶200；IL-6，型號(hào)JM1908，比例1∶200)，加二抗(山羊抗兔鼠通用，型號(hào)DAKO K5007，比例：即用)，二氨基聯(lián)苯胺(DAB)顯色液顯色，復(fù)染細(xì)胞核，脫水封片后行顯微鏡鏡檢，圖像采集分析，觀察炎性因子TNF-α和IL-6在標(biāo)本中的表達(dá)。(以上試劑購自北京嘉美臻元生物科技有限公司)。

6.判斷標(biāo)準(zhǔn) 組織學(xué)和免疫組化的染色結(jié)果判斷：每組組織學(xué)和免疫組化的染色結(jié)果均由兩位或三位有經(jīng)驗(yàn)的觀察者進(jìn)行評(píng)估。每張切片均被系統(tǒng)地觀察，分別在瓣膜切片取瓣尖、中間1/3和基底部3個(gè)視野(×200及×400)，評(píng)估各個(gè)主動(dòng)脈瓣膜組織的特征，對(duì)比觀察各樣本中陽性結(jié)果的表達(dá)及其程度。

7.統(tǒng)計(jì)學(xué)分析 采用 SPSS 20.0進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)處理。先對(duì)測量結(jié)果進(jìn)行正態(tài)檢驗(yàn)和方差齊性檢驗(yàn)，計(jì)量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示，三組間比較時(shí)采用方差分析，兩兩比較采用 LSD-t 法。以P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

結(jié) 果

1.體質(zhì)量及檢驗(yàn)指標(biāo)結(jié)果 各實(shí)驗(yàn)組個(gè)體均無中途患病及死亡情況。三組樣本兔體質(zhì)量均隨喂養(yǎng)時(shí)間增長而升高，三組之間體質(zhì)量變化，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(表1)。血液檢驗(yàn)指標(biāo)提示4周后，與N組相比，HC組TC、TG、LDL-C及 hs-CRP均升高，且差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，AI組在上述4項(xiàng)指標(biāo)中同樣明顯升高，但明顯低于HC組增高水平(P<0.05)，其余指標(biāo)差異不顯著(P>0.05)。8周及12周后，HC組TC、TG、LDL-C及hs-CRP較第4周明顯升高，而AI組上述4項(xiàng)指標(biāo)雖也呈現(xiàn)升高趨勢，但數(shù)值明顯低于HC組，且差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，此外AI組ALT及HDLD-C分別與N組及HC組相比，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，但其他指標(biāo)差異不顯著(表2)。

2.肉眼外觀 第4周：三組瓣膜標(biāo)本均平整、致密、柔軟、光滑，未見明顯病理改變。第8周：HC組瓣膜較第4周增厚，但表面光滑、柔軟，未見鈣化斑，N組和AI組較前未見明顯異常。第12周：HC組瓣膜厚度較第8周進(jìn)一步增加，其透亮度降低，瓣間及基底部可見瓣膜表面顆粒狀隆起，未見明顯鈣化斑；AI組可見標(biāo)本較前增厚，透亮度較前降低，但不及HC組明顯；N組較前未見明顯異常。

3.HE染色結(jié)果 12周時(shí)，HC組瓣膜標(biāo)本光鏡下可見瓣膜內(nèi)膜及中膜重度增厚；胞漿內(nèi)明顯的深藍(lán)色鈣鹽沉積，同時(shí)可見間質(zhì)細(xì)胞化生，向軟骨和成骨樣細(xì)胞轉(zhuǎn)化(圖1A)；內(nèi)膜增厚區(qū)可見大量泡沫細(xì)胞，組織可見大量脂肪浸潤(圖1B)；AI組可見內(nèi)膜輕度增厚，少量泡沫細(xì)胞聚集(圖1C)；N組可見瓣膜內(nèi)膜疏松，結(jié)構(gòu)整齊(圖1D)。

4.免疫組化結(jié)果 12周時(shí)，三組瓣膜標(biāo)本免疫組化染色結(jié)果顯示：HC組與AI組及N組比較，因子TNF-α、IL-6顯著高表達(dá)；AI組同樣可見兩因子表達(dá)，但程度較HC組低；N組未見明顯表達(dá)(圖3)。

表1 各組兔體質(zhì)量對(duì)比

討 論

CAVD是心血管疾病的危險(xiǎn)因素，也與多種心血管危險(xiǎn)因素相關(guān)。隨著人口老齡化加劇，我國CAVD的發(fā)病率正逐年升高，已經(jīng)或即將成為我國瓣膜疾病的首要病因，越來越引起人們的關(guān)注[9]。雖然人們對(duì)CAVD的病因?qū)W及病理生理過程進(jìn)行了大量研究并取得了一定進(jìn)展，但是目前CAVD的發(fā)病機(jī)制尚未明確，本研究借助高脂兔模型再現(xiàn)了早期鈣化性主動(dòng)脈瓣疾病的疾病進(jìn)展過程，為研究CAVD的機(jī)制及干預(yù)提供了便利。通過實(shí)驗(yàn)我們發(fā)現(xiàn)，高脂飲食干預(yù)能夠誘導(dǎo)兔主動(dòng)脈瓣膜發(fā)生與早期鈣化性主動(dòng)脈瓣疾病相似的病理組織學(xué)改變，同時(shí)存在慢性炎癥反應(yīng)的證據(jù)，包括：脂蛋白沉積、慢性炎癥、瓣膜間質(zhì)細(xì)胞(VIC)向成骨細(xì)胞的過渡及進(jìn)行性瓣膜小葉的纖維鈣化等，這也提示我們CAVD是一個(gè)活躍、主動(dòng)的病理過程，其與動(dòng)脈粥樣硬化有相似的風(fēng)險(xiǎn)因素和病理生理特點(diǎn)，與師闖等[10]的研究結(jié)果一致。此外，我們發(fā)現(xiàn)HC組瓣膜標(biāo)本內(nèi)膜下存在大量脂肪浸潤，在內(nèi)膜增厚區(qū)可見大量泡沫細(xì)胞。而泡沫細(xì)胞是由不能被溶酶體降解的氧化型膽固醇蛋白和氧化型膽固醇共同積累后，被巨噬細(xì)胞吞噬轉(zhuǎn)化而成，最終導(dǎo)致斑塊及鈣化的形成。它是動(dòng)脈粥樣硬化的特征性病理細(xì)胞，也存在于CAVD病灶中，這也進(jìn)一步提示我們HC組瓣膜標(biāo)本存在病變的發(fā)生發(fā)展。

表2 各組兔血液化驗(yàn)指標(biāo)對(duì)比

注：與N組相比，aP<0.05；與HC組相比，bP<0.05

圖 1 HE染色圖 A：黑色箭頭示瓣膜內(nèi)斑塊；紅色箭頭示軟骨化生；B：黑色箭頭示脂肪；紅色箭頭示主動(dòng)脈內(nèi)斑 塊；C：黑色箭頭示泡沫細(xì)胞；D: 黑色箭頭示內(nèi)膜疏松，內(nèi)皮細(xì)胞輕度增生，結(jié)構(gòu)整齊

圖3 免疫組化光鏡組圖 A：N組 IL-6(×200)；B：N組 IL-6(×400)；C：N組 TNF-α(×200)；D：N組TNF-α(×400)；E：HC組 IL-6(×200)；F：HC組 IL-6(×400)；G：HC組TNF-α(×200)；H：HC組 TNF-α(×400)；I：AI組 IL-6 (×200)；J：AI組 IL-6(×400)；K：AI組TNF-α(×200)；L：AI組 TNF-α(×400)

炎癥反應(yīng)是心血管損害的重要病理過程，CRP作為炎癥反應(yīng)指標(biāo)，與心血管疾病風(fēng)險(xiǎn)呈正相關(guān)[7,11]。而研究發(fā)現(xiàn)，他汀類藥物除了降脂外，在一定程度上能夠抑制炎癥反應(yīng)，在主動(dòng)脈瓣疾病治療中發(fā)揮積極作用[2]。本研究中HC組血液檢驗(yàn)結(jié)果示Hs-CRP顯著升高，免疫組化結(jié)果提示，炎性因子TNF-α及IL-6在瓣膜組織中顯著表達(dá)，而他汀干預(yù)下的AI組，上述兩因子的表達(dá)明顯低于HC組，同時(shí)Hs-CRP顯著降低，未見明顯鈣化及VIC化生，泡沫細(xì)胞的形成較少等。有研究已經(jīng)證明TNF-α和IL-6各自能夠通過上調(diào)清道夫受體的表達(dá)，來促進(jìn)氧化型膽固醇積累和泡沫細(xì)胞的形成，推進(jìn)病情發(fā)展，其中TNF-α在病變早期的炎癥反應(yīng)中起到重要作用，包括促進(jìn)鈣化、激活多種炎性因子等[12]，而IL-6的高表達(dá)可導(dǎo)致病變過程中磷酸鹽誘導(dǎo)的礦化[13]。相反，巨噬細(xì)胞在清道夫受體的幫助下，可以吞噬氧化型膽固醇并將其分解[14]，逆轉(zhuǎn)病變過程。由此我們推測，AI組高脂飲食干預(yù)同樣誘導(dǎo)兔主動(dòng)脈瓣膜發(fā)生了CAVD樣病理改變，巨噬細(xì)胞、炎性因子TNF-α及IL-6在CAVD發(fā)展過程中斑塊的形成、VIC向成骨細(xì)胞的化生及鈣化的形成三個(gè)環(huán)節(jié)中具有重要意義，而在應(yīng)用阿托伐他汀藥物干預(yù)后，泡沫細(xì)胞、炎性因子TNF-α和IL-6的表達(dá)以及血脂明顯降低，在一定程度上抑制了CAVD的發(fā)展進(jìn)程。目前CAVD病變的發(fā)生機(jī)制尚未明確，且用于治療心血管疾病的藥物對(duì)其治療效果往往與預(yù)期存在差距，因此其治療需要更精確的治療靶點(diǎn)[2]，希望本研究對(duì)CAVD機(jī)制的認(rèn)識(shí)及探索特異性治療靶點(diǎn)提供依據(jù)。

脂質(zhì)的沉淀及慢性炎癥反應(yīng)的發(fā)生均于病變早期便開始發(fā)生，而本實(shí)驗(yàn)中AI組與HC組同時(shí)進(jìn)行，這就意味著他汀干預(yù)是在病變初期，甚至是在未發(fā)生病變時(shí)便進(jìn)行干預(yù)，所以對(duì)于已經(jīng)發(fā)生的CAVD病變是否具有同樣治療效果、是否存在逆轉(zhuǎn)病變的療效還需要進(jìn)一步認(rèn)證。此外他汀的抗炎作用具體是通過何種基因表達(dá)、信號(hào)傳導(dǎo)通路等作用機(jī)制問題同樣還需進(jìn)一步研究明確。

隨著我國醫(yī)療水平和生活質(zhì)量的逐步提高，人口平均壽命不斷延長，鈣化性主動(dòng)脈瓣疾病已經(jīng)并且越來越成為威脅人類身體健康的心臟疾病，探索此類疾病的病因?qū)τ趯ふ腋佑行У闹委煵呗跃哂兄匾囊饬x[15]。本研究結(jié)果顯示他汀對(duì)于CAVD病變的治療作用是肯定的，同時(shí)希望本研究中提及的炎性因子，可以為進(jìn)一步探索CAVD特異性治療靶點(diǎn)提供依據(jù)。但由于本研究中他汀干預(yù)是在實(shí)驗(yàn)早期開始，我們認(rèn)為他汀干預(yù)對(duì)CAVD的影響，是自病變發(fā)生初期開始的治療作用，而對(duì)于已經(jīng)產(chǎn)生鈣化等中晚期病變是否有逆轉(zhuǎn)作用，尚待進(jìn)一步研究。