龐 博 張 韌 張 奇 王 軒 程為平△

（1.黑龍江中醫(yī)藥大學(xué)，黑龍江 哈爾濱 150040；2.黑龍江省中醫(yī)科學(xué)院，黑龍江 哈爾濱150040）

癲癇是由多種病因?qū)е碌囊阅X部神經(jīng)元過度同步化放電為特征的神經(jīng)系統(tǒng)難治性疾病。癲癇發(fā)病機制復(fù)雜，其中因氧化應(yīng)激導(dǎo)致的一系列反應(yīng)是誘發(fā)癲癇乃至使病情進展的重要因素之一［1］，多余氧化應(yīng)激產(chǎn)物氧自由基的生成可以直接破壞蛋白質(zhì)等大分子、破壞細胞結(jié)構(gòu)甚至引起細胞凋亡［2］。因此如何抑制癲癇發(fā)病后的氧化應(yīng)激反應(yīng)是治療本病的關(guān)鍵。石甘散是由甘松、石菖蒲組成的抗癲癇基礎(chǔ)方，臨床應(yīng)用療效顯著。本研究通過觀察石甘散對戊四氮（PTZ）致癇大鼠海馬神經(jīng)元抗氧化應(yīng)激活性物質(zhì)及核因子E2相關(guān)因子2（Nrf2）抗氧化通路中關(guān)鍵因子Nrf2、血紅素加氧酶1（HO-1）的影響，觀察石甘散抗氧化應(yīng)激的作用，為癲癇的臨床治療提供理論依據(jù)。現(xiàn)報告如下。

1 材料與方法

1.1 實驗動物

120只清潔級雌性SD大鼠，體質(zhì)量（200±20）g，購自黑龍江中醫(yī)藥大學(xué)動物實驗中心，許可證號：2013A047，2014B008。飼養(yǎng)于SPF級動物實驗室，濕度50%～60%，室溫20～24℃。

1.2 實驗藥物

石甘散：由石菖蒲、甘松2味中藥按1∶1比例配置而成。 石菖蒲（1 g/包，等于 6 g 飲片）、甘松（1 g/包，等于10 g飲片）均為中藥配方顆粒 （江陰天江藥業(yè)生產(chǎn)）。根據(jù)成人與大鼠體表面積比換算，臨床中藥飲片常用劑量取15 g，換算成每只鼠每千克體質(zhì)量的藥量為：甘松組1.56 g/kg、石菖蒲組1.56 g/kg、石甘散組3.13 g/kg。上述顆粒藥物分別注入85℃蒸餾水，配成灌胃混懸液備用，質(zhì)量濃度分別是：甘松0.16 g/mL、石菖蒲0.16 g/mL，石甘散0.32 g/mL。丙戊酸鈉片：規(guī)格為0.2 g/片，產(chǎn)自山東仁和堂藥業(yè)有限公司（批號：H19983059），以羧甲基纖維素鈉（國藥集團化學(xué)試劑公司）充分溶解，配成質(zhì)量濃度為20 mg/mL的混懸灌胃液，4℃遮光保存。PTZ：購自美國Sigma公司（Sigma-P6500），于每次實驗前 30 min，取 300 mg PTZ晶體，充分溶解于0.9%氯化鈉溶液150 mL中，配置質(zhì)量濃度為2 mg/mL的PTZ溶液。

1.3 試劑與儀器

超氧化物歧化酶（SOD）試劑盒（批號：20160314）、丙二醛（MDA）試劑盒（批號：20160221）、谷胱甘肽過氧化物酶（GSH-Px）測試盒（批號：20160302），均購自南京建成生物工程有限公司。BCA蛋白定量試劑盒（C300120160221）、超強 RIPA 裂解液 C2501、5XSDS loading Buffer（S0137）、Trizol（B0201）、Golden 1st cDNA Synthesis Kit（D0401）均購自 HaiGene 公司，鼠抗β-actin單克隆抗體（A00702）購自金斯瑞生物有限公司，兔抗-Nrf2 抗體（bs-1074R）、兔抗-Heme Oxygenase 1抗體（bs-2075R）購自博奧森生物科技公司。

1.4 造模與分組

將SD大鼠適應(yīng)性飼養(yǎng)7 d，然后進行編號標記，按隨機數(shù)字表法抽取15只作為空白組，余鼠進行癲癇模型點燃。 在每天上午 9∶00～10∶00，予 PTZ 溶液 35 mg/kg腹腔注射，空白組予等量0.9%氯化鈉注射液腹腔注射。每次注射后觀察大鼠的行為變化，在造模周期28 d內(nèi)，連續(xù)5次出現(xiàn)Ⅱ級或Ⅱ級以上癇性發(fā)作為造模成功。按照Racine［3］制定的分級法判定癲癇發(fā)作程度：0級為不出現(xiàn)抽搐；Ⅰ級為局部面部肌肉抽搐，如咀嚼、眨眼或濕狗樣抖動等；Ⅱ級為有點頭動作為主要表現(xiàn)的頸部肌肉痙攣；Ⅲ級為單側(cè)前肢陣攣伴后肢無法站立；Ⅳ級為雙前肢陣攣抽搐伴后肢站立；Ⅴ級為全面發(fā)作，肢體反弓強直、抽搐、跌倒。剔除在造模周期內(nèi)未達到癇性發(fā)作等級要求和死亡的大鼠，將剩余造模成功大鼠隨機分配到模型組、西藥組、石菖蒲組、甘松組、石甘散組，每組12只。進行干預(yù)治療后，除去死亡大鼠，空白組剩余11只、模型組10只、西藥組11只、甘松組10只、石菖蒲組10只、石甘散組11只，其中每組隨機選取5只取樣用于氧化應(yīng)激產(chǎn)物蛋白測定，其余大鼠取樣進行Nrf2、HO-1因子的蛋白和mRNA測定。

1.5 干預(yù)方法

空白組和模型組給予0.9%氯化鈉注射液（10 mg/kg）每日2次灌胃，西藥組給予丙戊酸鈉溶液灌胃（350mg/kg），12 h 1 次；甘松組（0.16 g/mL）、石菖蒲組（0.16 g/mL）、石甘散組（0.32 g/mL）均每日灌胃相應(yīng)藥液2次。所有組別均灌胃給藥14 d。

1.6 標本采集與檢測

末次給藥結(jié)束后，以10%水合氯醛5 mL/kg腹腔注射麻醉，起效后固定大鼠，沿著腹中線剪開腹部，分離心臟和胸壁，使心臟位置充分暴露，在右心耳下剪一小口以引流并向左心室內(nèi)快速灌注0.9%氯化鈉注射液，之后以4%多聚甲醛溶液固定組織后將大鼠斷頭，經(jīng)顱前正中線剪開頭皮暴露顱骨，剪開枕骨，取腦組織于冰臺上，迅速剝離海馬及腦組織，馬上置于液氮中隨后轉(zhuǎn)移至-80℃冰箱保存。1.6.1 氧化應(yīng)激產(chǎn)物蛋白測定 將分離好的腦組織塊置于預(yù)冷的4℃0.9%氯化鈉溶液中浸洗，在冰浴下超聲破碎制成10%腦組織勻漿液，4℃低溫3000 r/min離心10 min，采用考馬斯亮藍檢測法測定腦組織SOD、MDA、GSH蛋白含量。1.6.2 Western blotting測定海馬組織Nrf2、HO-1蛋白表達 取海馬組織，按說明書提取全細胞、胞核和胞質(zhì)蛋白并測定蛋白含量。取蛋白樣品，SDS-PAGE電泳分離，150 V電泳完畢后進行轉(zhuǎn)膜，取轉(zhuǎn)膜結(jié)束的NC膜至10 mL Western信號增強劑中孵育15 min，將NC膜轉(zhuǎn)至封閉液5%脫脂奶粉中，室溫封閉1 h后TBST洗1次 （5 min），按照說明書推薦比例將一抗加入至Western一抗稀釋液中，混合均勻，4℃孵育過夜，TBST洗 3次 （每次 5 min）， 按 1∶5000比例將二抗加入Western二抗稀釋液中，室溫孵育30 min，二抗孵育結(jié)束后，TBST洗4次（每次5 min），超敏ECL顯色液顯影，以β-actin為內(nèi)參照，化學(xué)發(fā)光成像系統(tǒng)成像，以目的條帶的IOD值與β-actin條帶的IOD值的比值作為該蛋白的相對表達量。1.6.3 PCR法測定海馬組織 Nrf2、HO-1 mRNA表達取海馬組織，以TRIzol法提取總RNA，反轉(zhuǎn)錄至cDNA。Nrf2基因引物，上游序列5′-AGCACAGCCAACA CATTCTTC-3′。 下游序列：5′-TTGATGACCAGGACTC ACAGG-3′。擴增片段：133bp。HO-1 基因引物，上游序列：5′-TGGAAGAGGAGATAGAGCGAAAC-3′。 下游序列：5′-TGTGTGGCTGGTGTGTAAGG′， 擴增片斷 154 bp。 GAPDH 基因引物，上游序列：5′-AAGTTCAACGGCACAGTCAAG-3′。 下游序列：5′-TACTCAGCACCA GCATCACC-3′，擴增片段 119 bp。反應(yīng)體系 20 μL，Nrf2、HO-1、GAPDH 的 PCR 擴增條件為：95 ℃，15 min、95℃，10 s、60℃，30 s，40個循環(huán)。 取擴增產(chǎn)物進行瓊脂糖凝膠電泳，凝膠成像系統(tǒng)掃描，測定目的條帶的光密度值（OD），目的條帶OD值與GAPDH的OD比值代表目的基因表達強度。

1.7 統(tǒng)計學(xué)處理 應(yīng)用SPSS17.0統(tǒng)計軟件。計量資料以（±s）表示，采用單因素方差分析以及顯著性檢驗。方差齊時采用LSD法檢驗，方差不齊時進行轉(zhuǎn)換后再重復(fù)如上分析。P<0.05表示差異顯著，有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1 各組大鼠腦組織氧化應(yīng)激參數(shù)SOD、MDA、GSHPx含量比較 見表1。與空白組比較，模型組SOD、GSH-Px含量降低，MDA含量升高（均P<0.01），甘松組和石菖蒲組SOD、GSH-Px含量降低 （均P<0.01），MDA含量無統(tǒng)計學(xué)意義（P>0.05）；與模型組比較，各干預(yù)組SOD、GSH-Px含量均增加 （P<0.05或P<0.01），MDA 含量均降低（P<0.05）；與西藥組比較，甘松、石菖蒲組 SOD、GSH-Px 明顯降低（P<0.05），MDA無顯著改變 （P>0.05）， 石甘散組 SOD、GSH-Px與MDA差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P>0.05）；與甘松組、石菖蒲組比較，石甘散組 SOD、GSH-Px含量升高（P<0.05），MDA含量差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P>0.05）。

表1 各組大鼠腦組織氧化應(yīng)激參數(shù)比較（x±s）

2.2 各組大鼠海馬組織Nrf2、HO-1蛋白和mRNA表達比較 見表2、圖1、圖2。Western blotting檢測蛋白表達結(jié)果：與空白組比較，其余各組的Nrf2、HO-1蛋白表達均增加（P<0.05或P<0.01）；與模型組比較，西藥組、石甘散組的Nrf2、HO-1蛋白表達增加（P<0.05或P<0.01）；與西藥組比較，甘松組和石菖蒲組蛋白表達明顯下降（均P<0.01）；與甘松組和石菖蒲組比較：石甘散組Nrf2、HO-1蛋白表達顯著增加 （P<0.05或P<0.01）。RT-PCR檢測mRNA表達結(jié)果：與空白組比較，其余各組的Nrf2、HO-1 mRNA表達均增加（均P<0.05）；與模型組比較，西藥組、甘松組、石菖蒲組和石甘散組的Nrf2、HO-1 mRNA表達增加 （均P<0.05）；與西藥組比較，甘松組、石菖蒲組及石甘散組蛋白表達差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P>0.05）；與甘松組和石菖蒲組比較：石甘散組Nrf2、HO-1mRNA表達差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P>0.05），即西藥組、甘松組、石菖蒲組及石甘散組之間Nrf2、HO-1mRNA表達差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P>0.05）。

3 討 論

研究證實，癲癇發(fā)作會通過多種途徑導(dǎo)致神經(jīng)細胞死亡，如興奮性中毒引起線粒體功能障礙、氧化應(yīng)激反應(yīng)和一些遲發(fā)性細胞凋亡通路的激活等［4］。而氧化應(yīng)激以及其引起的神經(jīng)細胞死亡是誘發(fā)并導(dǎo)致癲癇反復(fù)發(fā)作的重要因素［5］。機制可能是過量生成的活性氧簇ROS增加了細胞間鈣離子濃度進而導(dǎo)致腦部神經(jīng)元的重塑、壞死和凋亡［6］。 SOD、GSH-Px 分別是存在人體內(nèi)超氧化物還原酶和過氧化物分解酶，具有清除自由基、還原有毒過氧化物的作用；MDA是自由基作用于脂質(zhì)發(fā)生氧化應(yīng)激的終產(chǎn)物，具有細胞毒性。本研究表明：戊四氮造模后大鼠海馬區(qū)域發(fā)生氧化應(yīng)激損傷，SOD、GSH-Px降低，MDA升高，丙戊酸鈉、甘松、石菖蒲和石甘散均能通過增加SOD、GSH-Px和降低MDA抑制氧化應(yīng)激損傷，丙戊酸鈉與石甘散抑制作用強于甘松、石菖蒲單獨應(yīng)用。此結(jié)果證實了甘松、石菖蒲具有抗氧化應(yīng)激損傷、清除自由基作用，組合應(yīng)用后效應(yīng)增強，與丙戊酸鈉比較無差異。

表2 各組大鼠海馬組織Nrf2、HO-1蛋白和mRNA表達比較（±s）

表2 各組大鼠海馬組織Nrf2、HO-1蛋白和mRNA表達比較（±s）

組別 n空白組 6模型組 5西藥組 6 Nrf2蛋白 HO-1蛋白 Nrf2 mRNA HO-1 mRNA 0.07±0.01 0.04±0.01 1.00±0.12 1.00±0.33 0.15±0.01* 0.11±0.02* 2.30±0.22* 2.97±0.42*1.00±0.30**## 1.00±0.17**## 5.85±0.57*# 5.53±0.65*#甘松組 5 0.28±0.03*△△ 0.33±0.17*△ 4.83±0.27*# 4.24±0.13*#石菖蒲組 5 0.19±0.02*△△ 0.18±0.08*△△ 4.22±0.22*# 415±0.53*#石甘散組 6 0.57±0.02*#☆★ 0.81±0.10**##☆★★ 5.04±0.46*# 5.28±0.14*#

圖1 Nrf2蛋白電泳條帶

圖2 HO-1蛋白電泳條帶

Nrf2是氧化還原敏感性轉(zhuǎn)錄因子，通過激活抗氧化應(yīng)答因子ARE介導(dǎo)的相關(guān)因子起到保護細胞的作用［7］，ARE 介導(dǎo)的 HO-1 是此反應(yīng)的關(guān)鍵抗氧化物酶［8］，正常狀態(tài)下Nrf2與Keap1形成復(fù)合物存在于胞漿，氧化應(yīng)激反應(yīng)發(fā)生后，Nrf2與Keap1解離進入細胞核并與ARE結(jié)合，抗氧化酶基因開始表達，如HO-1、GSH等，從而增強了細胞對氧化應(yīng)激損傷的抵抗性［9］。Nrf2/HO-1信號通路是氧化應(yīng)激反應(yīng)的重要細胞傳感通路［10］，激活此通路可以對減少由高糖引起的細胞凋亡起到關(guān)鍵性作用［11］。既往研究證實了左乙拉西坦能夠改善癲癇大鼠的認知功能，其機制可能是通過激活Nrf2-ARE通路，使HO-1、NQO1蛋白表達增多，起到抗癲癇的作用［12］。本研究表明，大鼠在戊四氮造模后，海馬組織內(nèi)Nrf2、HO-1蛋白表達和mRNA表達均增強，此現(xiàn)象為Nrf2/HO-1通路被進一步增強激活的標志。丙戊酸鈉、甘松、石菖蒲及石甘散均可繼續(xù)激活Nrf2/HO-1途徑，增加Nrf2、HO-1蛋白合成及mRNA表達，起到抗氧化應(yīng)激的保護作用。丙戊酸鈉與石甘散對于Nrf2、HO-1蛋白表達強于單用甘松、石菖蒲，mRNA間表達無差異，提示石甘散對Nrf2/HO-1通路具有加強激活作用，與丙戊酸鈉比較無差異。

石甘散是以甘松、石菖蒲為主要組方藥物的臨床經(jīng)驗處方。甘松有理氣止痛、開郁醒脾的功效，可治療胃痛、心悸、癇病等。甘松有效成分為甘松多糖，具有解痙、鎮(zhèn)痛、抗細胞氧化、抗菌等作用。現(xiàn)代藥理研究表明甘松多糖是具有強還原能力的天然抗氧化劑，能較好地清除羥基自由基、超氧陰離子自由基，發(fā)揮抗氧化活性［13］。丁莉等觀察甘松合并丙戊酸鈉治療癲癇的臨床療效，證實其可以有效控制癲癇發(fā)作頻次，減少腦電異常者人數(shù)，效果優(yōu)于單獨應(yīng)用丙戊酸鈉［14］。石菖蒲味辛，為宣氣通竅、芳香行散之品，主治癲狂、厥證、健忘、神昏等。石菖蒲中有效成分揮發(fā)油（主要為β-細辛醚、α-細辛醚）具有鎮(zhèn)靜催眠、抗驚厥、抗癡呆、抗衰老、抗抑郁及降脂抑菌等作用。既往研究證實了石菖蒲揮發(fā)油中β-細辛醚可直接透過血腦屏障，明顯延長士的寧驚厥小鼠的驚厥潛伏期，縮短驚厥持續(xù)時間，降低驚厥大鼠腦電圖頻率及波幅，能有效增加SOD含量，減少NO、Glu、Asp、Tau生成，起到抗氧化應(yīng)激的神經(jīng)保護作用［15］。

本研究證實了石甘散及其主要組成甘松、石菖蒲均具有抗癲癇大鼠氧化應(yīng)激損傷、清除自由基的作用，其起效機制可能是通過進一步激活Nrf2/HO-1通路，促進抗氧化應(yīng)激因子Nrf2及下游基因HO-1生成有關(guān)。本研究治療周期為14 d，屬于針對慢性癲癇點燃模型的研究，有研究證實非藥物干預(yù)下，Nrf2自身在急性癲癇模型（24 h）表達上調(diào)，具有抗氧化作用，進而保護神經(jīng)元［16］，后續(xù)研究應(yīng)重點觀察在此基礎(chǔ)上縮短及延長治療時間后其抗氧化應(yīng)激效應(yīng)的改變。