張繼紅，馬存根

山西大同大學(xué)醫(yī)學(xué)院，山西大同市037009

長期食用高脂肪飲食引起的肥胖是急性缺血性腦卒中的獨立危險因素[1-2]。最近研究提示，肥胖與2型糖尿病、高血壓、神經(jīng)退行性疾病、脂質(zhì)紊亂和認(rèn)知障礙等相關(guān)[3-4]。肥胖是缺血性腦血管病患者功能恢復(fù)較差和死亡率增加的獨立預(yù)測因子[5]。在腦卒中中，新生血管的生成具有神經(jīng)保護作用，但在高脂飲食誘導(dǎo)2型糖尿病小鼠中，血管生成過多導(dǎo)致外周并發(fā)癥[6]。

Wnt蛋白是細胞因子分泌的糖蛋白，可調(diào)節(jié)神經(jīng)細胞增殖和分化，在成人中樞神經(jīng)系統(tǒng)發(fā)展中起重要作用。Wnt信號激活為新生神經(jīng)元向缺血損傷部位神經(jīng)細胞的分化和遷移提供了一個合適的環(huán)境，有助于功能恢復(fù)。此外，抑制Wnt信號可減少嚙類動物神經(jīng)元的形成，并損傷其識別能力[7-8]。在本研究中，我們探討肥胖對小鼠腦缺血性損傷后功能恢復(fù)的影響。此外，我們還檢測在腦卒中損傷和修復(fù)中發(fā)揮關(guān)鍵作用蛋白質(zhì)的表達，如去乙?；?sirtuin,Sirt1)、Wnt和凋亡誘導(dǎo)因子(apoptosis inducing factor,AIF)等。

1 材料與方法

1.1 實驗動物

60只雄性C57BL/6小鼠(8～10周)，購于山西醫(yī)科大學(xué)，動物許可證號SCXK(晉)2009-0001，體質(zhì)量20～25 g。小鼠存放在12 h光照和12 h黑暗的清潔環(huán)境中，溫度(22±1)℃，自由進食和飲水。在研究過程中對小鼠處理均按照國家頒布的《關(guān)于善待實驗動物的指導(dǎo)性意見》和山西大同大學(xué)醫(yī)學(xué)研究倫理委員會的要求嚴(yán)格執(zhí)行。

按照隨機數(shù)字表法將小鼠分為正常飲食組(n=30)和高脂飲食組(n=30)。每組再分別分為假手術(shù)組和模型組兩個亞組，每個亞組15只。正常飲食組以標(biāo)準(zhǔn)飼料配方飼養(yǎng)；高脂飲食組以高脂/高碳水化合物飲食飼養(yǎng)，高脂飲食主要包括20%蛋白、35%碳水化合物和45%脂肪(購于中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院實驗動物研究所)。飼養(yǎng)周期為3個月，然后檢測小鼠體質(zhì)量。

1.2 實驗試劑

2,3,5-氯化三苯基四氮唑(2,3,5-chlorinated three phenyl tetrazolium chloride,TTC)染料：美國SIGMA公司。兔源多克隆Sirt1、Wnt和AIF抗體：美國SANTA公司。

1.3 Lee指數(shù)

Lee指數(shù)用于評價小鼠肥胖程度的有效指數(shù)[9-10]。

其中體長指的是小鼠從鼻尖到肛門的長度。

1.4 大腦中動脈阻塞(middle cerebral artery occlusion,MCAO)模型及分組

小鼠飼養(yǎng)3個月后，采用腹腔注射1%戊巴比妥鈉0.06 g/kg麻醉小鼠，然后頸部剪毛，手術(shù)刀行1 cm左右的正中切口，再用止血鉗鈍性分離肌肉，充分暴露胸鎖乳突肌。在顯微鏡下可以觀察到左側(cè)頸動脈鞘，然后分離出頸總動脈、頸外動脈和頸內(nèi)動脈。然后用縫合線結(jié)扎頸總動脈近心端和頸外動脈遠心端，用針頭在頸外動脈遠端動脈壁上扎一個小口，將準(zhǔn)備好的線栓從頸外動脈小孔插入頸總動脈，通過頸內(nèi)動脈最后到達大腦中動脈，用縫合線固定線栓，然后縫皮。

假手術(shù)組僅分離頸部血管，不進行大腦中動脈梗阻，除不插入栓線外，其他手術(shù)操作步驟同模型組。

1.5 神經(jīng)行為學(xué)評分

造模后7 d，根據(jù)文獻提到的方法[11]，對模型組小鼠進行神經(jīng)行為學(xué)評分。觀察性評價指標(biāo)包括運動減少、拖地步態(tài)、姿勢側(cè)傾、共濟失調(diào)、抽搐、震顫和呼吸窘迫等。操作性評分指標(biāo)包括前肢屈曲、低反應(yīng)性、身體旋轉(zhuǎn)、肌肉強度降低和運動失調(diào)等。評估分值越高，神經(jīng)損傷程度越嚴(yán)重。

1.6 TTC染色

神經(jīng)行為學(xué)評分后，每亞組取5只小鼠迅速斷頭取腦，放入-20℃冰箱冷凍約15 min后，行冠狀切片，厚度1.5 mm。將切好的腦片迅速放入準(zhǔn)備好的1%TTC磷酸鹽緩沖液中，在37℃水浴中避光孵育10 min。腦梗死區(qū)域不染色(灰白色)，而正常腦組織染為深紅色。依據(jù)相關(guān)文獻報道[12]方法計算造模后腦梗死體積。

1.7 Western blotting

神經(jīng)行為學(xué)評分后，每亞組取5只小鼠迅速斷頭取腦，提取小鼠缺血大腦皮層蛋白，按10 ml/g比例加入全細胞裂解液Tris-Cl 50(pH 7.5)、乙二醇雙四乙酸、乙二胺四乙酸、二巰基蘇糖醇、Na4P2O7、岡田酸、高肽酶素、抑肽酶、胃酶抑素A、糜蛋白酶抑制素各5 mg/L，2%SDS。勻漿、超聲破碎，待組織細胞全部溶解后。BCA法進行蛋白定量，加入Loading Buffer制備成電泳樣品。取30 μg進行SDS-PAGE電泳，然后轉(zhuǎn)至PVDF膜上。經(jīng)5%牛奶孵育1 h后，并用磷酸鹽緩沖液洗膜3次，每次10 min。用兔源Sirt1、Wnt和AIF(1∶2000)和鼠抗β-actin多克隆抗體(1∶2000)4℃孵育3 h，PBS-T洗3次，每次10 min。用PBS-T稀釋山羊抗兔和山羊抗鼠的二抗(1∶25000)，室溫孵育1 h。PBS-T洗3次，每次5 min。利用化學(xué)發(fā)光掃描系統(tǒng)檢測相關(guān)蛋白表達并攝片，采用Quantity One圖像分析軟件對目標(biāo)條帶吸光度積值進行分析，以β-actin條帶吸光度積值做為參照，兩者比值為目標(biāo)蛋白的表達水平。

1.8 統(tǒng)計學(xué)分析

采用SPSS 20.0統(tǒng)計軟件進行分析，結(jié)果以(xˉ±s)表示。組間比較采用多因素方差分析或t檢驗。顯著性水平α=0.05。

2 結(jié)果

2.1 肥胖

與正常飲食組比較，高脂飲食組3個月后體質(zhì)量明顯增加(P＜0.01)，Lee指數(shù)增高(P＜0.05)。見表1。

表1 兩組飼養(yǎng)3個月后體質(zhì)量和Lee指數(shù)比較

2.2 神經(jīng)行為學(xué)評分

造模后7 d，與正常飲食組比較，高脂飲食組神經(jīng)行為學(xué)評分增加(P＜0.05)。見表2。

2.3 腦梗死體積

TTC結(jié)果顯示，兩組造模后腦梗死體積無顯著性差異(P＞0.05)。見表2和圖1。

2.4 Sirt1表達

無論是正常飲食還是高脂飲食，模型組Sirt1表達均低于假手術(shù)組(P＜0.05)。模型組中，高脂飲食小鼠Sirt1表達高于正常飲食小鼠(P＜0.05)。見表3、圖2。

2.5 Wnt表達

無論是正常飲食還是高脂飲食，模型組Wnt表達均明顯低于假手術(shù)組(P＜0.01)。模型組中，高脂飲食小鼠Wnt表達明顯低于正常飲食小鼠(P＜0.01)。見表4、圖3。

2.6 AIF核轉(zhuǎn)位表達

高脂飲食小鼠中，模型組AIF核轉(zhuǎn)位表達高于假手術(shù)組(P＜0.05)；在模型組中，與正常飲食小鼠比較，高脂飲食小鼠AIF核轉(zhuǎn)位表達增加(P＜0.05)。見表5、圖4。

圖1 兩組腦梗死體積比較(TTC染色)

表3 各組Sirt1表達比較

表4 各組Wnt表達比較

表5 各組AIF核轉(zhuǎn)位表達比較

圖2 各組Sirt1表達(Western blotting)

圖3 各組Wnt表達(Western blotting)

圖4 各組AIF核轉(zhuǎn)位表達(Western blotting)

3 討論

本研究結(jié)果顯示，與正常飲食小鼠相比，高脂飲食小鼠在缺血損傷后恢復(fù)減慢，神經(jīng)行為學(xué)評分增加。然而，正常飲食和高脂飲食小鼠缺血損傷后腦梗死體積無統(tǒng)計學(xué)差異。本研究還發(fā)現(xiàn)，高脂飲食飼養(yǎng)小鼠大腦皮層Sirt1表達增加。此外，高脂飲食飼養(yǎng)小鼠缺血損傷后Wnt表達幾乎消失。最后，高脂飲食飼養(yǎng)小鼠缺血損傷后AIF轉(zhuǎn)位細胞核明顯升高，這是細胞凋亡的一個重要途徑。這些結(jié)果表明，正常和高脂飲食小鼠MCAO后腦梗死體積無差異可能是由于Sirt1神經(jīng)保護作用；而高脂飲食飼養(yǎng)小鼠在MCAO后恢復(fù)減慢可能與Wnt信號通路減弱及AIF核轉(zhuǎn)位相關(guān)。

高飽和脂肪飲食與肥胖、2型糖尿病和代謝綜合征相關(guān)，但高飽和脂肪飲食對這些并發(fā)癥影響在人或動物模型中沒有被廣泛研究[13-14]。臨床和病理學(xué)研究均表明，由于肥胖引起的2型糖尿病患者血糖升高與嚴(yán)重的腦梗死和腦出血相關(guān)[15-16]。最近研究還表明，糖尿病可調(diào)節(jié)新生血管生成[17]。Sirt1可調(diào)節(jié)血管生成、血管舒張及血液供應(yīng)。叉頭框蛋白1(Forked frame protein 1,FOXO1)去乙?？墒筍irt1抑制內(nèi)皮細胞衰老，促進內(nèi)皮細胞生長，血管發(fā)芽，以及血管形成[18]。也有研究報道，Sirt1對高脂肪飲食后代謝紊亂的肌肉和肝臟具有保護作用[19-20]。然而，我們的研究首次發(fā)現(xiàn)，高脂飲食喂養(yǎng)小鼠大腦Sirt1表達增高，可能與血管生成和大腦重塑有關(guān)，從而導(dǎo)致正常飲食小鼠和高脂飲食小鼠MCAO后腦梗死體積無顯著差異。

經(jīng)典Wnt信號通路是哺乳動物中樞神經(jīng)系統(tǒng)發(fā)育、細胞增殖、分化和遷移至關(guān)重要的細胞外因素[21]。Wnt蛋白在胚胎發(fā)育、細胞分化和細胞生存中發(fā)揮作用[22]。最近研究表明，氧糖剝奪期間，Wnt1減少有助于細胞損傷、細胞凋亡和DNA降解[23]。Wnt可阻止神經(jīng)元退行性變性，因而阻斷Wnt可抑制神經(jīng)保護作用，影響神經(jīng)功能恢復(fù)[24]。本研究結(jié)果與以前的研究一致，缺血后Wnt介導(dǎo)腦神經(jīng)保護作用減弱，而且高脂飲食使Wnt表達幾乎消化，這可能是MCAO后神經(jīng)功能恢復(fù)減慢的主要原因。在腦發(fā)育以及神經(jīng)組織損傷中，細胞凋亡途徑起著重要作用[25]。AIF是一種非caspase依賴性細胞死亡因子，死亡信號可使其激活，從線粒體釋放并轉(zhuǎn)移到細胞核[26]。腦缺血后神經(jīng)元AIF核轉(zhuǎn)位，導(dǎo)致細胞凋亡。在本研究中，我們發(fā)現(xiàn)，高脂飲食喂養(yǎng)小鼠MCAO后由于AIF核轉(zhuǎn)位可能導(dǎo)致神經(jīng)元凋亡。

總之，本研究證實肥胖可影響小鼠缺血損傷后恢復(fù)。Wnt表達減少可能導(dǎo)致高脂飲食飼養(yǎng)小鼠MCAO后神經(jīng)功能恢復(fù)減慢。