于魯璐甄鳳亞韓冰安翠霞王學(xué)義王銘維

抑郁癥是影響個(gè)體社會(huì)功能的常見精神障礙之一，其發(fā)病機(jī)制尚不明確。鑒于炎癥在抑郁癥發(fā)病中的重要作用，抗炎已成為抑郁癥治療的新靶點(diǎn)[1]。丹參多酚酸是復(fù)方丹參的提取單體，具有明確的抗炎作用[2]。既往研究及本課題組前期研究表明，丹參多酚酸可以改善大鼠慢性應(yīng)激所致的抑郁樣行為和認(rèn)知損害[3-4]。本研究擬明確丹參多酚酸對(duì)抑郁樣大鼠腦內(nèi)細(xì)胞因子和糖皮質(zhì)激素系統(tǒng)的影響，并探討丹參多酚酸對(duì)抑郁癥的潛在療效及其機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物和分組雄性SD大鼠38只，體質(zhì)量180～220 g，單籠飼養(yǎng)，12 h/12 h晝夜循環(huán)，溫度（23±2）℃。所有操作符合河北醫(yī)科大學(xué)動(dòng)物倫理委員會(huì)規(guī)定。

按隨機(jī)數(shù)字表法將動(dòng)物分為5組：空白對(duì)照組（n=8），正常飼養(yǎng)大鼠，不給予應(yīng)激刺激和藥物；應(yīng)激對(duì)照組（n=7），應(yīng)激建立抑郁模型后注射生理鹽水；應(yīng)激氟西汀組（n=8），應(yīng)激建模后注射氟西汀20 mg/kg；應(yīng)激丹酚酸組（n=7），應(yīng)激建模后注射丹參多酚酸 40 mg/kg；應(yīng)激聯(lián)合組（n=8），應(yīng)激建模后聯(lián)合氟西汀和丹參多酚酸治療。

1.2 慢性溫和應(yīng)激建立大鼠抑郁模型采用慢性溫和應(yīng)激建立大鼠抑郁模型[4]。應(yīng)激方式包括禁食禁水10 h，晝夜顛倒，夾尾 1 min，斜籠，濕墊料，45℃游泳，水平搖晃1 h和束縛1 h。應(yīng)激組每天2種應(yīng)激，持續(xù)6周?？瞻讓?duì)照組正常飼養(yǎng)，不給予應(yīng)激刺激。

1.3 分組給藥注射用丹參多酚酸鹽（天津天士力之驕藥業(yè)有限公司，批號(hào)Z20110011），使用0.9%NaCl液配置為濃度4 mg/mL的溶液；氟西?。ㄈ毡緰|京化成工業(yè)株式會(huì)社，批號(hào)BODF0-DQ），使用0.9%NaCl液配置為濃度2 mg/mL的溶液。自第4周起，根據(jù)分組給予大鼠藥物（或0.9%NaCl液）治療，按照10 mL/kg體積注射，即丹參多酚酸40 mg/kg，氟西汀20 mg/kg（上述劑量通過(guò)前期強(qiáng)迫游泳預(yù)實(shí)驗(yàn)確定），每日1次，持續(xù)3周。至第6周末次應(yīng)激后24 h，斷頭處死大鼠，冰上快速取前額葉皮層及海馬組織待用。

1.4 細(xì)胞因子檢測(cè)采用多因子檢測(cè)試劑盒和Luminex FLEXMAP-3D系統(tǒng)檢測(cè)大鼠前額葉皮質(zhì)和海馬細(xì)胞因子白介素 1β（interleukin-1β，IL-1β）、白介素 2（interleukin-2，IL-2）、干擾素 γ（interferon-γ，IFN-γ）和腫瘤壞死因子 α（tumor necrosis factor-α，TNF-α）水平及皮質(zhì)酮水平。按照BCA蛋白定量試劑盒操作，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線圖并計(jì)算蛋白濃度。

1.5 mRNA和蛋白檢測(cè)采用RT-PCR檢測(cè)大鼠海馬和前額葉皮質(zhì)FK506結(jié)合蛋白（FK506 binding protein,Fkbp5）及核受體亞家族3C組成員1（nuclear receptor subfamily 3,group C,member 1，Nr3c1）基因mRNA及內(nèi)參基因ACTIN水平。反應(yīng)體系為 cDNA 模板液 2 μL，上游引物（10 μmol/L）0.5 μL，下游引物（10 μmol/L）0.5 μL，2×SYBR Mix 10 μL，H2O 7 μL。Fkbp5上游引物 5’-CGAGCCG TTTGTCTTTAGCC-3’，下游引物 5’-AGCCGTAAG CGTATTCTGGTTT-3’，片段長(zhǎng)度 122 bp。Nr3c1上游引物 5’-GAAACCTGCTCTGCTTTGCTCC-3’，下游引物 5’-CTCTTGGCTCTTCAGACCTTCCTTAG-3’，片段長(zhǎng)度199 bp。ACTIN上游引物 5’-GGAG ATTACTGCCCTGGCTCCTA-3’，下游引物 5’-GAC TCATCGTACTCCTGCTTGCTG-3’，片段長(zhǎng)度 150 bp。擴(kuò)增條件為 95℃預(yù)變性 3 min，95℃變性5 s，60 ℃退火 40 s，45個(gè)循環(huán)。 結(jié)果以 2-△△Ct法分析相對(duì)基因表達(dá)差異。

采用western blot法檢測(cè)FKBP5和糖皮質(zhì)激素受體（glucocorticoid receptor，GR）蛋白，BCA 法進(jìn)行蛋白定量，以RIPA裂解液調(diào)整蛋白樣本終濃度為4 mg/mL。配制8%分離膠，5%濃縮膠，每孔蛋白樣品上樣量20 μg。電泳時(shí)濃縮膠恒壓90 V，約20 min；分離膠恒壓120 V。用濕轉(zhuǎn)法轉(zhuǎn)膜，將膜完全浸沒(méi)于5%BSA-TBST中孵育1 h，4℃一抗孵育過(guò)夜，次日TBST洗膜后二抗孵育40 min，洗膜后ECL顯色。內(nèi)參蛋白使用GAPDH。

1.6 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法使用SPSS 21.0進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。細(xì)胞因子、皮質(zhì)酮水平、Fkbp5和Nr3c1mRNA及蛋白質(zhì)水平用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（x±s）描述，組間比較采用單因素方差分析，兩兩比較采用LSD法，所有大鼠細(xì)胞因子水平與皮質(zhì)酮的相關(guān)性采用Pearson相關(guān)分析。檢驗(yàn)水準(zhǔn)α=0.05，雙側(cè)檢驗(yàn)。

2 結(jié)果

2.1 前額葉皮質(zhì)和海馬細(xì)胞因子及皮質(zhì)酮水平各組動(dòng)物前額葉皮質(zhì) IL-1β （F=6.12，P＜0.01）和TNF-α（F=7.82，P＜0.01）水平差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。其中，應(yīng)激對(duì)照組前額葉皮質(zhì)IL-1β和TNF-α高于空白對(duì)照組、應(yīng)激氟西汀組、應(yīng)激丹酚酸組和應(yīng)激聯(lián)合組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（均P＜0.01），見表1。各組海馬 IFN-γ（F=4.11，P＜0.01）和 TNF-α（F=9.87，P＜0.01）水平差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。兩兩比較，應(yīng)激對(duì)照組海馬IFN-γ和TNF-α高于空白對(duì)照組、應(yīng)激氟西汀組、應(yīng)激丹酚酸組和應(yīng)激聯(lián)合組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（均P＜0.01），見表2。各組動(dòng)物前額葉皮質(zhì)和海馬IL-2和IFN-γ水平的差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（均P＞0.05），見表1與表2。

各組間前額葉皮質(zhì)（F=5.57，P＜0.01）和海馬（F=14.73，P＜0.01）皮質(zhì)酮水平的差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。其中，應(yīng)激對(duì)照組前額葉皮質(zhì)和海馬皮質(zhì)酮水平均高于空白對(duì)照組、應(yīng)激氟西汀組、應(yīng)激丹酚酸組和應(yīng)激聯(lián)合組，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（均P＜0.01）。 見表1與表 2。

相關(guān)分析顯示，前額葉皮質(zhì)IL-1β水平與皮質(zhì)酮水平呈正相關(guān)（r=0.34，P=0.04），海馬TNF-α水平與皮質(zhì)酮水平呈正相關(guān)（r=0.40，P=0.02）。

表1慢性應(yīng)激抑郁大鼠前額葉細(xì)胞因子和皮質(zhì)酮水平

表2慢性應(yīng)激抑郁大鼠海馬細(xì)胞因子和皮質(zhì)酮水平

2.2前額葉皮質(zhì)和海馬Fkbp5 mRNA及其蛋白表達(dá)各組大鼠前額葉皮質(zhì)Fkbp5mRNA表達(dá)量的差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（F=7.90，P＜0.01），海馬Fkbp5mRNA表達(dá)量差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義 （F=1.40，P=0.26）。應(yīng)激對(duì)照組前額葉皮質(zhì)Fkbp5mRNA表達(dá)量較空白對(duì)照組升高，且高于應(yīng)激氟西汀組、應(yīng)激丹酚酸組和應(yīng)激聯(lián)合組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義 （均P＜0.01）。 各組動(dòng)物前額葉皮質(zhì)（F=0.54，P=0.71）和海馬 （F=0.06，P=0.99）FKBP5蛋白表達(dá)的差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。見表3與圖1。

2.3 前額葉皮質(zhì)和海馬Nr3c1 mRNA及其蛋白表達(dá)各組動(dòng)物前額葉皮質(zhì)（F=1.40，P=0.26）和海馬（F=0.83，P=0.51）Nr3c1mRNA 表達(dá)量的差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。前額葉皮質(zhì)（F=1.23，P=0.32）和海馬（F=0.60，P=0.66）GR蛋白表達(dá)的差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。見表3與圖1。

3 討論

下丘腦—垂體—腎上腺軸（hypothalamic-pituitary-adrenal,HPA），功能異常[5]和炎癥激活[6]是抑郁癥發(fā)病中的關(guān)鍵因素。糖皮質(zhì)激素升高具有抗炎作用，兩種機(jī)制共存看似矛盾，實(shí)則相互關(guān)聯(lián)。HPA軸激活后促進(jìn)糖皮質(zhì)激素釋放，并伴有細(xì)胞免疫反應(yīng)增加[7]，同時(shí)細(xì)胞因子又能負(fù)反饋調(diào)節(jié)HPA軸功能。

無(wú)論是疾病發(fā)作期還是緩解期，均可見到抑郁癥患者皮質(zhì)醇水平異常[8]。皮質(zhì)醇分泌受HPA軸負(fù)反饋調(diào)控，GR功能下降可能是導(dǎo)致HPA軸負(fù)反饋異常的原因之一[9]。FKBP5高表達(dá)，會(huì)降低GR對(duì)糖皮質(zhì)激素的敏感度，減少GR向細(xì)胞核內(nèi)遷移[10]。既往研究發(fā)現(xiàn)，抑郁癥患者前額葉皮質(zhì)Fkbp5mRNA水平升高[11]，慢性應(yīng)激大鼠腦內(nèi)前額葉皮質(zhì)FKBP5蛋白表達(dá)增加，海馬區(qū)FKBP5蛋白表達(dá)無(wú)明顯變化[12]。本研究結(jié)果也顯示，抑郁大鼠前額葉皮質(zhì)Fkbp5mRNA表達(dá)上調(diào)。但與任慧聰?shù)萚13]發(fā)現(xiàn)抑郁大鼠海馬區(qū)GR蛋白及mRNA水平下降的結(jié)果不同，本研究?jī)H在應(yīng)激丹酚酸組發(fā)現(xiàn)前額葉皮質(zhì)Nr3c1mRNA表達(dá)下降。由于FKBP5蛋白僅對(duì)GR核內(nèi)遷移的動(dòng)力學(xué)有影響，卻不影響GR總蛋白的表達(dá)。因此，慢性應(yīng)激大鼠前額葉皮質(zhì)和腹側(cè)海馬胞漿GR蛋白表達(dá)水平增加，而核內(nèi)GR蛋白水平卻可能沒(méi)有變化[10]。

本研究結(jié)果顯示，應(yīng)激大鼠腦內(nèi)促炎細(xì)胞因子水平升高，丹參多酚酸可抑制炎癥反應(yīng)激活，并降低皮質(zhì)酮水平，此外，抗抑郁藥物氟西汀也顯示出與丹參多酚酸類似的效果。這與OHGI等[14]發(fā)現(xiàn)氟西汀和帕羅西汀等抗抑郁藥物可以逆轉(zhuǎn)脂多糖注射所致抑郁樣癥狀和TNF-α水平升高的研究結(jié)果一致，證實(shí)5-羥色胺再攝取抑制劑也具有抗炎作用，再次提示炎癥在抑郁癥發(fā)病中的重要作用。

圖1 各組大鼠前額葉皮質(zhì)和海馬FKBP5蛋白與GR蛋白電泳圖（western blot法）

表3慢性應(yīng)激抑郁大鼠Fkbp5 mRNA及其蛋白、Nr3c1 mRNA及GR蛋白相對(duì)表達(dá)量

本研究發(fā)現(xiàn)，應(yīng)激后糖皮質(zhì)激素及炎癥細(xì)胞因子變化存在相關(guān)性。炎癥反應(yīng)可以使糖皮質(zhì)激素水平增加，并誘導(dǎo)小膠質(zhì)細(xì)胞分泌促炎細(xì)胞因子，GR拮抗劑米非司酮可通過(guò)抑制小膠質(zhì)細(xì)胞激活，有效緩解IL-1β注射所致的大鼠抑郁樣癥狀，并降低炎癥激活反應(yīng)[15]。因此，以炎癥和/或糖皮質(zhì)激素為靶點(diǎn)的治療可改善軀體疾病患者的抑郁癥狀[16]，而糖皮質(zhì)激素及其受體的介導(dǎo)作用可能是抗炎藥物丹參多酚酸的潛在治療機(jī)制。

綜上，慢性應(yīng)激抑郁大鼠腦內(nèi)促炎細(xì)胞因子和皮質(zhì)酮水平增加，與GR調(diào)節(jié)密切相關(guān)的Fkbp5mRNA表達(dá)水平升高，抗炎藥物丹參多酚酸可以逆轉(zhuǎn)上述炎癥激活反應(yīng)和糖皮質(zhì)激素功能異常，這為以炎癥和HPA軸為靶點(diǎn)的抑郁癥治療補(bǔ)充了證據(jù)，并提供了新的治療方向與策略。本研究的不足之處主要在于未區(qū)分胞漿與核內(nèi)GR蛋白，且未探究其功能性改變；此外，本研究未檢測(cè)中樞與外周糖皮質(zhì)激素水平是否有一致性變化，仍需在未來(lái)研究中進(jìn)一步完善。