陳鐵戈，郭永強(qiáng)，王明，張東亮，夏亞一，汪靜，伍亞民，黨躍修，張海鴻

1.蘭州大學(xué)第二醫(yī)院骨科，甘肅蘭州市730030；2.甘肅省骨關(guān)節(jié)疾病重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，甘肅蘭州市730030；3.中國(guó)人民解放軍陸軍軍醫(yī)大學(xué)大坪醫(yī)院野戰(zhàn)外科研究所三室，創(chuàng)傷、燒傷與復(fù)合傷國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，重慶市400042

脊髓損傷后恢復(fù)一直是醫(yī)學(xué)界的難點(diǎn)與熱點(diǎn)，脊髓水腫是脊髓繼發(fā)性損傷非常重要的病理生理基礎(chǔ)，水腫、血腫及血管的擴(kuò)張使損傷后脊髓體積增加，脊髓內(nèi)壓增高，髓內(nèi)微循環(huán)障礙，加重缺血缺氧，最終導(dǎo)致脊髓液化壞死。

水通道蛋白4(aquaporins-4,AQP4)與K+離子通道4.1(potassium ion channel protein-4.1,Kir4.1)主要表達(dá)于星形膠質(zhì)細(xì)胞，參與損傷后水腫的形成與消散[1-3]。微管作為細(xì)胞骨架最重要的組成部分，見于所有真核細(xì)胞，其功能包括胞質(zhì)內(nèi)運(yùn)輸、細(xì)胞器定位、細(xì)胞形態(tài)與運(yùn)動(dòng)性的維持和改變[4]。有研究表明[5]，應(yīng)力作為刺激因子被細(xì)胞骨架感知，細(xì)胞骨架的改變可引起效應(yīng)酶及細(xì)胞膜離子通透性發(fā)生變化。我們推測(cè)，微管作為細(xì)胞骨架重要的組成部分，可能參與脊髓損傷后AQP4和Kir4.1的表達(dá)及水腫的形成。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物及分組

90只成年雌性Sprague-Dawley大鼠，體質(zhì)量220～250 g，由蘭州大學(xué)醫(yī)學(xué)部動(dòng)物中心提供。實(shí)驗(yàn)前2周飼養(yǎng)于實(shí)驗(yàn)室，自然晝夜采光，自由飲食飲水，室溫25℃。大鼠飼養(yǎng)及實(shí)驗(yàn)過程均遵守實(shí)驗(yàn)動(dòng)物管理及保護(hù)的有關(guān)規(guī)定。大鼠隨機(jī)分為假手術(shù)組(n=30)和損傷組(n=60)，損傷組再分為6 h、1 d、3 d、5 d、7 d五個(gè)亞組，每個(gè)亞組12只。實(shí)驗(yàn)大鼠依照實(shí)驗(yàn)動(dòng)物相關(guān)福利與倫理原則進(jìn)行處理。

1.2 主要試劑與儀器

RM2007 Allen打擊器：美國(guó)新澤西州大學(xué)。CM1950冰凍切片機(jī)：LEICA公司。Finesse325石蠟切片機(jī)：THERMO公司。熒光顯微鏡：OLYMPUS公司。α-Tubulin：EP1332Y，ab52866，美國(guó)ABCAM公司。AQP4：BF-9104，美國(guó)AFFINIT公司。Kir4.1：12503-1-AP，美國(guó)PROTEINTECH公司。小鼠抗大鼠GAPDH單克隆抗體：美國(guó)PROTEINTECH公司。兔SP試劑盒(SP-9001)、小鼠SP試劑盒(SP-9002)：北京中杉金橋生物技術(shù)公司。RIPA裂解液：碧云天公司。無毒環(huán)保蘇木精-伊紅(HE)染劑、BCA蛋白定量測(cè)試盒、PVDF膜：北京索萊寶科技公司。ECL發(fā)光液：美國(guó)MILLOPORE公司。

1.3 模型制作

動(dòng)物常規(guī)術(shù)前準(zhǔn)備，術(shù)前禁食12 h。1%戊巴比妥鈉40 mg/kg腹腔注射麻醉，待角膜反射消失、持針器夾持尾端無反應(yīng)表明麻醉成功。背部剃毛備皮，俯臥固定于手術(shù)臺(tái)；碘伏術(shù)區(qū)皮膚消毒。兩耳尖連線偏尾側(cè)三橫指處定位T10，以T10做3 cm背部正中切口，逐層分離筋膜及椎旁肌肉組織，暴露T9～T11椎體，咬除T9～T11椎板，仔細(xì)暴露T10脊髓，注意勿傷及硬脊膜。將實(shí)驗(yàn)組大鼠固定于Allen打擊器，調(diào)整打擊棒末端；使其對(duì)準(zhǔn)T10脊髓，打擊力度20 g×2.5 cm[6]，打擊后立即移開打擊棒，打擊棒與脊髓接觸時(shí)間1 s。

打擊成功表現(xiàn)為大鼠雙下肢痙攣性抽搐后癱軟，尾巴左右擺動(dòng)后下垂，被打擊部位脊髓表現(xiàn)為充血水腫。

兩組均用無菌生理鹽水沖洗傷口，逐層縫合肌肉和皮膚，用碘伏棉球擦拭手術(shù)傷口后將大鼠在復(fù)溫墊上復(fù)溫1 h后放回籠中。術(shù)后腹腔注射青霉素16萬U/d至術(shù)后3 d。按摩膀胱擠尿，每天3次至術(shù)后7 d。

1.4 脊髓含水量測(cè)定

造模后6 h、1 d、3 d、5 d、7 d，每個(gè)亞組各取3只大鼠，1%戊巴比妥鈉40 mg/kg腹腔注射麻醉后活取脊髓，取脊髓打擊部位上下各0.5 cm。取出后在微量天平上稱取濕重，將稱取濕重的脊髓用錫紙小心包好，放入恒溫烤箱，溫度調(diào)至80℃，烘烤48 h至恒重后取出[7]，稱取干重。

1.5 HE染色

造模后6 h、1 d、3 d、5 d、7 d，每個(gè)亞組各取3只大鼠，1%戊巴比妥鈉40 mg/kg腹腔注射麻醉，0.01 mmol/PBS 250 ml和4%多聚甲醛200 ml經(jīng)左心室快速灌注固定。取出損傷端脊髓組織(上下各0.5 cm)6～8 mm，4%多聚甲醛固定24 h，OCT包埋劑包埋，連續(xù)切片，厚度20 μm，HE染色，光鏡下觀察。

1.6 免疫組織化學(xué)染色

造模后6 h、1 d、3 d、5 d、7 d，每個(gè)亞組取3只大鼠，上述麻醉方法麻醉后，分別用0.01%mmol/PBS 250 ml和4%多聚甲醛250 ml經(jīng)左心室灌注固定。以損傷點(diǎn)為中心，頭端側(cè)和尾端側(cè)各延伸0.5 cm選取脊髓，取出后放入4%多聚甲醛，4℃冰箱中固定24 h，將組織修成合適大小后放入包埋盒進(jìn)行脫水，脫水后石蠟包埋，用預(yù)冷冰切機(jī)進(jìn)行切片，室溫脫蠟、水化。二甲苯1號(hào)10 min，二甲苯2號(hào)8 min，二甲苯3號(hào)8 min，無水乙醇5 min，90%乙醇3 min，80%乙醇3 min，70%乙醇3 min。96～98℃檸檬酸鈉熱抗原修復(fù)，滅活內(nèi)源酶活性后滴加山羊血清封閉液，室溫封閉10 min；甩掉封閉液滴加一抗α-Tubulin(1∶200)、AQP4(1∶200)、Kir4.1(1∶200)，4 ℃冰箱孵育過夜，室溫復(fù)溫，吸棄一抗，0.01 mol/L PBS清洗3次，雙蒸水清洗3次；選取合適SP試劑盒滴加二抗，室溫孵育10 min，PBS清洗3 min×3次，雙蒸水清洗3次；滴加鏈霉菌抗生物素-過氧化物酶溶液，室溫孵育10 min，PBS清洗3 min×3次，雙蒸水清洗3次；DAB溶液染色，顯微鏡下觀察，合適后終止，蘇木素復(fù)染后清洗，鹽酸酒精分化，脫水，中性樹膠封片后顯微鏡下觀察。

1.7 Western blotting

各亞組另取大鼠3只，麻醉后活取脊髓，立即放入液氮備用。稱量組織后以1∶10加入RIPA裂解液，玻璃研磨器研磨組織后超聲碎細(xì)胞儀破碎細(xì)胞，4℃、1200 r/min離心30 min，收集上清液，加入蛋白上樣緩沖液30 μl(1/3蛋白原液)，100℃煮沸5 min。BCA試劑盒測(cè)定蛋白濃度，于-80℃冰箱保存。

行10%SDS-PAGE電泳，濃縮膠80 V/30 min，分離膠120 V/60 min，將蛋白質(zhì)電轉(zhuǎn)至甲醛浸透的PVDF膜上，5%脫脂奶粉室溫封閉2 h，TBST洗滌，每次10 min，共3次；加兔抗大鼠α-Tubulin多克隆抗體 (1∶ 4000)、 AQP4 小 鼠 單 克 隆 抗 體 (1∶ 1000)、Kir4.1兔抗大鼠多克隆抗體(1∶500)、GAPDH小鼠抗大鼠單克隆抗體(1∶5000)，4℃冰箱過夜孵育。TBST洗滌，每次10 min，共3次；加辣根過氧化物酶標(biāo)記的山羊抗兔或抗小鼠lgG(1∶5000)，室溫下2 h；TBST洗膜10 min，共3遍；暗室曝光，滴加ECL發(fā)光液，X線膠片曝光，計(jì)算目的蛋白灰度值與內(nèi)參GAPDH蛋白灰度值之比。

1.8 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

采用SPSS 22.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。計(jì)量資料均用(xˉ±s)表示，多組間比較均采用方差分析。顯著性水平α=0.05。

2 結(jié)果

2.1 一般情況

假手術(shù)組蘇醒后即可活動(dòng)，無后肢功能障礙，無血尿尿儲(chǔ)留，無明顯腹部脹氣，排便困難。損傷組大鼠蘇醒后精神狀態(tài)較差，雙后肢運(yùn)動(dòng)功能完全喪失，鉗夾尾部無反應(yīng)，出現(xiàn)血尿尿儲(chǔ)留腹部腫脹等；部分大鼠出現(xiàn)血尿，每日按摩大鼠膀胱3次，協(xié)助其排尿。

2.2 脊髓含水量

與假手術(shù)組相比，損傷組損傷后6 h含水量即增加，3 d迅速增加，第5天達(dá)到高峰，且到第7天時(shí)略有下降(P＜0.05)。見表1。

2.3 脊髓各組HE染色

假手術(shù)組脊髓組織無損傷壞死及出血，結(jié)構(gòu)完整，灰質(zhì)白質(zhì)邊界清晰，細(xì)胞排列有序，細(xì)胞核形態(tài)正常。

損傷組急性脊髓損傷后6 h，脊髓灰質(zhì)和中央管開始出血，與白質(zhì)邊界不是很清晰，細(xì)胞間隙發(fā)生腫脹，神經(jīng)元腫脹；損傷后1 d，脊髓灰質(zhì)出血嚴(yán)重、結(jié)構(gòu)紊亂，細(xì)胞間隙腫脹較6 h明顯，神經(jīng)元較6 h相比減少，白質(zhì)也有少量出血；損傷后3 d，灰質(zhì)白質(zhì)壞死面積增大，細(xì)胞腫脹明顯，神經(jīng)元因腫脹加重發(fā)生細(xì)胞核固縮；損傷后5 d、7 d，脊髓灰白質(zhì)出血減少，結(jié)構(gòu)紊亂、壞死嚴(yán)重，有囊腔和空泡形成，神經(jīng)元和細(xì)胞水腫明顯，神經(jīng)元數(shù)量明顯減少。見圖1。

表1 各組脊髓含水量(%)

2.4 免疫組織化學(xué)染色和Western blotting

α-Tubulin在假手術(shù)組表達(dá)高于各損傷組，損傷組術(shù)后6 h與假手術(shù)組表達(dá)基本相同，1 d、3 d表達(dá)趨勢(shì)相似，但術(shù)后5 d表達(dá)明顯下降，到第7天時(shí)表達(dá)又有所回升。AQP4在假手術(shù)組脊髓組織中低度表達(dá)，主要分布于灰質(zhì)和中央管，損傷組損傷后6 h表達(dá)下降，1 d后表達(dá)略有升高，3 d后表達(dá)顯著增高，5 d時(shí)達(dá)到高峰，7 d略有下降，灰質(zhì)較白質(zhì)分布明顯，多定位于細(xì)胞膜處。Kir4.1表達(dá)趨勢(shì)與α-Tubulin相似，在假手術(shù)組表達(dá)高于各損傷組，術(shù)后6 h、1 d，Kir4.1表達(dá)略有下降，3 d表達(dá)下降較明顯，5 d表達(dá)量最低，7 d表達(dá)量又有所升高。見圖2～圖4、表2。

Western blotting表達(dá)情況同免疫組化染色。見圖5、表3。

表2 各組α-Tubulin、AQP4和Kir4.1陽性百分比(%)

圖1 各組脊髓HE染色(100×)

圖2 各組α-Tubulin免疫組織化學(xué)染色(400×)

圖3 各組AQP4免疫組織化學(xué)染色(400×)

圖4 各組Kir4.1免疫組織化學(xué)染色(400×)

圖5 各組Western blotting檢測(cè)

表3 各組α-Tubulin、AQP4和Kir4.1蛋白表達(dá)(Western blotting)

3 討論

脊髓損傷分為原發(fā)性損傷和繼發(fā)性損傷，繼發(fā)性損傷包括出血、水腫、炎癥及毒物的積累。其中，脊髓水腫是繼發(fā)性損傷的基礎(chǔ)；水腫、血腫及損傷部位血管的擴(kuò)張使局部脊髓體積增加，但因硬脊膜的存在使脊髓無代償空間，導(dǎo)致脊髓內(nèi)壓升高，髓內(nèi)微循環(huán)障礙，缺血缺氧更加嚴(yán)重，最終導(dǎo)致?lián)p傷局部脊髓液化壞死[8-9]。

水通道蛋白是機(jī)體重要的水調(diào)節(jié)蛋白，且AQP4主要分布于哺乳動(dòng)物中樞神經(jīng)系統(tǒng)，首次由Hasegawa等[10]在大鼠肺臟中發(fā)現(xiàn)。AQP4在脊髓中主要分布于脊髓灰質(zhì)、膠質(zhì)界膜的星形膠質(zhì)細(xì)胞以及由星形膠質(zhì)終足包繞的毛細(xì)血管部[11]。在中樞神經(jīng)系統(tǒng)中，Kir4.1與AQP4的表達(dá)存在相關(guān)性[12]，主要表達(dá)于脊髓中的星形膠質(zhì)細(xì)胞。在正常生理?xiàng)l件下，AQP4主要調(diào)節(jié)腦脊液的形成與吸收，Kir4.1通過對(duì)K+吸收影響滲透壓，從而調(diào)節(jié)水的運(yùn)輸。二者在調(diào)節(jié)水分布方面具有偶聯(lián)效應(yīng)[13]。但二者在中樞神經(jīng)損傷后的表達(dá)變化不同，有研究表明，脊髓損傷后在血源性水腫期AQP4表達(dá)會(huì)暫時(shí)下降，而隨著時(shí)間推移，表達(dá)逐漸增高，原因在于血源性水腫的消散依賴AQP4，而細(xì)胞毒性水腫由AQP4導(dǎo)致[14]。而Oklinski等[14]、Olsen等[15]和Najafi等[16]發(fā)現(xiàn)，脊髓損傷后會(huì)引起Kir4.1的廣泛性消失，最終導(dǎo)致脊髓水腫和脊髓空洞癥(post traumatic syringomyelia,PST)的形成，而PST被認(rèn)為是脊髓內(nèi)流體的流入與流出之間不平衡導(dǎo)致的。

細(xì)胞骨架蛋白作為細(xì)胞的“生命之柱”，廣泛存在于真核細(xì)胞，其主要由微管、微絲和中間絲組成。微管作為細(xì)胞骨架最重要的組成部分，主要由異二聚體α和β-Tubulin組成；涉及細(xì)胞形態(tài)變化，胞內(nèi)物質(zhì)運(yùn)輸及胞內(nèi)蛋白的表達(dá)[17]，同時(shí)還在組織內(nèi)環(huán)境信息與能量傳遞中起重要作用[5]。Ruschel等[18-19]發(fā)現(xiàn)，脊髓損傷后α-Tubulin的表達(dá)下降，在應(yīng)用微管解聚抑制劑后α-Tubulin表達(dá)增高，同時(shí)脊髓損傷大鼠后肢功能得以提高。Crunkhorn等[20]也認(rèn)為穩(wěn)定重塑微管可修復(fù)脊髓損傷。Zelinski等[21]和Akhmanova等[22]認(rèn)為，外力可導(dǎo)致微管解聚，表達(dá)下降，且隨著損傷加重表達(dá)降低。近年研究發(fā)現(xiàn)，應(yīng)用微管解聚劑可調(diào)節(jié)AQP1和AQP2在大鼠腎臟主細(xì)胞胞膜上的定位[23-25]，應(yīng)用秋水仙素解聚微管后，AQP1、AQP2在腎臟細(xì)胞中過表達(dá)，但對(duì)于α-Tubulin與AQP4和Kir4.1之間的關(guān)系尚無研究報(bào)道。

本研究發(fā)現(xiàn)，α-Tubulin與AQP4和Kir4.1對(duì)大鼠脊髓損傷后水腫的形成三者相互關(guān)聯(lián)。AQP4在大鼠脊髓損傷后6 h內(nèi)表達(dá)稍降低，從1 d開始表達(dá)逐漸增高，到5 d達(dá)到頂峰，于7 d稍有下降，而α-Tubulin和Kir4.1二者表達(dá)相似，即在假手術(shù)組中高表達(dá)，損傷后6 h表達(dá)略有下降，且在5 d表達(dá)最低，7 d表達(dá)略有回升?？梢钥闯靓?Tubulin與Kir4.1表達(dá)呈正相關(guān)，與AQP4表達(dá)呈負(fù)相關(guān)，且與脊髓損傷后脊髓含水量的形成相反。我們推測(cè)外力損傷作為機(jī)械刺激因子導(dǎo)致微管細(xì)胞骨架解聚降解，而微管的解聚擾亂正常細(xì)胞內(nèi)環(huán)境，導(dǎo)致胞內(nèi)蛋白表達(dá)和包膜蛋白定位發(fā)生改變，從而引起內(nèi)環(huán)境變化。

本研究證實(shí)，外力引起脊髓損傷時(shí)機(jī)械刺激因子導(dǎo)致微管解聚，作為胞內(nèi)蛋白運(yùn)輸通道的微管斷裂降解可能導(dǎo)致離子通道Kir4.1的表達(dá)下降和膜蛋白AQP4在胞膜的定位增加，從而導(dǎo)致水腫。

目前，針對(duì)脊髓損傷后水腫的治療尚無切實(shí)有效的辦法，甲潑尼龍因其嚴(yán)重的副作用現(xiàn)已被禁止用于脊髓損傷后的臨床治療[26]。我們推測(cè)，利用大鼠脊髓損傷后給予微管細(xì)胞骨架解聚抑制劑和微管聚合抑制劑，可進(jìn)行進(jìn)一步觀察三者的表達(dá)變化關(guān)系，探究損傷后脊髓水腫的原因。