李水根，關(guān) 媛，李記開，劉秀云，李秀芬，朱建軍*

(1上海市農(nóng)業(yè)科學(xué)院林木果樹研究所，上海，201403；2上海農(nóng)林職業(yè)技術(shù)學(xué)院，上海，201600)

六道木為忍冬科(Caprifoliaceae)六道木屬(Abelia)灌木，由于樹干生長時(shí)有六道凹槽，加工成珠子后具有六道白邊，故名六道木[1]。大花六道木(Abeliagrandiflora)是六道木中較早出現(xiàn)的園藝種，為半常綠矮化灌木，由中國的糯米條(A.chinensis)和單花六道木(A.uniflora)雜交而成，后經(jīng)國外育種，形成了一些更有特色的園藝品種[2]，目前國內(nèi)已有引進(jìn)，但數(shù)量非常有限。大花六道木生長快，枝條柔順下垂，樹姿婆娑，株型非常美麗[2-3]。每年從初夏至仲秋都是大花六道木的盛花期，花量大且花期長，開花時(shí)節(jié)滿樹白花，晶瑩剔透，襯以粉紅的花萼、墨綠的葉片，分外醒目[4]。即使白花凋謝，紅色的花萼還可宿存至冬季，連片種植時(shí)極為壯觀。大花六道木根系發(fā)達(dá)，對土壤和肥力的要求不高，耐干旱、貧瘠和鹽堿，萌蘗力、萌芽力很強(qiáng)，同時(shí)可反復(fù)修剪。大花六道木園林用途廣泛，適宜叢植、片植于空曠地塊、水邊或建筑物旁。既可修成規(guī)則球狀列植于道路兩旁，或做花籬，也可自然栽種于巖石縫中、林中樹下[5]。華東、西南及華北可露地栽培，是庭院綠化觀賞和園林綠化設(shè)計(jì)的優(yōu)良樹種[6]。

雖然大花六道木的品種繁多，觀賞效果極佳，但由于其種子小，不易收獲，部分觀賞品種幾乎不結(jié)種子，只能通過扦插繁殖[7]，繁殖時(shí)需要大量的母株插條，繁殖系數(shù)低且費(fèi)時(shí)費(fèi)力。目前，國內(nèi)外對六道木組織培養(yǎng)的研究較少，根據(jù)已有文獻(xiàn)報(bào)道，以前的組織培養(yǎng)方法均是通過培養(yǎng)具有生長點(diǎn)的莖段直接誘導(dǎo)器官發(fā)生的方式獲得無菌苗[8-10]，然后通過無菌短枝扦插或叢生芽的方式實(shí)現(xiàn)植株擴(kuò)繁增殖，此方法增殖系數(shù)為每30 d增殖2.8倍左右[8]。大花六道木葉片誘導(dǎo)愈傷發(fā)生較容易，但愈傷難以分化成不定芽[9-10]。在生根培養(yǎng)時(shí)植株基部又容易產(chǎn)生愈傷組織，導(dǎo)致生根困難。本試驗(yàn)主要對大花六道木葉片不定芽誘導(dǎo)和生根培養(yǎng)進(jìn)行研究，從而實(shí)現(xiàn)大花六道木的離體再生和規(guī)?；敝?。

1 材料與方法

1.1 材料及外植體消毒

以上海市農(nóng)業(yè)科學(xué)院奉浦院區(qū)苗圃栽培的大花六道木為試驗(yàn)材料，于2017年4月份采集剛展開的幼嫩葉片。于自來水水龍頭流水下沖洗1—2h，轉(zhuǎn)入超凈工作臺進(jìn)行消毒，體積分?jǐn)?shù)為75%的酒精浸泡1 min，質(zhì)量分?jǐn)?shù)為0.1%的升汞消毒5—10 min，消毒過程中不斷搖晃使消毒液充分浸泡材料，然后用無菌蒸餾水沖洗至少5遍，用無菌吸水紙吸干多余的液體后備用。

1.2 不定芽誘導(dǎo)及叢生芽增殖

將消毒好的葉片剪成約1 cm2的小方塊，葉片近軸面朝上接種于不定芽誘導(dǎo)培養(yǎng)基上，不定芽誘導(dǎo)培養(yǎng)基采用改良MS(MS大量元素減半)為基本培養(yǎng)基，同時(shí)添加不同濃度的細(xì)胞分裂素6-BA(6-芐基腺嘌呤)、KT(6-糠基氨基嘌呤)、生長素NAA(萘乙酸)、30gL蔗糖和2.8 gL結(jié)冷膠。將培養(yǎng)基于120 ℃，20 min條件下高溫高壓滅菌后分裝于直徑為9 cm的培養(yǎng)皿中。試驗(yàn)共設(shè)計(jì)5個(gè)處理：KT 0.4 mgL；6-BA 0.2 mgL；6-BA 0.4 mgL；6-BA 0.8 mgL；6-BA 0.4 mgL+NAA 0.05 mgL(表1)。每個(gè)處理包含6皿。在25 ℃、黑暗條件下培養(yǎng)，每隔1個(gè)星期觀察1次。1個(gè)月后統(tǒng)計(jì)愈傷和不定芽誘導(dǎo)情況。誘導(dǎo)率=(愈傷或不定芽發(fā)生的數(shù)量/外植體數(shù)量)×100%。

表1 不同激素處理對大花六道木不定芽誘導(dǎo)的影響

增殖培養(yǎng)基組分參考汪思奇等[8]的研究。將培養(yǎng)基分裝于瓶中，每瓶裝入約50 mL培養(yǎng)基。然后置于高溫高壓滅菌鍋中，在120 ℃、20 min條件下滅菌后冷卻備用。將不定芽從外植體上切下，轉(zhuǎn)接于增殖培養(yǎng)基，置于25 ℃，光照強(qiáng)度2 000—3 000 lx、光照周期16 h8 h(白黑)條件下，培養(yǎng)并形成叢生芽。

1.3 不定芽生根

待增殖培養(yǎng)基中生長的不定芽長度大于1 cm時(shí)，將其轉(zhuǎn)接于生根培養(yǎng)基上。生根培養(yǎng)基組分采用L9(34)正交試驗(yàn)表進(jìn)行設(shè)計(jì)，包括4個(gè)試驗(yàn)因子(基本培養(yǎng)基、IBA、NAA、蔗糖)，每個(gè)因子包含3個(gè)水平(表2)，每個(gè)處理設(shè)置3次重復(fù)，每瓶接種10個(gè)不定芽，培養(yǎng)條件與增殖培養(yǎng)相同。培養(yǎng)1個(gè)月后統(tǒng)計(jì)生根率，取平均值。生根率=(生根的植株數(shù)量/接種的植株數(shù)量)×100%。

表2 L9(34)生根培養(yǎng)基正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)

1.4 數(shù)據(jù)分析和圖像處理

采用DPS軟件進(jìn)行正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)和統(tǒng)計(jì)分析，方差分析采用Duncan多重比較，顯著水平為P<0.05。圖片處理采用Adobe photoshop CS3和Adobe illustrator CS5。

2 結(jié)果與分析

2.1 不定芽誘導(dǎo)培養(yǎng)基的篩選

將大花六道木葉片剪成小方塊接種于誘導(dǎo)培養(yǎng)基，在培養(yǎng)約15 d后葉片出現(xiàn)彎曲，拱起或上翹，葉片傷口處開始膨大。隨著培養(yǎng)時(shí)間的延長，部分葉片保持綠色，并在傷口處產(chǎn)生愈傷組織和不定芽，而其他葉片黃化，甚至褐化死亡(圖1a)。

在含不同植物生長調(diào)節(jié)劑的培養(yǎng)基上，葉片的反應(yīng)差異很大。不定芽和愈傷的誘導(dǎo)率統(tǒng)計(jì)結(jié)果見表1。其中，在改良MS培養(yǎng)基中添加6-BA 0.4 mgL和0.8 mgL的兩個(gè)處理中，葉片周圍均有不定芽發(fā)生，誘導(dǎo)率分別約為35%和18%。但是，當(dāng)6-BA為0.4 mgL時(shí)，葉片周圍只有不定芽發(fā)生，且?guī)缀鯖]有愈傷組織形成(圖1b)。而在0.8 mgL的6-BA處理中，葉片周圍既有不定芽發(fā)生，同時(shí)伴有愈傷組織產(chǎn)生，愈傷組織的誘導(dǎo)率達(dá)到46%左右。在同時(shí)添加0.4 mgL 6-BA和0.05 mgL NAA的處理中，沒有不定芽發(fā)生，而愈傷組織的誘導(dǎo)率提高到66%左右。在分別添加0.4 mgL KT和0.2 mgL 6-BA的兩種培養(yǎng)基上，葉片既沒有愈傷組織發(fā)生，也沒有不定芽形成。值得注意的是，隨著培養(yǎng)時(shí)間的延長，所有處理?xiàng)l件下誘導(dǎo)的愈傷組織均逐漸褐化凋亡，為非胚性愈傷組織，沒有再生能力。因此，添加6-BA 0.4 mgL的改良MS最適合于大花六道木葉片通過直接器官發(fā)生途徑，誘導(dǎo)不定芽再生。

將不定芽從外植體上切下，轉(zhuǎn)接于增殖培養(yǎng)基上，培養(yǎng)1個(gè)月左右，不定芽通過增殖形成叢生芽，每團(tuán)叢生芽含有數(shù)十棵植株(圖1c)，增殖效果明顯。

a：外植體培養(yǎng)15d；b：不定芽直接發(fā)生；c：叢生芽增殖；d：組培苗生根；e：組培苗移栽馴化圖1 大花六道木葉片誘導(dǎo)不定芽再生、增殖及生根過程Fig.1 The process of shoots induction，proliferation and rooting

2.2 大花六道木植株不定根發(fā)生的影響因子研究

以增殖后長度大于1 cm的不定芽為試驗(yàn)材料，進(jìn)行誘導(dǎo)生根研究?；九囵B(yǎng)基、IBA、NAA和蔗糖濃度對不定芽生根率影響見表3。就各因子對生根率的影響分別進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，結(jié)果表明：在3種基本培養(yǎng)基之中，不定芽生根率最高的為WPM培養(yǎng)基和MS培養(yǎng)基，兩者差異不顯著。在不同濃度的IBA處理中，0.5 mgL和1.0 mgL 兩個(gè)水平下，不定芽生根率差異不顯著，但均顯著高于未添加IBA的處理，考慮到節(jié)約成本，采用IBA 0.5 mgL的水平。在3個(gè)濃度的NAA處理中，1.0 mgL的NAA處理后的不定芽生根率顯著高于其他兩個(gè)濃度處理后的生根率。在含不同濃度蔗糖的培養(yǎng)基中，其中添加20gL蔗糖的培養(yǎng)基中不定芽生根率顯著高于其他兩個(gè)處理水平。正交方差分析(表4)表明，不同試驗(yàn)因子對大花六道木不定芽生根率的影響差異顯著。對各因子的極值進(jìn)行比較分析表明，基本培養(yǎng)基、IBA、NAA和蔗糖的極差大小分別0.2519、0.2878、0.301、0.5312，因此對大花六道木生根的影響因子的主次關(guān)系為蔗糖>NAA>IBA>基本培養(yǎng)基。根據(jù)各因子水平的大小，最后得到最優(yōu)的生根培養(yǎng)基組分為WPM(或MS)+ IBA 0.5mgL+NAA 1.0 mgL+蔗糖 20gL。

表3 大花六道木誘導(dǎo)生根的正交試驗(yàn)方案與結(jié)果

表4 4個(gè)試驗(yàn)因子對大花六道木不定芽生根率的正交試驗(yàn)統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

注：同行中不同小寫字母表示在0.05水平上差異顯著

對優(yōu)化的培養(yǎng)基進(jìn)行試驗(yàn)驗(yàn)證，結(jié)果得到生根良好的大花六道木植株(圖1d)，生根率達(dá)到90%以上。將根系發(fā)育良好的組培苗移栽到溫室進(jìn)行馴化，采用草炭∶珍珠巖=4∶1的栽培基質(zhì)，移栽成活率在95%以上(圖1e)。

3 討論

3.1 6-BA促進(jìn)大花六道木不定芽再生

植物離體再生的關(guān)鍵步驟是植物已分化的體細(xì)胞實(shí)現(xiàn)脫分化，獲得干細(xì)胞功能[11]這一過程。此過程一般誘導(dǎo)形成具有再生能力的愈傷組織，或不經(jīng)過愈傷組織而直接實(shí)現(xiàn)器官發(fā)生。本試驗(yàn)通過直接器官發(fā)生的方式，誘導(dǎo)大花六道木的葉片發(fā)生不定芽，雖然伴隨少量愈傷組織形成，但不需要單獨(dú)誘導(dǎo)愈傷組織進(jìn)行器官分化，可以減少再生過程中遺傳變異的概率。在脫分化的過程中生長素和細(xì)胞分裂素發(fā)揮重要作用。試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，添加低濃度6-BA的改良MS培養(yǎng)基最適合誘導(dǎo)不定芽，實(shí)現(xiàn)大花六道木的不定芽再生，可應(yīng)用于遺傳轉(zhuǎn)化的受體系統(tǒng)。與采用莖段繁殖相比，葉片作為外植體誘導(dǎo)不定芽發(fā)生，可以顯著提高大花六道木的增殖效率。當(dāng)6-BA的濃度增大時(shí)，不定芽的誘導(dǎo)率有所降低，同時(shí)誘導(dǎo)愈傷組織發(fā)生。孫倩婷[9]和呂朝萍[10]利用大花六道木的葉片和莖段培養(yǎng)誘導(dǎo)愈傷組織發(fā)生，但是愈傷只能分化產(chǎn)生大量根狀物，無法誘導(dǎo)不定芽或體細(xì)胞胚再生。本試驗(yàn)中誘導(dǎo)形成的愈傷組織同樣沒有再生能力，無法誘導(dǎo)不定芽再生。近年來研究表明，多能愈傷的細(xì)胞學(xué)屬性類似于根源基細(xì)胞[12]，并非所有的植物體細(xì)胞都能被誘導(dǎo)產(chǎn)生愈傷組織,它只來源于特定類型的再生潛能細(xì)胞[13]。因此，采用合適的外植體是誘導(dǎo)愈傷發(fā)生的關(guān)鍵，關(guān)于大花六道木多能愈傷的誘導(dǎo)和分化需進(jìn)一步探索研究。

6-BA和KT都是人工合成的細(xì)胞分裂素，本研究發(fā)現(xiàn)6-BA在誘導(dǎo)六道木器官再生中的效果優(yōu)于KT，在添加KT的培養(yǎng)基上無法實(shí)現(xiàn)大花六道木的葉片進(jìn)行脫分化。在植物組織培養(yǎng)中，一般需要生長素和細(xì)胞分裂素配合使用，才能誘導(dǎo)植株再生。而本試驗(yàn)在誘導(dǎo)培養(yǎng)基中添加6-BA 的同時(shí)，加入低濃度的生長素NAA后，不定芽的誘導(dǎo)反而受到抑制，并促進(jìn)愈傷組織的形成，表明NAA抑制大花六道木直接不定芽再生。

3.2 大花六道木生根的影響因子

將不定芽從增殖培養(yǎng)基轉(zhuǎn)到生根培養(yǎng)基時(shí)，由于細(xì)胞分裂素的殘留效果，阻礙了不定根原基的發(fā)生，因此必須提高外源生長素和細(xì)胞分裂素的比例，在生根培養(yǎng)基中添加一定濃度的生長素是誘導(dǎo)生根的重要因素。從試驗(yàn)結(jié)果來看，沒有添加任何激素的培養(yǎng)基上生根率只有約10%，同時(shí)添加生長素IBA和NAA可有效促進(jìn)大花六道木生根。本研究發(fā)現(xiàn)蔗糖對生根的影響較大，蔗糖的作用除了為植物生長提供碳源外，還起到調(diào)節(jié)培養(yǎng)基滲透壓的作用[14]，適當(dāng)降低蔗糖的濃度有利于大花六道木不定根的發(fā)生。

致謝:上海市延安中學(xué)的朱心毅同學(xué)在試驗(yàn)材料培養(yǎng)和數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)方面參與了部分工作，在此表示感謝。