王曉光 李戈輝 齊曉非
腸道是對缺血最敏感的組織器官之一,小腸缺血再灌注還可引起遠隔器官損傷,而最常見是肺損傷[1],進而導(dǎo)致引起呼吸窘迫綜合征甚至危及生命。絲裂原活化蛋白激酶(mitogen-activated protein kinase, MAPK)通路是細胞內(nèi)重要的炎癥信號通路之一,大量的研究證明MAPK通路在腦、腸、腎等器官缺血再灌注損傷中起重要作用[2-4],p38是MAPK家族中的主要成員之一,有研究報道其參與急性肺損傷的發(fā)生和發(fā)展[5-6]。白藜蘆醇是臨床常用的一類植物抗毒素,具有如抗炎、抗氧化、抗腫瘤及抗微生物等作用。研究證實白藜蘆醇對小腸缺血-再灌注繼發(fā)肺損傷有保護作用,但其是否與p38mark通路而起到保護作用尚未報道。本研究擬通過復(fù)制大鼠小腸缺血-再灌注繼發(fā)肺損傷模型, 觀察白藜蘆醇對p38 MAPK通路的作用及其機制。
1.主要試劑 兔磷酸化p38 MAPK (phospho-p38MAPK) (Thr180/Tyr182)單克隆抗體和兔p38 MAPK多克隆抗體(美國Cell Signaling Technology公司),白藜蘆醇(深圳,賽克林公司),電化學(xué)發(fā)光(ECL)試劑盒(美國SantaCruz公司)。
2.動物及分組 SD大鼠購于廣東省醫(yī)學(xué)實驗動物中心。經(jīng)動物倫理委員會審批同意,取健康成年雄性,SD大鼠,36只,體質(zhì)量 210~230 g。隨機分為正常對照組、缺血再灌注組(IR組),缺血再灌注+白藜蘆醇預(yù)處理組(IRR組),每組12只。對照組為假手術(shù)組,進行開腹后不進行腸系膜動脈夾閉,45min后關(guān)腹; IRR組實驗前5d每天腹腔注射白藜蘆醇15mg/kg,IR組每天腹腔注射同樣劑量0.9%氯化鈉溶液。
圖1 肺組織HE染色 A:對照組;B:IR組;C: IR+白藜蘆醇組
3.復(fù)制大鼠小腸缺血-再灌注繼發(fā)肺損傷模型 末次給藥1h后,模型組及白藜蘆醇組大鼠按2 mL/kg腹腔注射3%戊巴比妥鈉麻醉。腹部剃毛備皮后,仰臥位固定,于腹部正中腹白線處開腹,分離腸系膜上動脈,根部用4號手術(shù)線活結(jié)結(jié)扎使之缺血,可見腸系膜血管顏色變淺,即為缺血成功,分層縫合肌肉和皮膚,活結(jié)線頭留于體外,缺血1 h后,將活結(jié)解開,恢復(fù)供血4 h后動物安樂死,取肺組織。缺血開始及再灌注開始時動物按20 mL/kg體質(zhì)量腹腔注射氯化鈉注射液進行補液。檢測項目。(1)肺濕干重比 取左上部分肺組織,0.9%氯化鈉溶液漂洗后,濾紙吸干,稱量濕重后,烘箱65℃烘干24h后再稱干重,計算濕重和干重比值。
(2)病理學(xué)觀察 取左下部分肺組織,4%中性甲醛固定后,常規(guī)石蠟包埋切片,HE染色觀察。
肺組織中IL-6、TNF-α的檢測:取右肺上、中葉,液氮急凍后-80℃保存,用于制備10%組織勻漿,ELASIA法檢測組織中IL-6、TNF-α的含量。
(3)肺組織中磷酸化p38 MAPK和總p38 MAPK表達水平的檢測 取右肺下、后葉,液氮急凍后-80℃保存,用于Western blot檢測肺組織中磷酸化p38 MAPK和總p38 MAPK的表達水平。
4.統(tǒng)計學(xué)處理 采用SPSS20.0統(tǒng)計軟件進行分析。計量資料以均數(shù)±標準差表示,三組間比較采用單因素方差分析,有差異者進行兩組間事后LSD檢驗。以P<0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。
1.肺濕干重和肺組織勻漿的的炎性因子表達IR組的W/ D水平于明顯高于對照組,差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05),給予白藜蘆醇預(yù)處理后可明顯降低 IR大鼠肺組織的W/D水平(P<0.05)。同樣,IR組TNF-α和IL-6表達增加(與對照組相比P<0.05),用白藜蘆醇預(yù)處理可以減少組TNF-α和IL-6表達(與IR組相比P<0.05,表1)
表1 肺組織W/D和肺組織炎性因子檢測
注:與對照組相比,*P<0.05;與IR組相比,#P<0.05
2.大鼠肺組織損傷病理學(xué)檢查(圖1)正常組肺組織結(jié)構(gòu)正常,肺泡邊緣清晰,沒有炎性滲出;IR組肺組織結(jié)構(gòu)破壞,肺泡壓閉實變,肺泡腔內(nèi)大量滲出液,間質(zhì)充血水腫,炎性細胞明顯增多;IR+白藜蘆醇組僅肺間隔輕度增寬,無明顯出血,少量炎性細胞浸潤,輕度水腫,較IR 組肺組織病理情況明顯改善。
3.Westernblot蛋白質(zhì)印跡法檢測肺組織磷酸化p38 MAPK蛋白水平(圖2)可見三組總的p38 MAPK水平?jīng)]有差異,但是磷酸化的p38 MAPK在IR組明顯增加,白藜蘆醇預(yù)處理可減少磷酸化P38 MAPK的表達。
圖2 蛋白質(zhì)印跡法檢測各組肺組織p38MAPK活化水平
本研究結(jié)果表明,腸缺血再灌注可引起肺組織損傷,而用白藜蘆醇預(yù)處理,可以減少肺組織損傷,并且白藜蘆醇預(yù)處理組磷酸化p38表達明顯減少,說明p38 MAPK通路參與了白藜蘆醇抗小腸缺血再灌注肺損傷的保護作用。
小腸缺血-再灌注產(chǎn)生局部組織損傷并損害腸粘膜的屏障功能,致使腸道細菌和內(nèi)毒素移位入血,可引起肺等遠隔部位損傷。白藜蘆醇能夠?qū)毙苑螕p傷有保護作用[7-8]。白藜蘆醇對急性肺損傷的保護機制是多方面的[9-11],但主要通過其抗氧化和抗炎作用來實現(xiàn);氧化應(yīng)激以及炎癥反應(yīng)的機制復(fù)雜,其中涉及多種自由基產(chǎn)生的級聯(lián)反應(yīng)及炎癥介質(zhì)的信號轉(zhuǎn)導(dǎo)過程。p38是MAPK家族中的主要成員之一,參與了細胞的生長、發(fā)育以及細胞間功能同步等多種生理過程,并與炎癥、應(yīng)激反應(yīng)的調(diào)控密切相關(guān),被認為是細胞信息傳遞的交匯點和共同通路[12]。 p38 MAPK 通過磷酸化被激活后,可進入細胞核,通過磷酸化而激活多種轉(zhuǎn)錄因子,對多種靶基因的表達進行調(diào)控,其中包括 IL-6、IL-1、TNF- α等促炎性細胞因子[13]。TNF-α 與 IL-6 是組織缺血再灌注損傷中重要的炎癥因子之一,其含量可間接反映組織損傷程度。在LPS刺激的單核細胞中,TNF-α和IL-1的產(chǎn)生與p38MAPK的活化密切相關(guān),抑制p38 MAPK的活化,能明顯地降低大鼠急性重癥胰腺炎所導(dǎo)致的AU的程度[14]。Aqrawal等[15]研究發(fā)現(xiàn),刺激人外周血B細胞后,可致細胞內(nèi) p38 MAPK 激活,抑制這一過程可減輕甚至完全阻斷細胞內(nèi)TNF- α等炎性細胞因子的產(chǎn)生,說明炎癥反應(yīng)中TNF-α 等炎性細胞因子的產(chǎn)生與p38 MAPK激活密切相關(guān)。實驗證實p38 MAPK活化后不僅可增強TNF-α等炎性細胞因子的表達,而且不斷增加的炎性細胞因子又通過正反饋,進一步促進 p38 MAPK的活化和表達,從而誘導(dǎo)各種凋亡調(diào)控因子的產(chǎn)生,導(dǎo)致組織細胞的凋亡和壞死,加重組織損傷。
大量的研究證明p38 MAPK在腦、腸、腎等器官缺血再灌注損傷中其重要作用,但關(guān)于其在肺缺血再灌注損傷中的“角色”尚無具體研究。本實驗中缺血再灌注組與假手術(shù)組相比,肺組織中的 TNF-α、IL-6 含量明顯增加;白藜蘆醇預(yù)處理組與缺血再灌注組相比,大鼠肺組織中的 TNF-α、IL-6 含量下降。這說明白藜蘆醇能減少大鼠缺血再灌注損傷的肺組織的炎癥因子,有一定的肺保護作用。本研究表明,白藜蘆醇預(yù)處理能使p38 MAPK表達減少,因此,p38 MAPK通路可能參與了其肺保護的作用。