張世勇，王明華，邊文冀，王 江，鐘立強(qiáng)，陳校輝*

(1 江蘇省淡水水產(chǎn)研究所，南京 210017；2 江蘇省農(nóng)業(yè)種質(zhì)資源保護(hù)與利用平臺(tái)，南京 210014；3 江蘇農(nóng)牧科技職業(yè)學(xué)院，泰州 225300)

斑點(diǎn)叉尾鮰(Ictalurespunctatus)亦稱(chēng)美洲鯰、溝鯰，原產(chǎn)于美國(guó)，自1984年引入我國(guó)以來(lái)，已推廣到湖北、四川、重慶、江蘇、安徽等 20 多個(gè)省市，養(yǎng)殖規(guī)模和產(chǎn)量逐年增加，已成為我國(guó)重要的出口魚(yú)類(lèi)[1-2]。我國(guó)斑點(diǎn)叉尾鮰在長(zhǎng)期養(yǎng)殖過(guò)程中缺乏系統(tǒng)選育，再加上美國(guó)對(duì)種源出口的限制，出現(xiàn)了較為嚴(yán)重的種質(zhì)退化現(xiàn)象，最為直接的影響就是病害現(xiàn)象頻頻暴發(fā)。小瓜蟲(chóng)病在我國(guó)斑點(diǎn)叉尾鮰苗種階段的發(fā)病率較高，是目前國(guó)內(nèi)外最為棘手的魚(yú)類(lèi)疾病之一。據(jù)美國(guó)2002年水產(chǎn)統(tǒng)計(jì)數(shù)據(jù)，受小瓜蟲(chóng)病影響損失量在900kg以上的苗種生產(chǎn)企業(yè)占到總生產(chǎn)企業(yè)數(shù)的42%[3]，至今國(guó)內(nèi)外仍沒(méi)有有效的治愈小瓜蟲(chóng)病的藥物和措施。

眾多研究人員在不斷地探索研究中發(fā)現(xiàn)相對(duì)有效的藥物主要有孔雀石綠、亞甲基藍(lán)、甲醛、辣椒素[4-5]?？兹甘G、亞甲基藍(lán)等藥物具有明顯的致癌作用，已被世界眾多國(guó)家列為水產(chǎn)禁用藥。最新研究發(fā)現(xiàn)，從中草藥中提取的桑黃酮(Kuwanons)[6]、直立白薇甙(Cynatratoside-C)[7]、白屈菜赤堿(Chelerythrine)和茵芋堿(Chloroxylonine)[8]等藥物具有較好地殺滅小瓜蟲(chóng)掠食體的作用，但因其高昂的成本很難應(yīng)用于實(shí)際的防治過(guò)程中。因此，在養(yǎng)殖過(guò)程中用到最多且相對(duì)有效的防治藥物主要有甲醛、硫酸銅與硫酸亞鐵合劑、辣椒素以及敵百蟲(chóng)等。本試驗(yàn)旨在探討不同劑量的甲醛、硫酸銅與硫酸亞鐵合劑和敵百蟲(chóng)對(duì)斑點(diǎn)叉尾鮰幼魚(yú)的急性毒性，以期為預(yù)防和治療斑點(diǎn)叉尾鮰小瓜蟲(chóng)病以及其他水產(chǎn)疾病科學(xué)用藥提供指導(dǎo)。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物

2016年9月，從江蘇省淡水水產(chǎn)研究所揚(yáng)中基地6—7月繁育的44個(gè)斑點(diǎn)叉尾鮰家系中隨機(jī)挑選體重為20.0—30.0 g的健康幼魚(yú)1 000尾于室內(nèi)水槽中暫養(yǎng)一周，暫養(yǎng)期間水溫為27.0—28.0 ℃，pH 7.8—8.2，溶解氧質(zhì)量濃度>5 mgL，光照200—1 200 lx，試驗(yàn)期間不進(jìn)行投喂。

1.2 藥物

甲醛為分析純，含量37.0%—40.0%，色度≤15黑曾單位，購(gòu)自上海久億化學(xué)試劑有限公司。硫酸銅與硫酸亞鐵均為分析純，使用時(shí)按 5∶2比例混合，兩種藥品均購(gòu)自國(guó)藥集團(tuán)股份有限公司。敵百蟲(chóng)購(gòu)自山西康潔藥業(yè)有限公司，有效成分質(zhì)量分?jǐn)?shù)≥90%。

1.3 方法

試驗(yàn)全程在室內(nèi)進(jìn)行，使用養(yǎng)殖容量為150 L的塑料缸，試驗(yàn)用水為經(jīng)曝氣處理24 h的自來(lái)水，pH在7.7—8.0，硬度為250 mgL (以CaCO3計(jì))，溶解氧質(zhì)量濃度>5.0 mgL，光照200—1 200 lx，水溫(25±1 )℃，每個(gè)塑料缸飼養(yǎng)斑點(diǎn)叉尾鮰幼魚(yú)30尾，各放置一個(gè)充氣頭。

采用靜態(tài)急性毒性方法進(jìn)行試驗(yàn)。在正式試驗(yàn)開(kāi)始前進(jìn)行48 h預(yù)試驗(yàn)，根據(jù)常用魚(yú)病防治用量進(jìn)行調(diào)整，觀察斑點(diǎn)叉尾鮰幼魚(yú)的活動(dòng)以及存活狀況，并進(jìn)行記錄，得出正式試驗(yàn)藥物使用區(qū)間。每組試驗(yàn)設(shè)置5個(gè)濃度組以及1個(gè)對(duì)照組，每組3個(gè)重復(fù)，濃度梯度按照等對(duì)數(shù)間距設(shè)置。試驗(yàn)藥品先配置母液，溶劑為純凈水。使用時(shí)根據(jù)實(shí)際用量逐步稀釋使用，每24 h更換試驗(yàn)藥液一次。試驗(yàn)開(kāi)始后進(jìn)行連續(xù)觀察，記錄24 h、48 h、96 h后斑點(diǎn)叉尾鮰幼魚(yú)的存活情況并及時(shí)撈出死亡個(gè)體。實(shí)驗(yàn)魚(yú)死亡標(biāo)準(zhǔn)為對(duì)玻璃棒觸碰無(wú)任何反應(yīng)。

1.4 統(tǒng)計(jì)分析

不同時(shí)間段斑點(diǎn)叉尾鮰幼魚(yú)的半致死濃度(Half-lethal concentration，LC50)分別按照Karber’s法和Turubell公式計(jì)算：lgLC50=XK- a∑(Pi+Pi+1)；SC=B×0.3(CB)2

(1)

式中：LC50是半致死質(zhì)量濃度，mgL；XK是最大劑量的對(duì)數(shù)，a是相鄰劑量比值的對(duì)數(shù)，Pi、Pi+1是各劑量組的死亡率(%)；SC是安全質(zhì)量濃度，mgL；B是48 h的LC50，mgL；C是24 h的LC50，mgL。

2 結(jié)果與分析

2.1 甲醛對(duì)斑點(diǎn)叉尾鮰幼魚(yú)的急性毒性研究

甲醛急性中毒的實(shí)驗(yàn)魚(yú)表現(xiàn)為亂竄、不安穩(wěn)、浮頭，后期身體側(cè)翻失去平衡，最終死亡。兩組低質(zhì)量濃度組的實(shí)驗(yàn)魚(yú)活動(dòng)情況與對(duì)照組相似，實(shí)驗(yàn)魚(yú)大多靜伏于實(shí)驗(yàn)箱底部，少數(shù)緩慢游動(dòng)。甲醛為較低質(zhì)量濃度(10.0 mgL和17.8 mgL)時(shí)，歷經(jīng)96 h實(shí)驗(yàn)魚(yú)的死亡率為0；中等質(zhì)量濃度(31.6 mgL)時(shí)，歷經(jīng)28 h出現(xiàn)死亡現(xiàn)象；最高質(zhì)量濃度(100.0 mgL)時(shí)，歷經(jīng)24 h的死亡率達(dá)100%。實(shí)驗(yàn)魚(yú)死亡前均出現(xiàn)鰓蓋擴(kuò)張，鰓絲淤血且邊緣發(fā)白，體表粘液大量分泌的現(xiàn)象。數(shù)據(jù)分析得出：甲醛對(duì)斑點(diǎn)叉尾鮰幼魚(yú)24 h的半致死質(zhì)量濃度為74.51 mgL，48 h的半致死質(zhì)量濃度為49.20 mgL，安全質(zhì)量濃度為6.45 mgL(表1)。

2.2 敵百蟲(chóng)對(duì)斑點(diǎn)叉尾鮰幼魚(yú)的急性毒性研究

在試驗(yàn)中觀察到實(shí)驗(yàn)魚(yú)進(jìn)入較高濃度組和高濃度組試驗(yàn)液后，幾分鐘即處于半昏迷狀態(tài)，浮于水面不動(dòng)，對(duì)刺激有反應(yīng)，反應(yīng)遲鈍，體色變淺，體表粘液分泌增多。斑點(diǎn)叉尾鮰幼魚(yú)死亡時(shí)，身體均彎曲；存活的實(shí)驗(yàn)魚(yú)應(yīng)激反應(yīng)強(qiáng)烈。敵百蟲(chóng)為最低質(zhì)量濃度(1.00 mgL)時(shí)，歷經(jīng)96 h死亡率為0；較低質(zhì)量濃度(3.16 mgL)時(shí)，歷經(jīng)10 h出現(xiàn)死亡，歷經(jīng)96 h仍保持較低的死亡率；較高質(zhì)量濃度(5.62 mgL)時(shí)，各時(shí)段死亡率均急劇上升；最高質(zhì)量濃度(10.00 mgL)時(shí)，歷經(jīng)24 h的死亡率達(dá)100%。數(shù)據(jù)分析得出：敵百蟲(chóng)對(duì)斑點(diǎn)叉尾鮰幼魚(yú)24 h的半致死質(zhì)量濃度為5.58 mgL，48 h的半致死質(zhì)量濃度為3.84 mgL，安全質(zhì)量濃度為0.54 mgL(表2)。

表1 甲醛對(duì)斑點(diǎn)叉尾鮰幼魚(yú)的急性毒性結(jié)果

表2 敵百蟲(chóng)對(duì)斑點(diǎn)叉尾鮰幼魚(yú)的急性毒性結(jié)果

2.3 硫酸銅與硫酸亞鐵合劑對(duì)斑點(diǎn)叉尾鮰幼魚(yú)的急性毒性研究

表3 硫酸銅與硫酸亞鐵合劑對(duì)斑點(diǎn)叉尾鮰幼魚(yú)的急性毒性結(jié)果

3 討論與結(jié)論

安全濃度為水體中含有藥物最高允許濃度，水產(chǎn)養(yǎng)殖水體藥物安全濃度問(wèn)題一直受到國(guó)內(nèi)外有關(guān)部門(mén)的注意。這不僅考慮到養(yǎng)殖水體中水生動(dòng)物的存活問(wèn)題，而且直接或間接影響到人、畜禽等的健康。研究養(yǎng)殖水體藥物安全濃度對(duì)于指導(dǎo)水產(chǎn)養(yǎng)殖業(yè)安全生產(chǎn)具有重要意義。

甲醛是原漿毒物質(zhì)，能與蛋白質(zhì)結(jié)合，溶解類(lèi)脂，具有強(qiáng)烈的殺菌作用，是強(qiáng)烈的殺菌劑，在安全的使用范圍內(nèi)可以很好地應(yīng)用于水產(chǎn)養(yǎng)殖過(guò)程中細(xì)菌類(lèi)、真菌類(lèi)和寄生蟲(chóng)類(lèi)疾病的預(yù)防和治療。本試驗(yàn)得出的安全質(zhì)量濃度為6.45 mgL，與長(zhǎng)吻鮠(6.6 mgL)[9]以及麥周明[10]得出的斑點(diǎn)叉尾鮰安全濃度較為一致。在目前已見(jiàn)的相關(guān)報(bào)道中，甲醛是水產(chǎn)養(yǎng)殖上預(yù)防和治療寄生蟲(chóng)和真菌類(lèi)疾病的理想藥物，可以較為有效地預(yù)防和治療斑點(diǎn)叉尾鮰小瓜蟲(chóng)病和水霉病。在水霉病的防治方面，目前普遍使用15—30 mgL的甲醛溶液進(jìn)行全池潑灑，用藥后可基本控制病情的蔓延；嚴(yán)重時(shí)可3 d后重復(fù)潑灑，能夠達(dá)到有效的治療。治療小瓜蟲(chóng)時(shí)，一般采用30 mgL的甲醛溶液進(jìn)行全池潑灑，每天潑灑一次，連用5 d，可有效控制小瓜蟲(chóng)病。

敵百蟲(chóng)屬于有機(jī)磷殺蟲(chóng)劑，其殺蟲(chóng)機(jī)理是將膽堿酯酶的活性位點(diǎn)磷酸化從而抑制其活性，最終使神經(jīng)機(jī)能停止以達(dá)到殺蟲(chóng)的作用。本試驗(yàn)得出的安全質(zhì)量濃度為0.54 mgL，低于王武等[11]和黃琪琰[12]推薦的治療吸蟲(chóng)和甲殼綱寄生蟲(chóng)的潑灑濃度，高于麥周明[10]與張小立等[13]推薦的安全濃度，究其原因可能是其試驗(yàn)所選實(shí)驗(yàn)魚(yú)規(guī)格偏小，耐受力較低。敵百蟲(chóng)在弱堿性條件下，可形成殘毒性更大的敵敵畏，當(dāng)pH為8—10時(shí)，敵百蟲(chóng)轉(zhuǎn)變成敵敵畏僅需0.5 h，因此使用時(shí)不僅需要控制好劑量，還需要在使用前對(duì)水體pH進(jìn)行測(cè)定，以防不當(dāng)操作對(duì)養(yǎng)殖魚(yú)類(lèi)和使用者造成傷害。

硫酸銅與硫酸亞鐵合劑在殺滅體外寄生蟲(chóng)時(shí)硫酸銅起主要的作用，而硫酸亞鐵主要起著輔助藥物的作用，通常用來(lái)輔助硫酸銅殺滅一些比較難以殺滅的寄生蟲(chóng)[14]。本試驗(yàn)得出的安全質(zhì)量濃度為0.77 mgL，較張小立等[13]得出的安全質(zhì)量濃度(0.4446 mgL)略高，究其原因可能是本試驗(yàn)所選取實(shí)驗(yàn)魚(yú)規(guī)格較大，耐受力較高。影響硫酸銅殺滅病原體能力的因素有很多，如水溫、硬度、pH和水體有機(jī)物含量等。pH越高、水中的有機(jī)物越多，硫酸銅的毒性就會(huì)越小，反之越大[15]。因此，在使用硫酸銅硫酸亞鐵合劑的時(shí)候一定要考慮到各個(gè)方面的因素，嚴(yán)格控制硫酸銅的含量，以控制毒性。硫酸銅在魚(yú)體內(nèi)過(guò)量積累能夠抑制抗氧化酶活性，從而引起魚(yú)類(lèi)腎組織壞死、破壞造血組織等[16]。除此之外，銅離子還能夠殘留于鰓、肌肉等組織內(nèi)，影響魚(yú)正常的攝食和生長(zhǎng)，所以切勿過(guò)于頻繁使用硫酸銅。

本試驗(yàn)表明，甲醛、敵百蟲(chóng)、硫酸銅與硫酸亞鐵合劑(5∶2)對(duì)斑點(diǎn)叉尾鮰幼魚(yú)24 h的半致死質(zhì)量濃度為74.51 mgL、5.58 mgL、6.97 mgL，48 h的半致死質(zhì)量濃度為49.20 mgL、3.84 mgL、4.99 mgL，安全質(zhì)量濃度為6.45 mgL、0.54 mgL、0.77 mgL。三種藥物毒性大小依次為敵百蟲(chóng)、硫酸銅與硫酸亞鐵合劑(5∶2)、甲醛。本研究結(jié)果可為預(yù)防和治療斑點(diǎn)叉尾鮰小瓜蟲(chóng)病及其他疾病提供指導(dǎo)。