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        高效發(fā)酵人工窖泥的制備及應(yīng)用研究

        2018-10-30 14:33:18薛正楷趙金松張宿義
        釀酒科技 2018年10期
        關(guān)鍵詞:分析

        薛正楷 ,趙金松 ,張宿義 ,倪 斌 ,5

        (1.瀘州職業(yè)技術(shù)學(xué)院白酒學(xué)院,四川瀘州 646001; 2.瀘州市生物醫(yī)學(xué)工程研究所,四川瀘州646000;3.四川理工學(xué)院,四川自貢643000; 4.瀘州老窖股份有限責(zé)任公司,四川瀘州646002;5.瀘州江潭窖酒業(yè)有限公司,四川瀘州646005)

        窖泥是濃香型白酒釀造的基礎(chǔ),其質(zhì)量的優(yōu)劣直接影響到所產(chǎn)基酒的質(zhì)量。窖泥中微生物類群非常復(fù)雜,棲息著大量的己酸菌、乳酸菌、丁酸菌、甲烷菌、硫酸鹽還原菌和硝酸鹽還原菌等窖泥功能菌,對(duì)產(chǎn)生濃香型白酒的風(fēng)格起著十分重要的作用[1]。窖泥質(zhì)量不僅在于其理化指標(biāo)豐富程度,更取決于這些有益窖泥功能菌的種類、數(shù)量及產(chǎn)物的代謝能力,以及營(yíng)養(yǎng)成分的合理比例,是直接影響白酒質(zhì)量的關(guān)鍵所在[2]。正是由于這些有益功能菌的大量生長(zhǎng)、繁殖、代謝以及相互協(xié)調(diào)作用,才賦予了白酒的獨(dú)特香型,造就了以已酸乙酯為主體香的濃香型白酒的典型風(fēng)格[3]。因此,窖泥質(zhì)量的優(yōu)劣對(duì)濃香型白酒的質(zhì)量起著至關(guān)重要的作用。但是傳統(tǒng)人工窖泥在生產(chǎn)過程中有兩個(gè)突出問題:新窖泥自然老熟時(shí)間太長(zhǎng);使用一段時(shí)間后窖泥會(huì)老化而影響酒的品質(zhì)[4-5]。而在傳統(tǒng)人工窖泥培養(yǎng)的基礎(chǔ)上,通過采取加入?yún)f(xié)調(diào)而全面的優(yōu)良菌種、科學(xué)合理的培養(yǎng)配方,增加窖泥中有益微生物菌群和各種營(yíng)養(yǎng)成分,并加速其老熟,以縮短自然老熟時(shí)間[6-14]。

        擬采用本研究選育的產(chǎn)己酸菌菌株L.fusiformis-ep-SigB,制備窖泥,為該菌株的產(chǎn)業(yè)應(yīng)用提供理論和技術(shù)支持。

        1 材料

        1.1 窖泥制備材料

        窖皮泥、老窖泥、豆餅粉、麩皮由瀘州精圣酒莊惠贈(zèng);黃泥土、酒糟、黃水、底鍋水、酒尾由瀘州江潭窖酒業(yè)有限公司惠贈(zèng);中偏高溫大曲粉,購(gòu)自瀘州懷玉制曲有限公司;酵母膏、碳酸氫鈉(NaHCO3)、氟化鈉(NaF)、硫酸鈉(Na2SO4)、乙酸鈉(CH3COONa)、EDTA二鈉(C10H14N2O8Na2·2H2O)、酒石酸鉀鈉(KNaC4H4O6·4H2O)、氫氧化鈉(NaOH)、碘化鉀(KI)、氯化汞(HgCl2)、氫氧化鉀(KOH)、酒石酸鈉(Na2C4H4O6·2H2O)、鉬酸銨([(NH4)6Mo2O7·4H2O])、氯化亞錫(SnCl2)、四苯硼鈉[NaB(C6H5)4]、磷酸二氫鉀(KH2PO4)、硫酸銨([(NH4)2SO4])、硝酸鉀(KNO3)、硫酸鉀(K2SO4)、磷酸氫二鉀(K2HPO4)、硫酸鎂(MgSO4)、無水乙醇、無磷活性炭、阿拉伯膠粉、甘油、甲醛,購(gòu)自成都科龍?jiān)噭S;FastDNA?SPINKitforSoil購(gòu)自MPBIO公司;L.fusiformis-ep-SigB己酸菌液由本實(shí)驗(yàn)室提供。

        1.2 人工窖泥配方

        根據(jù)文獻(xiàn)和生產(chǎn)實(shí)踐[15-19],本項(xiàng)目配制下列8個(gè)窖泥方案進(jìn)行篩選。

        方案1(X1):L.fusiformis-ep-SigB菌液2.5%;20%vol酒尾10%;黃泥土50%;窖底泥0.5%;優(yōu)質(zhì)大曲粉8%;香醅8%;磷酸氫二鉀0.05%;乙酸鈉1.5%;酵母膏0.54%;黃水8.45%;水10.46%。

        方案2(X2):黃黏土40%;泥碳5.04%;窖皮泥15%;L.fusiformis-ep-SigB菌液1.5%;大曲粉2.5%;豆餅粉1.5%;骨粉0.5%;母(底)糟或丟糟1%;黃漿水(按固體材料比)5%;尾酒(20%vol)15%;醋酸鈉3%;磷酸氫二鉀0.05%;水9.91%。

        方案3(X3):黃泥40%;糧糟3%;曲粉2%;L.fusiformis-ep-SigB菌液5%;黃水3%;豆餅粉1%;磷酸氫二鉀0.02%;尾酒10%;泥碳5%;污泥2%;底鍋水1%;窖皮泥4.57%;生香窖母4%;水19.41%。

        方案4(X4):黃黏土53%;母糟6.5%;黃水6.5%;中高溫曲粉2.5%;窖皮泥7.89%;豆餅粉1%;L.fusiformis-ep-SigB菌液6.5%;30%vol低度酒1.3%;骨粉0.7%;水14.11%。

        方案5(X5):黃泥100%;老窖泥5%;窖皮泥10%;酒糟8%;大曲粉3%;豆餅粉1.5%;黃水8%;酒尾5%;營(yíng)養(yǎng)鹽0.11%;乙酸鈉0.1%;L.fusiformis-ep-SigB菌液10%;底鍋水適量。

        方案6(X6):黃泥100%;窖皮泥10%;酒糟5%;大曲粉2%;豆餅粉1.2%;麩皮3%;L.fusiformis-ep-SigB菌液10%;酒尾(12%vol)15%;黃水5%;乙酸鈉0.05%;磷酸氫二鉀0.01%;酵母膏0.01%;藕塘泥適量;底鍋水適量。

        方案7(X7):以黃泥為100%標(biāo)準(zhǔn)計(jì),黃水10%,酒糟10%,L.fusiformis-ep-SigB菌液10%,曲粉1.0%,豆餅1.5%,NaAc 0.1%,KH2PO40.16%,(NH4)2SO40.005%,MgSO40.002%,蛋白胨0.01%,酒精4%。

        方案8(X8):以黃泥100%為標(biāo)準(zhǔn)計(jì),老窖泥3%;L.fusiformis-ep-SigB菌液10%;酒糟8%;大曲粉2%;豆餅粉1.5%;營(yíng)養(yǎng)鹽0.11%;乙酸鈉0.1%;酵母膏0.1%;硫酸銨0.05%;磷酸氫二鉀0.04%;硫酸鎂0.02%;黃水8%;酒尾5%;底鍋水適量。

        1.3 微生物計(jì)數(shù)培養(yǎng)基

        微生物計(jì)數(shù)培養(yǎng)基分別采用細(xì)菌培養(yǎng)基(牛肉膏蛋白胨瓊脂培養(yǎng)基)、放線菌培養(yǎng)基(高氏1號(hào)瓊脂培養(yǎng)基)、真菌培養(yǎng)基(馬?。∕artin)-孟加拉紅瓊脂培養(yǎng)基)、巴氏梭狀芽孢桿菌合成培養(yǎng)基。

        2 方法

        2.1 窖泥培養(yǎng)

        配制8種窖泥配方,將溫度控制在40℃,培養(yǎng)60 d,每種窖泥3個(gè)重復(fù)。

        2.2 泥樣微生物分析采用稀釋平板計(jì)數(shù)法

        用接種匙稱取8種方案的0.5 g新鮮窖泥于4.5mL無菌水中,置于30℃的搖床中振蕩30~40min。再?gòu)闹杏靡埔汗芪?.5 mL菌液到盛有4.5 mL無菌水的試管中,一直稀釋至10-5梯度。從適度的稀釋液中分別吸取0.1 mL菌液到已倒好的平板上(每種2個(gè))(事先觀察平板是否被污染),然后用涂布器涂勻,將涂布好的培養(yǎng)皿倒置放于培養(yǎng)箱中。細(xì)菌在35℃下培養(yǎng)1~2 d。同時(shí)對(duì)細(xì)菌做厭氧培養(yǎng),在真空干燥箱中抽真空至0.08 MPa,在35℃條件下培養(yǎng)3~4 d。真菌在30℃下培養(yǎng)2~3 d,芽孢桿菌30℃下培養(yǎng)1~2 d,在真空干燥箱中抽真空至0.08 MPa。放線菌于30℃下培養(yǎng)5~7 d。

        2.3 理化分析方法

        氨態(tài)氮的測(cè)定采用納氏試劑比色法,樣品需用新鮮窖泥,同時(shí)測(cè)定水分,以換算成絕干樣的含量;水分及揮發(fā)物測(cè)定采用恒重法,腐殖質(zhì)的測(cè)定采用重鉻酸鉀氧化法,有效磷的測(cè)定采用碳酸氫鈉法,pH值采用pH計(jì)測(cè)定,鈣的測(cè)定采用高錳酸鉀滴定法;白酒總酸、總酯及組成酸、酯的測(cè)定參考國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)GB/T 10345—2007《白酒分析方法》中總酸、總酯的測(cè)定方法。

        2.4 感官評(píng)定、理化評(píng)定

        采用趙長(zhǎng)青等方法[20],對(duì)8塊窖泥進(jìn)行感官和理化評(píng)定,結(jié)果見表1和表2。

        表1 窖泥感官質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)表(總分60分)

        表2 窖泥理化、微生物指標(biāo)評(píng)定表(總分40分)

        2.5 窖泥配方細(xì)菌多樣性分析

        窖泥送上海美吉生物有限公司完成。具體方法如下:采用 FastDNA? SPINKitforSoil對(duì)8個(gè)的窖泥配方細(xì)菌DNA進(jìn)行提取。以不同配方窖泥細(xì)菌總DNA為模板,引物采用細(xì)菌16S rRNA V4—V5 區(qū)引物515F(5′-148-GTGCCAGCMGCCGCGG-3')和907R 149 (5′-CCGTCAAATTCMTTTRAGTTT-3′)進(jìn)行Touch Down PCR擴(kuò)增,利用Illumina高通量測(cè)序儀對(duì)8個(gè)窖泥細(xì)菌DNA PCR擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行測(cè)序分析,為了確保實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)的準(zhǔn)確性及普遍性,需對(duì)獲得的原始序列進(jìn)行適當(dāng)?shù)暮Y選,去掉低質(zhì)量的序列,進(jìn)而獲得滿足后續(xù)分析要求的高質(zhì)量序列。通過與核糖體數(shù)據(jù)庫(kù)(ribosomal database project,RDP)已知序列的比對(duì),修剪適配器和核糖體標(biāo)簽來減少測(cè)序錯(cuò)誤率。利用微生物生態(tài)學(xué)的定量分析(quantitative in sights into microbial ecology,QIIME)平臺(tái)對(duì)窖泥細(xì)菌DNA序列進(jìn)行高級(jí)生物信息分析,每個(gè)樣品剩余的高質(zhì)量序列用于劃分操作分類單元(operational taxonomic unit,OTU)。在97%相似度的OTUs進(jìn)行同源性比對(duì)的基礎(chǔ)上,評(píng)估窖泥樣品細(xì)菌的豐富度(Chao指數(shù))和多樣性(Shannon指數(shù))。此外,主成分分析(principal component analysis,PCA)用來反映不同窖泥樣本之間細(xì)菌組成的差異。

        圖1 夾泥發(fā)酵

        2.6 生產(chǎn)試驗(yàn)

        按窖泥配方X8制備的窖泥,將窖泥放置于竹筒中,將竹筒放置于濃香型白酒窖池糟醅中層(圖1I),A、B糟層均放置裝滿窖泥的竹筒(竹筒表面密布小孔),每窖池放置竹筒180個(gè),共90 kg窖泥;共進(jìn)行3個(gè)重復(fù)試驗(yàn)。按正常工藝發(fā)酵60 d,蒸酒,取酒進(jìn)行氣相色譜分析。

        2.7 數(shù)據(jù)處理

        采用sigmaplot14進(jìn)行繪圖;采用spss和excel進(jìn)行數(shù)據(jù)處理。

        3 結(jié)果與討論

        3.1 細(xì)菌有氧計(jì)數(shù)

        采用菌落計(jì)數(shù)的方法,對(duì)有氧條件下不同發(fā)酵時(shí)間的平板進(jìn)行細(xì)菌菌落計(jì)數(shù),結(jié)果見圖2。

        圖2 有氧條件下的細(xì)菌數(shù)

        分析圖2可知,8個(gè)方案除X6方案在第40天達(dá)到菌落最大值以外,其余方案均在第60天達(dá)到最大菌落數(shù),每方案最大菌落數(shù)分別為:98.7(第60天)、67.6(第60天)、42(第60天)、78.7(第60天)、76.4(第 60 天)、61.2(第 40 天)、37.7(第 60 天)、127.5(第60天)(×105cfu/mL),可見,60 d發(fā)酵窖泥在有氧條件下,X8在60 d時(shí),細(xì)菌數(shù)最大菌落數(shù)為127.5(×105cfu/mL),其次是方案1,在60 d時(shí)最大菌落數(shù)為98.7(×105cfu/mL)。

        3.2 細(xì)菌無氧計(jì)數(shù)

        采用菌落計(jì)數(shù)的方法,對(duì)無氧條件下不同發(fā)酵時(shí)間的平板進(jìn)行細(xì)菌菌落計(jì)數(shù),結(jié)果見圖3。

        圖3 無氧條件下細(xì)菌菌落數(shù)

        分析圖3可知,方案X1到方案X8最大菌落數(shù)分別為:151.7(第60天)、137.2(第60天)、32.1(第60天)、75.8(第40天)、77.2(第40天)、79.2(第60天)、89.8(第60天)、145.7(第60天)(×105cfu/mL),可見,發(fā)酵窖泥在無氧條件下,8個(gè)方案中最大菌落數(shù)為X1,其細(xì)菌數(shù)最大菌落數(shù)為157.1(×105cfu/mL);其次是X8在60 d時(shí)最大菌落數(shù)為145.7(×105cfu/mL),將二者菌落數(shù)進(jìn)行成對(duì)數(shù)據(jù)T檢驗(yàn),其Sig=0.624>0.05,表明二者差異不顯著。

        3.3 放線菌計(jì)數(shù)圖

        采用菌落計(jì)數(shù)的方法,對(duì)無氧條件下不同發(fā)酵時(shí)間的平板進(jìn)行放線菌菌落計(jì)數(shù),結(jié)果見圖4。

        圖4 無氧條件下放線菌菌落數(shù)

        分析圖4可知,總體上看,放線菌菌落數(shù),0~20 d時(shí),逐漸降低,20~60 d時(shí),菌落數(shù)逐漸增加,60 d時(shí),方案X8菌落數(shù)最多,達(dá)到26(×105cfu/mL),其次是方案X4,菌落數(shù)達(dá)16(×105cfu/mL)。

        3.4 芽孢桿菌

        采用平板菌落計(jì)數(shù)的方法,對(duì)無氧條件下不同發(fā)酵時(shí)間的平板進(jìn)行芽孢桿菌菌落計(jì)數(shù),結(jié)果見圖5。

        圖5 無氧條件下芽孢桿菌菌落數(shù)

        分析圖5可知,8個(gè)方案中芽孢桿菌最大值為方案X8,其芽孢桿菌在第60天達(dá)到53.4(×105cfu/mL),其次是方案4,為49.6(×105cfu/mL)。

        3.5 真菌

        采用平板菌落計(jì)數(shù)的方法,對(duì)無氧條件下不同發(fā)酵時(shí)間的平板進(jìn)行真菌菌落計(jì)數(shù),結(jié)果見圖6。

        圖6 無氧條件下真菌菌落數(shù)

        分析圖6可知,在60 d時(shí),真菌菌落在方案X4達(dá)到最大值32.4(×105cfu/mL),其次為方案X8,真菌菌落達(dá)到17.3(×105cfu/mL)。

        通過以上分析,可知X8方案中的放線菌、細(xì)菌(有氧和無氧)、芽孢桿菌比其他方案都多,真菌X4方案最多,X8方案其次,總體上看,X8方案為最優(yōu)方案。

        3.6 理化性質(zhì)

        對(duì)8個(gè)窖泥培養(yǎng)方案進(jìn)行氨態(tài)氮、速效鉀、有效磷、pH值和含水量分析,結(jié)果見表3。

        采用表1和文獻(xiàn)對(duì)窖泥理化性質(zhì)進(jìn)行分析,結(jié)果表明,X8和X4較優(yōu)。

        基于表2對(duì)8個(gè)窖泥方案進(jìn)行分析,結(jié)果見表4。

        表3 8個(gè)窖泥培養(yǎng)方案理化分析

        表4 8個(gè)窖泥培養(yǎng)方案的感官評(píng)定結(jié)果

        從表4可知,方案8感官評(píng)價(jià)較好。

        3.7 窖泥群落結(jié)構(gòu)分析

        利用Illumina Miseq高通量測(cè)序技術(shù)對(duì)窖泥細(xì)菌DNAPCR產(chǎn)物進(jìn)行測(cè)序分析,通過數(shù)據(jù)庫(kù)比對(duì)得到窖泥細(xì)菌的種類,并進(jìn)一步計(jì)算各種細(xì)菌所占細(xì)菌總數(shù)的比例(即相對(duì)含量),結(jié)果見圖7。

        圖7 不同窖齡窖泥與8個(gè)人工窖泥細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)分析

        從圖7可知,4年、10年、50年和100年窖底泥中細(xì)菌以厚壁菌門(Firmicutes)最多,占細(xì)菌總體群落結(jié)構(gòu)的90%以上。由于該門是原核生物界中一類細(xì)胞壁厚度為10~50 nm細(xì)菌的高級(jí)分類單元,包括一大類細(xì)菌,多數(shù)為革蘭氏陽(yáng)性,有細(xì)胞壁結(jié)構(gòu),少數(shù)缺乏細(xì)胞壁而不能被革蘭氏方法染色,如柔膜菌綱(Mollicutes)(如支原體),但也和其他革蘭氏陽(yáng)性菌一樣缺乏第二層細(xì)胞膜。厚壁菌門細(xì)胞壁含肽聚糖量高,為50%~80%,細(xì)胞壁厚10~50 nm,革蘭氏染色呈陽(yáng)性。厚壁菌門多為球狀或桿狀,也有不規(guī)則桿狀、絲狀或分枝絲狀等;很多厚壁菌可以產(chǎn)生芽孢,它可以抵抗脫水和極端環(huán)境。很多環(huán)境中都可找到芽孢,很多著名的病原菌都能產(chǎn)生芽孢;厚壁菌門原本包括所有革蘭氏陽(yáng)性菌,主要由芽孢桿菌綱(Bacilli)、梭菌綱(Clostridia)、丹毒絲菌綱(Erysipelotrichia)、熱石桿菌綱(Thermolithobacteria)及一些不確定的遺傳類群組成,其中芽孢桿菌綱和梭菌綱構(gòu)成了厚壁菌門的主體;在8個(gè)人工窖泥中,厚壁菌門占細(xì)菌群落總量最大的為X4,相對(duì)比例達(dá)到近70%,其次為X8占55%左右。

        在8個(gè)人工窖泥中,變形菌門(Proteobacteria)也是群落結(jié)構(gòu)中相對(duì)比例較高的一個(gè)門,為革蘭氏陰性菌,其外膜主要由脂多糖組成。很多變形菌門細(xì)菌利用鞭毛運(yùn)動(dòng),但有一些非運(yùn)動(dòng)性的種類,或者依靠滑行來運(yùn)動(dòng)。此外還有一類獨(dú)特的黏細(xì)菌,可以聚集形成多細(xì)胞的子實(shí)體。變形菌門包含多種代謝種類。大多數(shù)細(xì)菌為兼性或者專性厭氧及異養(yǎng)生活,但有很多例外。很多并非緊密相關(guān)的屬可以利用光合作用儲(chǔ)存能量,因其多數(shù)具有紫紅色的色素,被稱為紫細(xì)菌,其中X1中幾乎占了細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)的50%,X4和X8中分別占了10%和15%。

        3.8 生產(chǎn)實(shí)驗(yàn)

        取發(fā)酵60 d的蒸餾原酒,進(jìn)行氣相色譜檢測(cè),結(jié)果如表5。

        對(duì)試驗(yàn)組和對(duì)照組的主要乙酸乙酯、丁酸乙酯、乳酸乙酯、己酸乙酯、總酸、總酯采用配對(duì)數(shù)據(jù)T檢驗(yàn)進(jìn)行比較,結(jié)果表明:試驗(yàn)組與對(duì)照組間乙酸乙酯(Sig=0.111>0.05)、乳酸乙酯(0.05>Sig=0.022>0.01)差異不顯著,試驗(yàn)組與對(duì)照組間己酸乙酯(Sig=0.001<0.01)、丁酸乙酯(Sig=0.002<0.01)、總酯(Sig=0.001<0.01)、總酸(Sig=0.009<0.01)差異極顯著。

        表5 原酒中主要風(fēng)味物質(zhì)分析

        4 結(jié)論

        本項(xiàng)目通過對(duì)8個(gè)人工窖泥方案進(jìn)行細(xì)菌、真菌、放線菌、芽孢桿菌平板計(jì)數(shù)分析、窖泥的理化分析、細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)比較分析,結(jié)果表明,添加L.fusiformis-ep-SigB發(fā)酵液的X8號(hào)窖泥配方具有較好的各項(xiàng)指標(biāo),為最優(yōu)窖泥配方。

        采用添加L.fusiformis-ep-SigB發(fā)酵液的X8號(hào)方案進(jìn)行窖泥制備,對(duì)發(fā)酵60 d的窖泥采用夾泥發(fā)酵工藝進(jìn)行生產(chǎn)試驗(yàn),結(jié)果表明,試驗(yàn)組與對(duì)照組間乙酸乙酯(Sig=0.111>0.05)、乳酸乙酯(0.05>Sig=0.022>0.01)差異不顯著,試驗(yàn)組與對(duì)照組間己酸乙酯(Sig=0.001<0.01)、丁酸乙酯(Sig=0.002<0.01)、總酯(Sig=0.001<0.01)、總酸(Sig=0.009<0.01)差異極顯著,本試驗(yàn)成功篩選出可用于濃香型白酒的窖泥配方。

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