王騰飛，麥麥提艾力·阿不力克木，楊勇，陳江濤，王翀，陶穎，宋興華

(新疆醫(yī)科大學(xué)第一附屬醫(yī)院骨科中心，新疆 烏魯木齊 830054)

結(jié)核病是感染性疾病中的頭號(hào)殺手，且在全球范圍內(nèi)呈逐年上升趨勢，我國結(jié)核病疫情尤為嚴(yán)重[1]。尤其是感染艾滋病病毒的患者越來越多，增加了此類患者患有結(jié)核病的可能。脊柱結(jié)核是常見的肺外結(jié)核，約占結(jié)核患者的9%～12%[2-3]。對于脊柱結(jié)核的治療，化療是首選[4]。但骨結(jié)核血液供應(yīng)差，口服藥很難到達(dá)病灶，且8%～12%的患者具有一線抗結(jié)核藥物耐藥性。骨結(jié)核最常用的治療方法是外科手術(shù)清除病灶。而結(jié)核病灶清除后，需要在椎體缺損區(qū)域進(jìn)行植骨填補(bǔ)以支撐脊柱，否則會(huì)造成椎體塌陷，植骨能一定程度上維持脊柱的力學(xué)穩(wěn)定性。雖然自體骨移植是骨修復(fù)技術(shù)的“金標(biāo)準(zhǔn)”[5]。但自體骨來源有限，易出現(xiàn)取骨區(qū)感染、疼痛等癥狀。而且同種異體骨有免疫排斥、愈合緩慢、感染等特點(diǎn)。因此研發(fā)新型骨缺塤修復(fù)材料迫在眉睫。隨著組織工程的快速發(fā)展，人工骨作為一種良好的骨替代材料，越來越被大家所認(rèn)可[4]。羥基磷灰石與/β-磷酸三鈣(hydroxyapatite and/β-tricalcium phosphate，HA/β-TCP)構(gòu)成的復(fù)合材料是目前廣泛應(yīng)用于臨床的人工復(fù)合材料。HA/β-TCA與脂肪干細(xì)胞的復(fù)合可以更好地誘導(dǎo)骨細(xì)胞生長，促進(jìn)骨組織的生成，而且具有良好的孔隙率，有利于種子細(xì)胞與材料復(fù)合，是骨組織工程中比較理想的生物復(fù)合材料[6]。結(jié)核術(shù)后患者仍然需要長周期服用抗結(jié)核藥物，由于副作用較大，患者依從性差，使得全身用藥的臨床療效受到限制。因此，提高脊柱結(jié)核局部病變血藥濃度，增強(qiáng)滅菌能力，而且能在病灶局部形成有效的藥物濃度，尋找一種新的替代給藥途徑就顯得尤為重要[7]。緩控釋制劑可以長期緩釋藥物，控制藥物劑量，減少給藥次數(shù)，提高患者順應(yīng)性，受到廣大醫(yī)務(wù)工作者及患者的青睞。本實(shí)驗(yàn)采用利福噴丁微球作為包封藥物，采用降解可控的高分子生物材料HA/β-TC作為載體，與脂肪干細(xì)胞構(gòu)成抗結(jié)核性骨組織工程復(fù)合體，我們希望將緩控釋微球的優(yōu)點(diǎn)和新型植骨材料的特點(diǎn)結(jié)合起來，研發(fā)一種既能滿足局部長效釋藥，又能提供一定力學(xué)強(qiáng)度、促進(jìn)骨融合的新型輔助抗結(jié)核治療的植骨材料。

1 實(shí)驗(yàn)材料

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物及場所 成年健康新西蘭大白兔72只，雌雄不限，體重(3.0±0.3)kg，由新疆疾病防控中心提供。實(shí)驗(yàn)場地為新疆自治區(qū)動(dòng)物試驗(yàn)中心，飼養(yǎng)溫度及濕度適中。動(dòng)物實(shí)驗(yàn)倫理審批號(hào)：IACUC-20130217048。

1.2 實(shí)驗(yàn)儀器 超凈工作臺(tái)(賽默飛世爾科技公司)、CO2培養(yǎng)箱(力新HF240)、水浴箱(上海精密設(shè)備)、UV2550紫外可見分光光度計(jì)(日本島津)、酶標(biāo)儀(Thermo)、流式細(xì)胞儀(Beckman)，倒置顯微鏡、共聚焦熒光顯微鏡(Leica)、電鏡(上海菁華科技儀器有限公司)、獸醫(yī)用X線攝影(天地智慧ELITE 2000 Plus型)。Ingenia1.5T全數(shù)字磁共振成像儀(荷蘭Philips公司)。

1.3 實(shí)驗(yàn)試劑 低糖DMEM培養(yǎng)基、胎牛血清、磷酸鹽緩沖液PBS(HyClone)、Ⅰ型膠原酶(Worthington)、胰蛋白酶R溶液、青一鏈霉素(Gibco)、地塞米松、抗壞血酸、維生素C、β-甘油磷酸鈉、茜紅素染液、ALP檢測試劑盒、ALP染液(Sigma)、人工骨粒復(fù)合體(HA/β-TCP，Bi-Ostetic)(復(fù)合體是有60%的羥基磷灰石和40%的β-磷酸三鈣組成)。利福噴丁微球(已申請國家專利)，聚乳酸由山東醫(yī)療器械公司提供(試劑級(jí)，分子量3萬)，二氯甲烷、甲醇等試劑，細(xì)胞凋亡試劑盒(BD)均購自市售，結(jié)核桿菌由新疆畜牧科學(xué)院提供。

2 實(shí)驗(yàn)方法

2.1 兔脂肪干細(xì)胞的提取、培養(yǎng)及體外成骨誘導(dǎo)分化 選取新西蘭大白兔2只，耳緣靜脈采用3%戊巴比妥鈉(1～2 mg/kg)麻醉，在無菌手術(shù)臺(tái)下取腹股溝區(qū)脂肪組織，分離大體可見的筋膜、血管，用眼科剪剪碎，放入含有20 mL PBS管離心、震蕩消化，終止消化后加入低糖DMEM完全生長液，隔天更換培養(yǎng)基，細(xì)胞達(dá)90%融合時(shí)進(jìn)行傳代。將細(xì)胞擴(kuò)增至第3代、細(xì)胞貼壁生長達(dá)90%融合時(shí)加入成骨誘導(dǎo)培養(yǎng)液誘導(dǎo)培養(yǎng)，每3天更換1次培養(yǎng)液，4周后進(jìn)行茜素紅染色。

2.2 抗結(jié)核性骨組織工程復(fù)合體的構(gòu)建

2.2.1 制備同種異體部分脫鈣骨支架 取處死的新西蘭大白兔雙側(cè)髂骨，剔除表面脂層、肌層、筋膜、骨膜等，經(jīng)蒸餾水、1︰1的氯仿/甲醇、0.5%鹽酸充分沖洗。經(jīng)脫脂、脫鈣、脫蛋白后，修剪成約5 mm×5 mm×2 mm大小。于-20℃冷藏1 d后經(jīng)60Co-γ射線輻照滅菌，一次性封口包裝收集。

2.2.2 兔脂肪干細(xì)胞-利福噴丁微球-骨支架的復(fù)合 經(jīng)前期實(shí)驗(yàn)取得利福噴丁微球，精密稱取3 mg利福噴丁微球與400 μL的細(xì)胞懸液(細(xì)胞濃度為3×106/ mL)混勻后，緩慢均勻滴加至HA/β-TCP、同種異體骨支架空隙上，置于37℃培養(yǎng)箱中復(fù)合培養(yǎng)4 h后，待脂肪干細(xì)胞大部分貼壁后，緩慢沿皿壁加入DMEM完全生長液，計(jì)算細(xì)胞數(shù)貼壁率并定期培養(yǎng)行電鏡掃描觀察，了解三維復(fù)合后利福噴丁微球與兔脂肪干細(xì)胞在支架上的黏附、生長情況。

2.3 兔脊柱結(jié)核模型構(gòu)建及治療

2.3.1 兔脊柱結(jié)核模型的構(gòu)建 3%戊巴比妥鈉耳緣靜脈注射麻醉，術(shù)區(qū)備皮，常規(guī)消毒。鋪雙層無菌洞巾，沿L3橫突向下至髂嵴做一長約3 cm縱行切口，逐層分開皮下、脂層，肌層，充分顯露L4～5椎體及左側(cè)椎旁，開路錐沿椎間盤邊緣鉆骨孔，深度約為0.6 cm，止血后，緩慢浸注結(jié)核菌懸液0.1 mL，表面用明膠海綿填塞，逐層關(guān)閉切口。術(shù)中嚴(yán)格遵守?zé)o菌操作及安全防護(hù)術(shù)后動(dòng)物隔離分籠飼養(yǎng)。保持房間通氣良好，定時(shí)定點(diǎn)補(bǔ)食水，嚴(yán)格遵守動(dòng)物倫理等原則，術(shù)后2個(gè)月通過影像學(xué)(DR、MRI)分析，可見椎體破壞、椎間隙變窄、椎旁膿腫者即為造模成功。

2.3.2 兔脊柱結(jié)核療效的研究 取36只造模成功、感染程度相似的家兔行病灶清除術(shù)，并將其隨機(jī)分為3組，A組于骨缺損處植入rADSCs/利福噴丁微球/HA/β-TCA抗結(jié)核骨組織工程復(fù)合體，B組于骨缺損處植入rADSCs/利福噴丁微球/同種異體骨抗結(jié)核骨組織工程復(fù)合體，C組清創(chuàng)后未做任何處理。逐層嚴(yán)密縫合脂層、皮下、表皮，術(shù)區(qū)切口涂抹紅霉素，預(yù)防感染，分籠常規(guī)條件飼養(yǎng)，定時(shí)通風(fēng)換氣。

2.4 觀察指標(biāo)

2.4.1 大體觀察 術(shù)后觀察兔飲食、活動(dòng)及傷口愈合情況。處死的家兔將植骨處骨質(zhì)連同周圍骨質(zhì)一并取出，取材后觀察骨缺損修復(fù)、骨痂形成情況。

2.4.2 影像學(xué)檢查 造模2個(gè)月后行脊柱正側(cè)位DR照射及MRI檢查，了解造模情況；病灶刮除植入抗結(jié)核性骨組織工程復(fù)合體術(shù)后4、8、12周行脊柱正側(cè)位DR照射，參照Lane-sandhu X線評分法對骨缺損修復(fù)準(zhǔn)進(jìn)行評分。

2.4.3 組織病理學(xué)檢查 將取出的標(biāo)本用4%甲醛固定，常規(guī)脫鈣，標(biāo)本流水沖洗過夜，脫水，透明石蠟包埋，切片(厚度5 μm)，行HE染色，電子顯微鏡下觀察支架材料邊緣愈合情況，類骨質(zhì)、骨質(zhì)生成情況，有無炎性細(xì)胞浸潤以及利福噴丁微球降解情況。

3 結(jié) 果

3.1 兔脂肪干細(xì)胞的鏡下特點(diǎn) 鏡下可見原代rADSCs培養(yǎng)3～4 h貼壁，梭形，接種24 h后細(xì)胞基本完全貼壁，貼壁初期細(xì)胞形態(tài)不一，培養(yǎng)5～7 d后融合率高達(dá)80%～90%，傳代后rADSCs增殖速度明顯(見圖1)。

3.2 抗結(jié)核性骨組織工程復(fù)合體的鑒定 將利福噴丁微球與脂肪干細(xì)胞二維復(fù)合后與骨組織支架培養(yǎng)14 d后，期間定期更換培養(yǎng)液，電鏡掃描觀察到利福噴丁微球-rADSCs/HA/β-TCA及利福噴丁微球-rADSCs/同種異體骨兩種抗結(jié)核骨組織工程復(fù)合體表面呈不規(guī)則顆粒狀，微球緊緊黏附于細(xì)胞及支架上，微球保持圓形輪廓(見圖2～3)。

3.3 新西蘭大白兔脊柱結(jié)核模型的構(gòu)建 兔脊柱結(jié)核模型術(shù)后2個(gè)月椎旁膿腫形成(見圖4)、L4～5椎間隙變窄(見圖5)，脊柱MRI提示椎旁膿腫形成(見圖6)。

圖1 第3代兔脂肪干細(xì)胞(×10)圖2 利福噴丁微球-rADSCs/同種異體骨復(fù)合體(SEM，×1 000)

圖3 利福噴丁微球-rADSCs/HA/β-TCA復(fù)合體(SEM，×400) 圖4 膿腫形成

圖5 術(shù)后2個(gè)月X線片示椎間隙變窄，椎體側(cè)彎 圖6 MRI提示椎旁膿腫

3.4 術(shù)后實(shí)驗(yàn)動(dòng)物基本情況及標(biāo)本大體觀察 術(shù)后第1天A組1只兔子因術(shù)中牽拉傷及神經(jīng)，術(shù)后截癱；C組1只兔子因術(shù)中傷及神經(jīng)、血管，術(shù)后第2天出血過多死亡；術(shù)后第6天、7天空白組兔子因食欲不振、切口感染等原因死亡3只；術(shù)后4周實(shí)驗(yàn)對照組1只兔子行DR檢查后第2天死亡，解剖未見明顯異常，考慮行DR檢查時(shí)，運(yùn)輸途中過熱致死。其他動(dòng)物均存活良好，及時(shí)補(bǔ)充各組實(shí)驗(yàn)動(dòng)物數(shù)量，術(shù)后12周取材時(shí)，所有實(shí)驗(yàn)動(dòng)物精神、飲食可，切口無感染、化膿，局部無明顯畸形。經(jīng)空氣栓塞處死后，取出L5及相鄰椎體骨標(biāo)本，可見A組及B組骨缺損處基本修復(fù)，表面欠光滑，B組可見少量支架材料殘存，空白對照組缺損處可見有大量的纖維肉芽形成，骨缺損明顯，相鄰椎體畸形愈合(見圖7)。

a A組 b B組 c C組

3.5 影像學(xué)檢查 術(shù)后4周：A組骨缺損區(qū)少量骨痂形成，支架材料包埋于椎體缺損區(qū)，周邊可見散在高密度影(見圖8a)。B組缺損區(qū)材料填充明顯，材料與周圍骨組織界線尚清，周邊可見少許骨痂形成(見圖8b)，復(fù)合體材料與周圍組織界限模糊。C組椎體畸形，骨缺損區(qū)界線清晰，片狀低密度影，未見骨痂形成(見圖8c)。

a A組

b B組

c C組

術(shù)后8周：A組部分材料吸收，骨缺損區(qū)可見片狀密度增高影，邊界模糊(見圖9a)。B組骨缺損區(qū)可見絮狀高密度影，復(fù)合體與周圍骨組織界限模糊，可見較多骨痂形成(見圖9b)。C組脊柱側(cè)彎明顯，骨缺損未見明顯變化，缺損周邊可見點(diǎn)狀鈣化影(見圖9C)。

a A組

b B組

c C組

術(shù)后12周：A組骨缺損區(qū)復(fù)合體材料基本吸收，復(fù)合體與骨有骨性連接，兩椎體間基本融合(見圖10a)。B組骨缺損區(qū)大部分修復(fù)，部分骨痂形成，椎間隙融合，融合周邊可見高密度影，部分邊界模糊(見圖10b)。C組骨缺損區(qū)邊界尚清，缺損周邊可見片狀鈣化影，脊柱側(cè)彎明顯(見圖10c)。

a A組

b B組

c C組

根據(jù)X線片結(jié)果，按照Lane-SandhuX線評分標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行骨缺損修復(fù)的放射學(xué)評分(見表2)。

表2 各組放射學(xué)評分

3.6 組織病理學(xué)檢查 術(shù)后12周：A組材料吸收明顯，可見成熟骨組織出現(xiàn)，結(jié)構(gòu)不規(guī)則的骨小梁形成，少量成纖維細(xì)胞，新生骨組織排列規(guī)則(見圖11a)；B組部分材料殘留，可見新生骨細(xì)胞生成，纖維骨痂組織生成骨組織及少許類骨樣組織形成(見圖11b)；C組可見大量纖維結(jié)締組織，少許骨痂形成(見圖11c)。

a A組(×10) b B組(×10) c C組(×10)

4 討 論

脊柱結(jié)核是骨與關(guān)節(jié)結(jié)核中最常見的形式，在臨床上，因其具有較高的致殘率，而且面臨耐藥、復(fù)發(fā)、竇道形成等問題，給家庭及社會(huì)帶來了極大的負(fù)擔(dān)[8]。

全身聯(lián)合化療已經(jīng)是治療結(jié)核的首選方案，抗結(jié)核治療方案分為兩個(gè)階段：強(qiáng)化階段(初始階段)和持續(xù)階段，治療時(shí)間長達(dá)9個(gè)月[9]。而且在結(jié)核病治療過程中因患者抵抗力差，結(jié)核桿菌致病力強(qiáng)，骨結(jié)核口服藥很難保證局部血藥濃度。耐多藥結(jié)核病更是一種嚴(yán)峻的挑戰(zhàn)，在我國耐多藥結(jié)核病例和相關(guān)的耐多藥結(jié)核后遺癥的數(shù)量有所增加，其多見于應(yīng)用異煙肼和利福平兩種抗結(jié)核藥物后。2016年，全球約有24萬人因耐多藥結(jié)核或耐藥結(jié)核病死亡。耐多藥結(jié)核病的治療成本更高，毒性更大，并且比治療藥物易感性結(jié)核的時(shí)間更長，為我們行結(jié)核病防治帶來更大的挑戰(zhàn)[10-11]。

雖然化療是抗結(jié)核治療的基本方法，有數(shù)據(jù)顯示單純保守治療的平均脊柱塌陷為15%～20%，而及時(shí)的外科干預(yù)可以有效地降低椎體塌陷致截癱等并發(fā)癥。目前脊柱結(jié)核的外科治療多采用病灶清除術(shù)，必要時(shí)行植骨融合內(nèi)固定術(shù)，由病灶清除術(shù)后骨缺損所造成的脊柱穩(wěn)定性下降一直是外科治療所面臨的難題[12-13]。自體骨移植是骨缺損修復(fù)的“金標(biāo)準(zhǔn)”[14]，但由于自體骨來源有限，易出現(xiàn)取骨區(qū)感染、疼痛等癥狀，內(nèi)固定技術(shù)在解決因骨缺損導(dǎo)致的脊柱穩(wěn)定性下降方面具有一定的優(yōu)勢，但因術(shù)中病灶清除不徹底、術(shù)后因患者營養(yǎng)差、未進(jìn)一步正規(guī)化療等因素導(dǎo)致局部復(fù)發(fā)，給患者帶來嚴(yán)重的負(fù)擔(dān)。

在骨結(jié)核治療中，局部植入能夠有效保持抗結(jié)核藥物濃度并促進(jìn)骨缺損修復(fù)的生物工程復(fù)合體成為近來研究的熱點(diǎn)。結(jié)核性骨缺損的修復(fù)不僅需要促進(jìn)缺損愈合，更重要的是徹底的清除、消滅結(jié)核桿菌，降低復(fù)發(fā)率，減少耐藥菌的發(fā)生。自體移植技術(shù)中提供最佳的骨誘導(dǎo)性、骨傳導(dǎo)性和成骨特性。由于自體移植增加額外傷口，供區(qū)疼痛和骨供應(yīng)不足等缺點(diǎn)[15-17]，因此研發(fā)新型骨缺塤修復(fù)材料迫在眉睫。

天然高分子復(fù)合材料利用組織工程學(xué)的原理和方法，通過對缺損骨組織修復(fù)并重建，它不僅滿足自體骨的優(yōu)點(diǎn)，同時(shí)避免二次創(chuàng)傷等缺點(diǎn)[18-19]。理想的骨組織工程支架材料不僅需要具備適合細(xì)胞生長的環(huán)境及細(xì)胞親和性，而且需要維持較好的生物相容性、骨傳導(dǎo)性、高孔隙率和生物力學(xué)相容性等優(yōu)勢。種子細(xì)胞、支架材料、細(xì)胞生長和分化因子作為骨組織工程的三個(gè)基本要素[20]。理想的種子細(xì)胞應(yīng)取材方便，來源豐富，對機(jī)體損傷小，具備定向分化為成骨的能力。rADSCs是多能干細(xì)胞，具有分化成不同譜系的能力并分泌啟動(dòng)組織再生過程的旁分泌因子，且脂肪組織的供應(yīng)充足，易于分離，體外廣泛的增殖能力以及分泌促血管生成生長因子的能力使其成為治療非愈合性傷口的理想細(xì)胞類型[21-22]。HA/β-TCA構(gòu)成的復(fù)合材料是目前廣泛應(yīng)用于臨床的人工復(fù)合材料。Tang等[23]將兔自體脂肪干細(xì)胞接種于納米羥基磷灰石復(fù)合支架上，研究脊柱融合，發(fā)現(xiàn)復(fù)合體的融合率及新骨生成量明顯高于單純支架組，李海建等[24]將分化誘導(dǎo)后的rADSCs與HA/β-TCA復(fù)合材料體外培養(yǎng)，發(fā)現(xiàn)rADSCs較均勻的黏附在復(fù)合體上，并填充于支架材料微孔中，細(xì)胞在復(fù)合體上生長良好，增殖明顯。龍志成等[25]在脊柱骨缺損修復(fù)的體內(nèi)實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，將rADSCs/HA/β-TCA復(fù)合材料與rADSCs/同種異體骨進(jìn)行對比，rADSCs/HA/β-TCA具有較好的生物黏附性及促進(jìn)新骨形成的能力。

脊柱結(jié)核治療過程中，如何提高局部結(jié)核藥物的血藥濃度，降低耐藥的發(fā)生風(fēng)險(xiǎn)，減少化療副反應(yīng)是研究的重點(diǎn)，微球靶向等技術(shù)的發(fā)展為脊柱結(jié)核局部給藥提供了新的思路。因抗結(jié)核藥物的時(shí)間長、副作用大等缺點(diǎn)，如能通過改變現(xiàn)有抗結(jié)核藥物劑型，達(dá)到局部控制藥物濃度，有效降低藥物毒副作用具有重要意義，利福噴丁具有很好的脂溶性，且有效抗結(jié)核桿菌作用強(qiáng)，本課題組制備的利福噴丁微球具有較好的載藥率及包封率。吳林波等[26]將利福噴丁微球與脂肪干細(xì)胞二維復(fù)合，發(fā)現(xiàn)其利福噴丁微球?qū)ν弥靖杉?xì)胞生長、增殖的影響較小。梁求真等[27-28]在體外以同種異體骨為支架材料構(gòu)建的抗結(jié)核性骨組織工程復(fù)合體的實(shí)驗(yàn)研究，發(fā)現(xiàn)該復(fù)合體具有持續(xù)緩慢釋放藥物的性質(zhì)，且該釋藥濃度不影響rADSCs的成骨活性。本實(shí)驗(yàn)將分化誘導(dǎo)后的rADSCs與利福噴丁微球二維復(fù)合后構(gòu)建的HA/β-TCA復(fù)合材料、同種異體骨構(gòu)建的兩種抗結(jié)核性骨組織工程復(fù)合體，在脊柱結(jié)核造成的骨缺損的對比研究中發(fā)現(xiàn)以HA/β-TCA為支架構(gòu)建的抗結(jié)核性骨組織工程復(fù)合體，利于骨缺損的修復(fù)，而且具有較好的生物相容性。該方案為結(jié)核性骨缺損修復(fù)材料進(jìn)行初步研究和探索，為構(gòu)建抗結(jié)核性骨組織工程復(fù)合體的局部治療提供一種新的思路，為臨床治療提供一種方法。但因脂肪干細(xì)胞與利福噴丁微球相關(guān)方面研究較少，且構(gòu)建的抗結(jié)核骨組織工程復(fù)合體在實(shí)驗(yàn)動(dòng)物脊柱結(jié)核模型中的動(dòng)物數(shù)量較少，且觀察時(shí)間短，對該復(fù)合材料體內(nèi)藥物特征及成骨修復(fù)方面需進(jìn)一步研究。

綜上所述，以HA/β-TCA為支架材料構(gòu)建的利福噴丁微球抗結(jié)核性骨組織工程復(fù)合體具有良好的生物相容性及成骨性，可以通過增加局部藥物濃度抑制結(jié)核桿菌生長，減少椎體骨質(zhì)破壞，在動(dòng)物實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)研究中，對脊柱結(jié)核具有一定的治療作用。