張振坤，霍玲玲，劉夢夏，孫 瑩，孫麗香，陳尚一，祝賽峰，吳建峰

（江蘇今世緣酒業(yè)股份有限公司，江蘇漣水223411）

血栓類疾病是一種常見的心腦血管病，鏈激酶、尿激酶、組織型纖溶酶原激活劑等是臨床上治療該類疾病的常用藥物，但這些藥物存在著纖維蛋白特異性差、體內(nèi)半衰期短、需大劑量連續(xù)用藥等缺點[1]。除了對現(xiàn)有纖溶酶進行優(yōu)化改造外，尋找新型纖溶酶的研究一直在進行。微生物是纖溶酶的重要來源之一，通過對產(chǎn)蛋白酶的微生物進行篩選，可獲得新型纖溶酶產(chǎn)生菌。20世紀80年代日本學者發(fā)現(xiàn)納豆提取物中存在一種高效纖溶酶，命名為納豆激酶，并證實該酶由枯草芽孢桿菌的一個近源種產(chǎn)生[2]。此后，國內(nèi)外研究人員又從發(fā)酵食品中分離到具有產(chǎn)纖溶酶能力的枯草芽孢桿菌、解淀粉芽孢桿菌等芽孢桿菌[3-5]。

大曲是白酒釀造過程中微生物和酶的主要來源，芽孢桿菌是大曲中的重要菌群之一，可分泌多種蛋白酶分解蛋白類物質(zhì)而產(chǎn)生多肽和氨基酸，為其他微生物的生長繁殖提供物質(zhì)基礎，同時也是白酒中多種香味成分的重要前體物質(zhì)[5]。經(jīng)過長期的培養(yǎng)篩選，大曲中富集了枯草芽孢桿菌、地衣芽孢桿菌等種類豐富的高產(chǎn)蛋白酶的芽孢桿菌，其所產(chǎn)蛋白酶一般具有活力較高、溫度耐受性較強等特性[6-7]。本研究從大曲中分離具有產(chǎn)纖溶酶能力的芽孢桿菌，為挖掘釀酒大曲微生物資源、開發(fā)新型纖溶酶提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料、試劑及儀器

1.1.1 樣品與試劑

分菌樣品：中高溫大曲，取自今世緣制曲中心大曲培養(yǎng)房。主要試劑：牛纖維蛋白原、凝血酶、尿激酶購自中國藥品生物制品檢定所；擴增引物27F和1492R購自上海生工生物工程有限公司。

1.1.2 主要儀器

隔水式恒溫培養(yǎng)箱（GHP-9160），上海一恒科學儀器有限公司；電熱恒溫水浴鍋（HHS214），江蘇省醫(yī)療器材廠；氣浴恒溫振蕩器（SHZ-82），金壇市杰瑞爾電器有限公司；顯微鏡（BX-41），奧林巴斯；高壓蒸汽滅菌鍋（KG-SX-500），日本TOMY公司；凝膠成像儀，美國BIO-RAD。

1.1.3 培養(yǎng)基

斜面與平板培養(yǎng)基（g/L）：牛肉膏5，蛋白胨10，NaCl 5，瓊脂15，pH7.0～7.2。

初篩培養(yǎng)基（g/L）：葡萄糖1，酵母膏1，酪素5，K2HPO41，KH2PO40.5，MgSO40.5，瓊脂15，pH7.0～7.2。

種子培養(yǎng)基（g/L）：葡萄糖10，蛋白胨10，NaCl 5，pH 7.0～7.2。

發(fā)酵培養(yǎng)基（g/L）：葡萄糖 20，蛋白胨 20，KH2PO42，K2HPO44，MgSO40.5，pH 7.0～7.2。

1.2 試驗方法

1.2.1 芽孢桿菌的分離與初篩

大曲粉碎，取1 g放入滅菌三角瓶中，加入100 mL無菌生理鹽水，搖床振蕩30 min后將三角瓶置于80℃水浴鍋中保溫10 min。取1 mL菌液逐級進行10倍梯度稀釋，選取10-4、10-5、10-63個濃度各0.1 mL涂布平板，每個梯度做3個平行。根據(jù)菌落形態(tài)特征挑取不同的單菌落，多次劃線獲得純培養(yǎng)菌體。

酪素平板法初篩[9]：無菌環(huán)境下從試管斜面上挑取1環(huán)菌體混入10 mL無菌水中，搖勻后分別稀釋菌懸液涂布酪蛋白平板。于37℃下培養(yǎng)24 h。挑取有明顯溶解圈的菌落接入試管斜面后以37℃培養(yǎng)24 h后保藏備用。

1.2.2 菌種的復篩

瓊脂糖-纖維蛋白平板制作參照王剛等的方法[10]：用0.02 mol/L、pH7.4的磷酸緩沖液配制1‰（w/v）的纖維蛋白原溶液，按照每管10 mL分裝入試管中，50℃保溫。配制2%（w/v）濃度的瓊脂糖溶液并按照每管10 mL趁熱分裝入試管，于50℃水浴保溫，待溫度平衡后每個試管加入100 μL凝血酶溶液（100 IU/mL），搖勻后將瓊脂糖-凝血酶混合液倒入纖維蛋白溶液中，然后倒平板。室溫凝固后打孔備用。

菌株產(chǎn)纖溶酶能力的定性檢測：種子培養(yǎng)基接入初篩得到的菌種，37℃下150 r/min培養(yǎng)24 h。按照4%接種量接入發(fā)酵培養(yǎng)基，37℃下150 r/min培養(yǎng)48 h。發(fā)酵液5000 r/min離心10 min，上清液即為粗酶液。取10 μL粗酶液注入纖維蛋白平板上的孔中，同時以不接菌的發(fā)酵培養(yǎng)基離心上清液做空白對照，以尿激酶溶液做陽性對照。于37℃溫育8 h觀測溶解圈。

1.2.3 菌落的形態(tài)觀察與生理生化實驗

將篩選到的菌株在平板上劃線，37℃培養(yǎng)24 h后觀察菌落形態(tài)并拍照；生理生化實驗與結果分析參照相關文獻[11-12]進行。

1.2.4 菌株基于16S rDNA的分子生物學鑒定[13]

菌株基因組DNA的提取與16S rDNA的擴增：采用煮沸法提取菌株DNA作為模板，采用通用引物27F和1492R進行PCR擴增，PCR產(chǎn)物經(jīng)1%瓊脂糖凝膠電泳檢測后由上海生工測序。16S rDNA序列比對與系統(tǒng)發(fā)育樹構建：將測序結果在EzTaxon和NCBI上進行比對分析，下載同源性高的菌株16S rDNA序列，并與試驗菌株的序列一起用ClustalX1.8和MEGA4.0采用鄰接法構建系統(tǒng)發(fā)育樹。

2 結果與分析

2.1 產(chǎn)纖溶酶芽孢桿菌的分離篩選（見圖1）

用酪蛋白平板法對分離得到的純菌株進行初篩，得到具有酪蛋白分解能力的菌株9株，編號為A2、A3、B2、B4、B6、B7、B8、C3 和 C6。采用瓊脂糖-纖維蛋白平板法對上述菌株進行復篩，圖1為這9株菌的粗酶液在瓊脂糖-纖維蛋白平板上產(chǎn)生的溶解圈情況，除A2與C3外其余7株菌的粗酶液均可產(chǎn)生溶解圈，表明7株菌具有產(chǎn)纖溶酶能力。

圖1 粗酶液在瓊脂糖-纖維蛋白平板上產(chǎn)生的溶解圈

2.2 菌株的菌落形態(tài)與生理生化特性

從菌落形態(tài)來看，A2菌落圓形扁平，邊緣整齊，乳白色，表面濕潤；B2菌落大而不規(guī)則，菌落較厚呈蠟油狀，表面濕潤易挑起；B4菌落扁平，邊緣鋸齒狀，表面干燥；B6菌落圓形，扁平，表面干燥；B7菌落圓形，有環(huán)形凸起，表面褶皺；B8菌落圓形，中部呈凸臍狀，表面濕潤；C6菌落大而扁平，邊緣缺刻，表面干燥。

對這7株菌進行了生理生化試驗，結果見表1。革蘭氏染色、酪蛋白分解、淀粉水解及觸酶試驗等呈陽性，能在含10%NaCl培養(yǎng)基中生長；B7與C6不能利用檸檬酸鹽，能利用丙酸鹽，其余5株菌能利用檸檬酸鹽而不能利用丙酸鹽；除A3外均能利用D-木糖、D-甘露醇產(chǎn)酸。結果顯示，這7株菌的生理生化特征與枯草芽孢桿菌、蠟狀芽孢桿菌等的特征相符。

2.3 產(chǎn)纖溶酶芽孢桿菌的鑒定（見圖2）

圖2 PCR產(chǎn)物的凝膠電泳圖

以上述7個菌株的基因組DNA為模板進行16S rDNA擴增，擴增產(chǎn)物進行凝膠電泳，結果見圖2，均得到約1500 bp的單一條帶，條帶清晰。

將16S rDNA的測序結果在EzTaxon和NCBI上進行比對分析，這7株菌的比對分析結果見表2。

表1 生理生化實驗結果

由7株試驗菌株與相關模式菌株所構建的系統(tǒng)發(fā)育樹（見圖3）可以看出，這7株菌可分為3支。A3與模式菌株Bacillus cereus聚為一支，B2與Bacillus aerius聚為一支，均具有高度同源性；其余5株菌與枯草芽孢桿菌及其近源種群聚為一支。綜合菌落形態(tài)、生理生化特征及16S rDNA比對結果和發(fā)育樹分析，A3被鑒定為Bacillus cereus，B2被鑒定為Bacillus aerius，B4被鑒定為Bacillus methylotrophicus，B7被鑒定為Bacillus siamensis；B4被鑒定為Bacillus methylotrophicus；B6被鑒定為Bacillus subtilis；B8被鑒定為Bacillus tequilensis；C6被鑒定為Bacillus amyloliquefaciens。

表2 7株菌的16S rDNA序列比對結果

圖3 7株菌基于16Sr DNA構建的系統(tǒng)發(fā)育樹

3 討論

纖溶酶是一種蛋白酶，近年來的研究多以高蛋白發(fā)酵食品為材料篩選纖溶酶產(chǎn)生菌，較少涉及其他材料[1，5]。本研究以釀酒大曲這一傳統(tǒng)固態(tài)發(fā)酵酶制劑為材料，分離到7株具有產(chǎn)纖溶酶能力的菌株，豐富了纖溶酶產(chǎn)生菌的篩選來源。經(jīng)鑒定這7株菌中有1株為蠟狀芽孢桿菌，1株為空氣芽孢桿菌，其余5株為枯草芽孢桿菌的亞種及其近緣種群。在序列比對及構建發(fā)育樹過程中注意到枯草芽孢桿菌亞種及其近緣種的16S rDNA序列相似性很高，對這些近緣種需另外借助gyrB或gyrA、rpoB等基因序列進行更準確的區(qū)分[12]。同時，將對這7株纖溶酶產(chǎn)生菌的酶活力進行定量測定，從中篩選出高產(chǎn)纖溶酶菌株，并對其最佳產(chǎn)酶條件及酶學性質(zhì)等做進一步研究。