廖勤儉，安明哲，李楊華，周韓玲，王小琴，王 芳，郭 艷

（宜賓五糧液股份有限公司，四川宜賓644007）

二肽是由2個氨基酸通過一個肽鍵縮合而成的最小的肽，其兩端的氨基和羧基在一定條件下可以再次肽鍵縮合而成穩(wěn)定的環(huán)二肽。因其結(jié)構(gòu)簡單，分子量小，所以能夠通過細(xì)胞膜的滲透以原形直接進(jìn)入細(xì)胞內(nèi)，參與細(xì)胞的生長、發(fā)育、生理功能等。目前有許多對環(huán)二肽類化合物的研究報道，并發(fā)現(xiàn)許多的環(huán)二肽類化合物具有生物活性，鐘飛等[1]對近年來生物活性環(huán)二肽的發(fā)現(xiàn)及合成策略進(jìn)行了綜述，并總結(jié)出環(huán)二肽在自然界及天然產(chǎn)物中廣泛存在；盧曦元等[2]對環(huán)二肽在胞間信息傳遞、抑制毒素、促癌細(xì)胞凋亡和鎮(zhèn)痛作用方面也進(jìn)行了綜述。

酒糟黃水，是固態(tài)白酒發(fā)酵過程中酒糟的浸出液，屬于固態(tài)白酒釀造的副產(chǎn)物，其中含有豐富的微生物、糖類、蛋白質(zhì)降解物、微生物代謝產(chǎn)物、白酒的香味成分等。酒糟黃水中的蛋白，一部分來自于糧食原料，一部分來自微生物菌體，包括微生物蛋白和植物蛋白，在微生物及酸的作用下降解成小分子的肽。同時，酒糟黃水具有酒糟中的相似成分，五糧濃香型白酒特有的蒸餾方式，使得在白酒蒸餾過程中，酒糟中難揮發(fā)和不揮發(fā)的組分也會隨著蒸汽經(jīng)精餾塔似的酒糟層，帶入白酒中，如具有生物活性的環(huán)二肽類化合物，筆者此前也進(jìn)行了白酒中環(huán)二肽類化合物的研究，并檢出其中的13種環(huán)二肽[3]。在傳統(tǒng)的中醫(yī)藥理中，酒有白藥之長的說法，合理使用能有效提高中藥療效。因此，將白酒與醫(yī)學(xué)保健相聯(lián)系，研究酒糟黃水中的二肽及環(huán)二肽類生物活性成分，對于深入研究白酒中的生物活性成分，闡述這些生物活性物質(zhì)的生理活性，能夠?qū)m量飲酒促進(jìn)健康的觀點(diǎn)提供理論依據(jù)，對于酒糟黃水的回收利用也具有重要意義。

1 材料與方法

1.1 材料、儀器

酒糟黃水：取自五糧液技術(shù)研究中心。

美國Agilent公司1290系列高效液相色譜儀(HPLC)，6520B系列質(zhì)譜檢測器（Q-TOF），Agilent MassHunter數(shù)據(jù)采集工作軟件、定性定量分析軟件。

制備色譜（GX-281）。

旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀（Heizbad Hei-VAP）。

1.2 色譜條件

分析柱：Agilent Eclipse Plus C182.1×100 mm 1.8-micron。

流動相：甲醇B（液質(zhì)級），超純水A（含0.05%甲酸），0～15 min：5B-100B；15.1～20 min；100B；20.1 min；5B；22 min：stop。

柱溫：30℃。

流速：0.2 mL/min。

進(jìn)樣體積：2 μL。

1.3 質(zhì)譜條件

離子源：DESI源,正模式。

Gas Temp：325℃。

Drying Gas：10 L/min。

Nebulizer：40 psig。

Vcap：4000 v。

Fragmentor：60 v。

1.4 樣品處理

取酒糟黃水，旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)濃縮成膏狀，用無水乙醇沉淀后，取上清液，膜過濾，濾液經(jīng)制備色譜分離，分段收集，收集液作為待測樣品。

2 結(jié)果與分析

2.1 氨基酸的二級特征離子

取各氨基酸，分別用甲酸水溶液配制成濃度為1000 mg/L，進(jìn)行目標(biāo)離子掃描模式，進(jìn)行每個氨基酸的二級質(zhì)譜特征離子確定。各氨基酸對應(yīng)的分子離子、二級碎片特征離子見表1。

2.2 黃水樣品的制備分離

經(jīng)乙醇沉淀的黃水樣品，進(jìn)樣5 mL，以10 mL/min的流速乙醇水梯度洗脫，按時間收集（1 min/個）。

2.3 樣品中二肽和環(huán)二肽類化合物的質(zhì)譜定性檢測

表1 氨基酸對應(yīng)的分子離子、二級碎片特征離子

利用LC-QTOF，分析檢測各制備分離收集的樣品，先對各樣品進(jìn)行全掃描，找出具有二肽和環(huán)二肽特征的目標(biāo)離子，再針對目標(biāo)離子進(jìn)行targetms方式進(jìn)行二級質(zhì)譜圖檢測，以確定其結(jié)構(gòu)式。檢測結(jié)果見表2，各化合物的二級質(zhì)譜圖見圖1—圖32。

表2 各目標(biāo)化合物分子式、分子離子和二級碎片特征離子

圖1 Val-Ala

3 結(jié)論

由每個氨基酸碎片特征離子可以看出，氨基酸在20 eV碰撞能量下的斷裂方式具有規(guī)律性，從其一端的-COOH和-NH3上的-H斷裂，造成46 Da質(zhì)量數(shù)的丟失。環(huán)二肽在20 eV碰撞能量下的特征碎片離子與其含有的兩個氨基酸的特征碎片離子一致，由此，以氨基酸特征碎片離子解析定性二肽及環(huán)二肽類化合物具有可行性和準(zhǔn)確性。

圖2 Leu-Gly

圖3 Pro-Val

圖4 Leu-Ala

圖5 Val-Tyr

圖6 Pro-Ala

圖7 Leu-Phe

圖8 Pro-Leu

圖9 Val-Leu

通過對酒糟黃水中樣品的濃縮、萃取、制備色譜分離等前處理方式，利用高分辨高效液相色譜質(zhì)譜（LC-QTOF）分析檢測，共分離檢測出二肽和環(huán)二肽化合物32種，分別是Val-Ala，Leu-Gly，Pro-Val，Leu-Ala，Val-Tyr，Pro-Ala，Leu-Phe，Pro-Leu，Val-Leu，Pro-Phe，Val-Phe，Leu-Leu，Cyclo(Pro-Val)，Cyclo(Glu-Leu)，Cyclo(Glu-Phe)，Cyclo(Pro-Leu)，Cyclo(Ileu-Leu)，Cyclo(Pro-Phe)，Cyclo(Val-Phe)，Cyclo(Pro-Pro)，Cyclo(Val-Val)，Cyclo(Leu-Ala)，Cyclo(Val-Ala)，Cyclo(Val-Leu)，Cyclo(Phe-Phe)，Cyclo(Leu-Phe)，Cyclo(Pro-Ala)，Cyclo(Pro-Glu)，Cyclo(Pro-Tyr)，Cyclo(Pro-Thr)，Cyclo(Phe-Ala)，Cyclo(Leu-Leu)。大部分二肽都能找出對應(yīng)的環(huán)二肽，其中3種沒有檢出對應(yīng)的環(huán)二肽，可能與預(yù)處理方式有關(guān)。

圖10 Pro-Phe

圖11 Val-Phe

圖12 Leu-Leu

圖13 Cyclo(Pro-Val)

圖14 Cyclo(Glu-Leu)

圖15 Cyclo(Glu-Phe)

圖16 Cyclo(Pro-Leu)

圖17 Cyclo(Ileu-Leu)

圖18 Cyclo(Pro-Phe)

圖19 Cyclo(Val-Phe)

圖20 Cyclo(Pro-Pro)

圖21 Cyclo(Val-Val)

圖22 Cyclo(Leu-Ala)

圖23 Cyclo(Val-Ala)

圖24 Cyclo(Val-Leu)

圖25 Cyclo(Phe-Phe)

王艾晶等[4]從洋蔥伯克霍爾德菌CF-66發(fā)酵液中分離得到的Cyclo(Pro-Phe)對真菌類病原菌具有強(qiáng)烈的抑制作用。Brauns等[5]驗(yàn)證了Cyclo(Pro-Phe)在結(jié)腸癌HT-29細(xì)胞中的抑制生長的原因。從海洋放線菌H2003代謝產(chǎn)物中分離得到的Cyclo(L-Pro-L-Leu)對小鼠FT210細(xì)胞株具有弱的抗腫瘤活性[5]。李德海等[6]對海洋放線菌發(fā)酵物中生物活性成分的研究發(fā)現(xiàn)，環(huán)Cyclo(Leu-Ala)、Cyclo(Pro-Val)、Cyclo(Pro-Tyr)、Cyclo(Pro-Phe)等6種環(huán)二肽化合物具有較弱的抗腫瘤活性。可見酒糟黃水中含有較多具有抑菌活性和抗腫瘤活性的環(huán)二肽，將酒糟黃水中的環(huán)二肽類化合物分離提取并應(yīng)用具有可行性。

圖26 Cyclo(Leu-Phe)

圖27 Cyclo(Pro-Ala)

圖28 Cyclo(Pro-Glu)

圖29 Cyclo(Pro-Tyr)

圖30 Cyclo(Pro-Thr)

圖31 Cyclo(Phe-Ala)

圖32 Cyclo(Leu-Leu)