羅文業(yè)，卓毓崇，周 艷，徐克贊，何世興，時(shí) 源，陳 振，徐 源

（四川省古藺郎酒廠有限公司，四川古藺646523）

真菌毒素是真菌在食品或飼料里生長所產(chǎn)生的代謝產(chǎn)物，對(duì)人類和動(dòng)物都有害。許多農(nóng)作物都很容易被霉菌和真菌侵蝕。植物生長期的脅迫或收獲后惡劣的儲(chǔ)藏條件都可能使真菌類感染大量日常用品，經(jīng)常產(chǎn)生無法忍受的味道。也有可能在一些真菌生長過程產(chǎn)生有毒的二級(jí)代謝產(chǎn)物，潛在地污染動(dòng)物飼料和人類消費(fèi)的食品。這些二級(jí)代謝產(chǎn)物一般來說是霉菌毒素。

黃曲霉毒素B1、脫氧雪腐鐮刀菌烯醇、赭曲霉毒素A、玉米赤霉烯酮均屬于真菌毒素，在很多國家都對(duì)其立法規(guī)定了限量。

目前關(guān)于糧食中真菌毒素的檢測方法有很多，最普遍的是高效液相色譜、紫外檢測法、液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法等。但都是一次測定一種真菌毒素，處理也相對(duì)復(fù)雜。采用超高壓液相色譜-質(zhì)譜同時(shí)測定糧食中多種真菌毒素，該方法快速簡便,定性、定量準(zhǔn)確,靈敏度極高，可以滿足國家標(biāo)準(zhǔn)GB 2761—2017對(duì)糧食中真菌毒素限量限制的要求。

1 材料與方法

1.1 材料、試劑

小麥、高粱、大米、玉米，市售。乙腈，色譜純。甲酸，色譜純。甲醇，色譜純。正己烷，色譜純。氯化鈉，分析純。60%甲醇水溶液：量取60 mL甲醇用超純水定容至100 mL。真菌毒素標(biāo)準(zhǔn)品或標(biāo)準(zhǔn)品溶液：黃曲霉素B1、脫氧雪腐鐮刀菌稀醇、玉米赤霉烯酮和赭曲霉素A，有國家認(rèn)可的標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)證書，固體標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)純度含量≥98.0%。

1.2 實(shí)驗(yàn)儀器

超高壓液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用儀，超高壓液相色譜：WATERS ACQUITY UP-LC/TQD,電噴霧（ESI）離子源。色譜柱：BEH C18（2.1 mm×100 mm,1.7 μm）或相當(dāng)者。萃取柱：OASIS HLB 1cc（30 mg）Cartridge，或性能相當(dāng)者。Masslynx 4.1質(zhì)譜色譜操作軟件。

1.3 儀器工作條件

（1）液相色譜參考條件

色譜柱：BEH C18（2.1 mm×100 mm，1.7 μm）或相當(dāng)者。流動(dòng)相A：超純水+0.1%甲酸。流動(dòng)相B：乙腈+0.1%甲酸。流速：0.3 mL/min。進(jìn)樣體積：10 μL。進(jìn)樣方式：自動(dòng)進(jìn)樣。柱箱溫度：40℃。梯度洗脫程序見表1。

表1 梯度洗脫程序

（2）質(zhì)譜參考條件

離子源：電噴霧離子源（ESI）。檢測方式：多反應(yīng)監(jiān)測MRM模式。毛細(xì)管電壓：4 kV。錐孔電壓：多級(jí)。離子源溫度：120℃。脫溶劑氣（N2）流量：800 L/h。脫溶劑氣（N2）溫度：450 ℃。錐孔氣（N2）流量：5 L/h。碰撞氣體（Ar）壓力，3.5×10-3毫巴。質(zhì)譜參數(shù)見表2，其中“*”表示定量離子對(duì)。

1.4 真菌毒素標(biāo)準(zhǔn)溶液配制

0.1 mg/mL真菌毒素標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備溶液：準(zhǔn)確稱取或吸取一定量上述4種標(biāo)準(zhǔn)品，用甲醇分別配制成0.1 mg/mL標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備溶液，-18℃下避光保存?zhèn)溆谩?/p>

標(biāo)準(zhǔn)工作溶液：吸取一定量上述標(biāo)準(zhǔn)溶液于容量瓶中，用甲醇配制成一系列的標(biāo)準(zhǔn)工作溶液。

1.5 試驗(yàn)方法

1.5.1 樣品的預(yù)處理

將糧食去除雜質(zhì)后進(jìn)行粉碎過10目篩，稱取樣品20 g，加入5 g氯化鈉和30 mL正己烷。準(zhǔn)確加入100 mL 60%（v/v)甲醇水溶液，搖勻,然后用超聲波提取30 min。提取后，用直徑15 cm快速定性濾紙過濾。待靜置分層后，取1 mL甲醇水溶液用于凈化。

1.5.2 樣品的凈化

分別取1 mL甲醇和水對(duì)萃取柱進(jìn)行活化和平衡，然后往萃取柱中加入1 mL待凈化液，當(dāng)完全通過柱子后加1 mL水進(jìn)行清洗。清洗結(jié)束后加1 mL甲醇進(jìn)行洗脫，接收洗脫液，用甲醇將洗脫液定容至2 mL，作為測定液待分析。

1.5.3 樣品的分析

將凈化后的樣品放入進(jìn)樣盤中，按照標(biāo)準(zhǔn)曲線繪制時(shí)的液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用條件自動(dòng)進(jìn)樣測定。

2 結(jié)果與討論

2.1 液相色譜條件的優(yōu)化

2.1.1 色譜柱的選擇

流量對(duì)LC/MS有重要影響，實(shí)驗(yàn)比較了Waters ACQUITY UPLCTM BEH C18(2.1 mm×100 mm,1.7 μm)和BEH C18（2.1 mm×50 mm 1.7 μm）以及YMC-Pack ODS-AQ(4.6 mm×150 mm,3 μm)色譜柱對(duì)4種真菌毒素的分離情況，在相同流速下Waters ACQUITY UPLCTM BEH C18(2.1 mm×100 mm,1.7 μm)分離效果好，所以選擇其為本實(shí)驗(yàn)用分析柱。但不足的是玉米赤霉烯酮和赭曲霉毒素A不能分離。

表2 質(zhì)譜參數(shù)

2.1.2 流動(dòng)相的優(yōu)化

由于真菌毒素易溶于乙腈，本實(shí)驗(yàn)采用乙腈為洗脫劑。為了促進(jìn)樣品的離子化，本實(shí)驗(yàn)先后在流動(dòng)相中加入了0.1%甲酸、0.1%乙酸和10 mmol/L乙酸銨，結(jié)果表明，加入甲酸時(shí)的離子豐度最強(qiáng)，因此最終確定在流動(dòng)相中添加0.1%甲酸進(jìn)行梯度洗脫。標(biāo)準(zhǔn)溶液色譜圖見圖1。

圖1 4種真菌毒素質(zhì)譜圖

2.2 質(zhì)譜條件的優(yōu)化

根據(jù)4種真菌毒素的性質(zhì)和樣品的特性，本實(shí)驗(yàn)采用電噴霧離子源進(jìn)行離子化。實(shí)驗(yàn)中分別采用正、負(fù)兩種離子模式，發(fā)現(xiàn)正離子模式下的離子化效果明顯高于負(fù)離子模式。分別在全掃描模式和子離子掃描模式確定了4種真菌毒的質(zhì)譜參數(shù)，結(jié)果見表2。

2.3 樣品凈化條件的選擇

對(duì)于真菌毒素的萃取和凈化，目前相關(guān)文獻(xiàn)大部分使用乙腈水溶液或甲醇水溶液萃取，用免疫親和柱和多功能凈化柱凈化。本實(shí)驗(yàn)通過試驗(yàn)采用正己烷配合甲醇水溶液萃取，使用OASIS HLB 1cc（30 mg）Cartridge萃取小柱凈化。

2.4 標(biāo)準(zhǔn)曲線和檢測限

測定1.4節(jié)中的混合標(biāo)準(zhǔn)溶液，繪制標(biāo)準(zhǔn)工作曲線。按照確定的液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用條件，待儀器處于穩(wěn)定狀態(tài)后，按濃度由低到高的順序進(jìn)樣檢測分析，以真菌毒素的濃度為橫坐標(biāo)，以峰面積為縱坐標(biāo)，得到4種真菌毒素的線性方程和相關(guān)系數(shù)。計(jì)算3倍信噪比和10倍信噪比時(shí)所對(duì)應(yīng)的樣品濃度，分別作為方法的檢出限和定量限。結(jié)果見表3。

表3 線性方程、線性范圍及檢出限

2.5 方法精密度和加標(biāo)回收試驗(yàn)

將每種樣品連續(xù)重復(fù)進(jìn)樣5次，測得各組分的峰面積，計(jì)算其相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差（RSD），來衡量方法的精密度。同時(shí)將每種樣品取3份，分別添加不同體積的標(biāo)準(zhǔn)溶液，按照1.5節(jié)進(jìn)行前處理，在1.3節(jié)條件下測定，計(jì)算樣品加標(biāo)回收率。玉米樣品的回收實(shí)驗(yàn)結(jié)果見表4，其他幾種糧食樣品的回收率也都在80%～96%，各項(xiàng)數(shù)據(jù)說明該方法的精密度和回收率都比較良好；精密度分析結(jié)果見表5，RSD值均小于5%。

表4 玉米樣品加標(biāo)回收率

表5 精密度分析結(jié)果

3 結(jié)論

本實(shí)驗(yàn)建立的超高壓液相色譜-質(zhì)譜法同時(shí)檢測糧食中黃曲霉毒素B1、脫氧雪腐鐮刀菌烯醇、赭曲霉毒素A、玉米赤霉烯酮4種真菌毒素，采用梯度洗脫，在質(zhì)譜正離子掃描模式下監(jiān)測，5 min內(nèi)完成4個(gè)組分檢測。4種真菌毒素黃曲霉毒素B1、脫氧雪腐鐮刀菌烯醇、赭曲霉毒素A、玉米赤霉烯酮的檢出限分別為 0.02 μg/kg、10 μg/kg、0.5 μg/kg、0.4 μg/kg，能滿足我國國標(biāo)GB 2761—2017《食品安全國家標(biāo)準(zhǔn)食品中真菌毒素限量》對(duì)糧食中4種真菌毒素的要求。該方法靈敏度高、準(zhǔn)確性好，而且簡單快速，能在短時(shí)間內(nèi)檢測大量的樣品，可用于糧食中真菌毒素的檢測及其風(fēng)險(xiǎn)評(píng)估。