張 楊,吳仁人,楊 戈,汪 光,王一舒,林凱榮,李開明,鐘 杰

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西江流域地表水微生物污染定量源解析

張 楊1,2,吳仁人2,3*,楊 戈4,汪 光2,3,王一舒2,3,林凱榮1*,李開明2,3,鐘 杰5

(1.中山大學水資源與環(huán)境系,廣東 廣州 510275；2.環(huán)境保護部華南環(huán)境科學研究所,廣東 廣州 510530；3.廣東省水與大氣污染防治重點實驗室,廣東 廣州 510530；4.肇慶市環(huán)境保護監(jiān)測站,廣東 肇慶 526040；5.仲愷農(nóng)業(yè)工程學院環(huán)境科學與工程學院,廣東 廣州 510550)

水體微生物污染標記物的源強特征是定量解析微生物污染來源的關鍵.應用實時熒光定量PCR(qPCR)技術(shù)分別對人源(qHS601F/qBac725R)、牛源(BacB2-590F/Bac708Rm)、豬源(Bac41F/Bac163R)及禽類(qC160F-HU/qBac265R-HU)特異性擬桿菌引物的源強特征進行了探索,并進一步對西江流域廣東段進行微生物污染來源定量解析,結(jié)果表明:針對不同目標宿主,不同特異性擬桿菌引物的源強特征為人源(qHB)>豬源(qPB)>牛源(qRB)>禽類(qCB),DNA模板濃度對引物的源強特征影響較小.選取的目標研究區(qū)域水體普遍受到人、豬、牛及禽類糞便污染.干流中qHB、qCB及qPB自上游至下游緩慢升高.各支流中qHB、qCB及qPB的平均濃度較干流均上升了1個數(shù)量級,qRB在不同河段變化較小.說明下游河段的生活污水、豬源及禽類糞便污染較為嚴重,牛源污染的影響較小.統(tǒng)計分析顯示在污染水平較高的各支流中,人源特異性擬桿菌引物與傳統(tǒng)指示菌具有一定的相關性(<0.05),說明生活污水是傳統(tǒng)指示菌濃度較高的主要原因,且為持續(xù)排放源.

微生物污染；源強；定量；西江

潛藏于畜禽糞便及生活污水中的病原微生物是威脅人類健康的主要原因之一,我國大部分地表水均已受到不同程度的病原微生物污染[1].為有效治理水體中的微生物污染,歐美等發(fā)達國家已率先開發(fā)出了人[2]、豬[3]、牛[4]、雞[5]等動物的宿主特異性引物,成功識別了部分地區(qū)地表水或近海水域微生物污染來源[6-7].我國研究人員也相繼在部分地區(qū)篩選出適用于目標研究區(qū)域的宿主特異性擬桿菌標記[8-10],并對其實際應用的有效性進行了探索.

然而,由于特異性標記是針對不同動物腸道菌的特異性片段開發(fā)而來,因此,不同標記的源強特征也不盡相同.例如,有研究表明當致病菌濃度上升至對3%接觸人群帶來潛在威脅時,引物HF183的檢出濃度為4200copies/100mL,而HumM2為2800copies/100mL[11].同為針對人源擬桿菌特異性片段開發(fā)出的引物,源強特征具有明顯差異.

目前,我國關于微生物污染源解析技術(shù)的研究尚處于起步階段,對宿主特異性標記的源強特征研究較少,且與現(xiàn)行的地表水環(huán)境質(zhì)量標準(GB3838- 2002)相脫節(jié)[12],這對管理部門制定相應的標準帶來了困難.本研究選取了適用于珠江三角洲地區(qū)的人及常見畜禽動物擬桿菌特異性標記,探索其對宿主糞便的源強特征.同時,以西江流域廣東段為目標研究區(qū)域,定量解析了不同來源的糞源微生物在水體中的濃度水平,并探索了與傳統(tǒng)指示菌之間的相關關系, 以期為該地區(qū)地表水微生物污染的有效控制提供科學依據(jù).

1 材料與方法

1.1 儀器與試劑

主要儀器: Quanti-tray 97孔定量盤(IDEXX公司),生化培養(yǎng)箱(三洋公司),冷凍離心機(Sigma公司), 核酸蛋白分析儀(DU730,BeckMan Coulter公司),紫外可見分光光度計(DR2800,HACH公司),熒光定量PCR儀(LightCycler 480Ⅱ,Roche公司),多模塊基因擴增儀(FlexCycler2,耶拿公司).T-Green藍光切膠儀(TIANGEN公司).

主要試劑:COD低量程預制試劑(HACH公司),科立得試劑(IDEXX公司),HiPure Water DNA Kit (D3145-02,Magen公司), TIANamp Stool DNA Kit (DP328-02,TIANGEN公司),Talent qPCR PreMix (TIANGEN公司),瓊脂糖(Biowest,電泳級),Universal DNA Purification Kit(DP214-03, TIANGEN公司), TIANprep Mini Plasmid Kit(DP103-03, TIANGEN公司).

1.2 研究區(qū)域概況

圖1 西江流域采樣點分布示意

選取西江流域封開城上至富灣水廠段作為目標研究區(qū)域,對其微生物污染的來源組成及污染強度進行了解析.該流域封開城上至三榕峽段沿線分布著封開縣、郁南縣、德慶縣等人口密度相對較小的縣級行政區(qū)以及人口相對較密集的云浮市城區(qū). 該河段主要支流包括賀江、羅定江、南山河等.其中,賀江流經(jīng)封開縣城,由江口鎮(zhèn)左岸匯入西江.羅定江流經(jīng)羅定縣、郁南縣,在郁南縣境內(nèi)匯入西江.南山河流經(jīng)云浮市城區(qū)后匯入西江.三榕峽至富灣水廠段主要經(jīng)過肇慶市城區(qū),附近人口較為密集,且養(yǎng)殖業(yè)數(shù)量及規(guī)模均大于上游河段. 該河段存在的主要支流為新興江和北江支流.新興江主要流經(jīng)云浮市新興縣和肇慶市高要區(qū),于高要區(qū)匯入西江.北江支流為西江與北江的混流通道,附近存在較多農(nóng)田.具體采樣點如圖1所示.

1.3 樣品采集

糞便樣品:2017年7月~2017年9月,在珠江三角洲地區(qū)多個畜禽養(yǎng)殖場內(nèi)采集豬、牛、雞的糞便樣品,在廣州市某醫(yī)院采集人糞樣品.糞便樣品共計40份,其中人10份,豬10份,牛10份,雞10份.樣品采集后置于冰盒中,6h內(nèi)送回實驗室放入-80℃冰箱中保存,留待后續(xù)處理.

水體樣品:根據(jù)圖1設置的采樣點進行水樣采集.所有樣品采集后進行編號,并保存于冰盒中,6h內(nèi)運抵實驗室進行過濾,過濾后富集微生物的濾膜置于-80℃冰箱中,留待DNA提取.過濾方法見1.4.3.

1.4 分析方法

1.4.1 水體中理化指標的測定 COD的測定采用HACH公司低量程(LR)重鉻酸鉀法預制試劑.氨氮的測定采用納氏試劑分光光度法(HJ 535-2009).總磷采用鉬酸銨分光光度法(GB 11893-1989)進行測定.總氮的測定采用堿性過硫酸鉀消解紫外分光光度法(HJ 636—2012).

1.4.2 傳統(tǒng)指示菌的測定 傳統(tǒng)指示菌的測定采用固定酶底物法.取100mL水樣分別加入滅菌瓶中,同時加入科立得試劑進行混勻.當試劑在水樣中完全溶解后,轉(zhuǎn)移至97孔定量盤內(nèi),進行封口.大腸埃希氏菌的培養(yǎng)放入(37.0±0.2)℃生化培養(yǎng)箱培養(yǎng),糞大腸菌群則放入(44.5±0.2)℃生化培養(yǎng)箱中培養(yǎng),24h后進行計數(shù).

1.4.3 DNA提取 糞便DNA提取:糞便樣品DNA的提取按照TIANGEN公司DP328-02試劑盒說明書進行提取.每份糞便樣品均稱量0.2g.洗脫液TB均加入40μL.

水體DNA提取:采用0.22μm濾膜過濾100mL水樣,使菌體留在濾膜上.并按照水體DNA提取試劑盒的說明書提取留在菌體上的DNA.DNA樣品置于-20℃冰箱中保存.

1.4.4 qPCR分析 通過總細菌引物、通用擬桿菌引物、大腸埃希氏菌引物及各宿主特異性擬桿菌引物對提取的DNA進行擴增,引物序列如表1所示.qPCR擴增體系:SYBR Green Talent qPCR Premix(2×)(購自TIANGEN公司)10μL; 上、下游引物各0.8μL;DNA 模板2μL;ddH2O補足反應體系至20μL.qPCR擴增程序:①預變性,95℃,30s;②變性,95℃,5s;③退火延伸,60℃,1min.40 個循環(huán). 擴增體系與程序參照TIANGEN公司 Talent qPCR PreMix說明書.

表1 特征生物標記引物

1.4.5 標準曲線的制作 以提取的各基因組DNA為模板,通過引物對其進行PCR擴增.純化回收擴增后的目標產(chǎn)物,并與pMD 19-T Vector載體相連接,轉(zhuǎn)化至DH5α感受態(tài)細胞.通過含有抗生素氨芐的固體培養(yǎng)基挑取陽性克隆,提取質(zhì)粒DNA進行測序.基因序列提交至GenBank 進行同源性比對,結(jié)果顯示(未列出),人源qHB、豬源qPB、牛源qRB、雞源qCB特異性擬桿菌引物及通用擬桿菌引物qGB與通用引物互補的序列均為各自目標菌株不同株系的16S rRNA 基因片段,說明所選引物有較高的特異性.總細菌引物qTB中含有梭菌屬、不動桿菌等其他多種菌株的核酸序列.

采用超微量分光光度計測定提取的質(zhì)粒DNA濃度,并對各質(zhì)粒進行10倍梯度稀釋,稀釋為10-1,10-2,10-3,10-4,10-5,10-6,10-77個梯度.以各梯度的DNA為模板,進行qPCR擴增,每個梯度設置3個重復.qPCR反應結(jié)束后,根據(jù)結(jié)果,采用SPSS 22軟件制作標準曲線,并計算擴增效率().引物標準曲線的2均大于0.99,結(jié)果可信.擴增效率()是根據(jù)標準曲線斜率來確定的,兩者符合公式=10(-1/Slope)-1.若一個反應的標準曲線斜率為-3.32,則擴增效率= 100%[10].一般認為擴增效率()在90%~110%之間是可接受的.研究中涉及的pair-t test及Pearson相關性分析也均采用SPSS 22軟件進行.

2 結(jié)果與討論

2.1 宿主特異性擬桿菌引物的源強特征分析

每份糞便樣品分別稱取0.2g進行DNA提取.提取過程中,為判斷不同宿主糞便DNA提取效果的差異,洗脫液TB均加入40μL.提取結(jié)果如表2所示.

表2 不同宿主糞便的DNA提取效果

由于糞便中不僅含有腸道微生物,還存在消化酶、未消化的食物、膽堿、多糖等多種雜質(zhì),會降解DNA并抑制PCR反應[17].因此,保證目標DNA的提取純度和濃度是后續(xù)實驗的關鍵.由表2可知,不同樣本提取的基因組A260/280均介于1.8~2.0之間,基因組純度較高.然而,以等量糞便和等體積洗脫液獲得的DNA濃度差異較大.其中,人糞樣本的DNA濃度均值為109.91ng/μL,顯著高于其它樣品(< 0.05).豬糞樣品中得到的DNA濃度最低(71.16ng/ μL),顯著小于同為哺乳動物的人和牛(<0.05).不同動物的腸道微生物多樣性及密度等因素均會影響DNA的提取濃度.已有研究表明,哺乳動物腸道內(nèi)的微生物密度遠高于其他物種[18].而本研究中,由牛糞和豬糞中獲得的DNA濃度均小于雞,這與王海鷹等[8]在珠江三角洲地區(qū)篩選擬桿菌引物時獲取的DNA濃度結(jié)果較為相似,表明糞便DNA的提取濃度不僅與腸道微生物的密度與多樣性相關,還受到其它多種因素干擾.例如,當糞便脫離宿主時,水分含量的不同也會對DNA提取濃度產(chǎn)生影響[19].

為排除DNA濃度對引物源強特征的干擾,分別將各目標DNA稀釋至10ng/μL后進行qPCR.同時,對未作稀釋處理的DNA模板進行同步擴增,用于對比DNA濃度和引物源強特征對定量源解析的影響程度.結(jié)果如圖2所示.

由圖2(a)可以看出,當DNA模板濃度相同時,qHB的平均濃度可達9.72Log10(copy numbers)/g,檢出水平較高,說明該引物對人糞污染具有較好的靈敏性,在人源糞便污染強度較小或污染物被稀釋的情況下,也能檢測到相應的特異性擬桿菌片段.其次為qPB、qRB和qCB,分別較qHB下降了0.21, 0.24,2.77Log10(copy numbers)/g,說明qCB的靈敏性顯著低于其它引物,若以qCB作為評價指標,可能會導致低估環(huán)境中禽類糞便的污染水平.對比未稀釋至等濃度DNA模板的擴增結(jié)果可知(圖2b),二者檢出濃度由高至低的排序結(jié)果一致,表明不同的DNA濃度對qPCR定量結(jié)果影響較小.總體而言,擬桿菌在人、豬、牛等哺乳動物腸道中為優(yōu)勢菌群[20].而大多數(shù)禽類腸道中的梭狀芽胞桿菌和芽孢桿菌等含量均高于擬桿菌[5].因此,哺乳動物糞便中的擬桿菌檢出率明顯大于禽類[8].相應地,各擬桿菌標記物的源強特征也表現(xiàn)為單位質(zhì)量糞便下,哺乳動物擬桿菌引物的檢出拷貝數(shù)普遍大于禽類擬桿菌引物.

圖2 不同動物的特異性擬桿菌引物源強分析 Fig.2 Source strength analysis of specific Bacteroides primers in different animals

2.2 擬桿菌標記物的濃度水平

圖3 西江流域各引物總體檢出水平

應用qPCR技術(shù)對西江流域廣東段干流及附近支流展開微生物污染定量源解析.流域內(nèi)各引物總體檢出濃度情況如圖3所示.通用擬桿菌引物(qGB)在流域內(nèi)的變化范圍在6.09~10.15Log10(copy numbers)/100mL,平均值為7.7Log10(copy numbers)/ 100mL,檢出水平顯著高于特異性擬桿菌引物(<0.05),說明qGB盡管不含有特異性基因片段,不能識別微生物污染來源,但可以避免低估糞便污染水平[22].當以特異性擬桿菌引物考察流域內(nèi)微生物污染源強時,污染強度依次為qHB>qCB>qPB>qRB,人源糞便即生活污水對該流域的污染較為嚴重.

2.3 不同來源微生物污染的分布特征

目標研究區(qū)域的干流共布設了7個采樣點.由于G4~G7河段附近的城市化水平相比于G1~G4河段較高,因此在分析目標流域微生物污染時以G1~G4為目標河流的上游,G4~G7為下游.從圖4(a)可以看出,干流下游的qHB、qCB、qPB和qRB的污染水平均要高于上游,平均濃度分別增加了0.41, 0.48,0.68,0.12Log10(copy numbers/100mL).已有研究表明,地表水的微生物污染強度與流域的土地開發(fā)程度、利用類型等密切相關[21,23].目標研究區(qū)域的下游段流經(jīng)肇慶市主城區(qū),城鎮(zhèn)、居民區(qū)、養(yǎng)殖場較上游更為密集.因此,生活污水及養(yǎng)殖廢水對下游各河段的影響較大.然而,盡管下游的污染水平有所升高,但相比于上游均未超出1個數(shù)量級.這是由于西江干流的流量較大,對污染物的稀釋作用及水體自凈能力較強,因此附近的糞便排放源未對干流的總體水質(zhì)造成影響.另一方面,擬桿菌作為腸道菌[24],脫離宿主進入有氧環(huán)境后會快速衰減[6],而微生物污染排放源可能距離干流較遠,在遷移的過程中發(fā)生較為明顯的衰減,這在一定程度上也影響了擬桿菌的檢出率及檢出水平.

進一步對各支流的微生物污染進行分析,結(jié)果如圖4(b)所示.各支流的微生物污染也主要以人源為主,其次為禽類、豬源和牛源.與干流相比,支流中qHB、qCB及qPB的平均濃度明顯上升1個數(shù)量級,qRB也高出0.5個數(shù)量級,說明糞便排放源主要位于各支流附近.同時,各引物在不同支流的波動范圍較干流也更大,qHB、qCB、qPB、qRB的檢出范圍分別在6.73~9.55,6.81~8.25,3.64~7.37,3.80~ 5.56Log10(copy numbers/100mL),表明各支流的微生物污染特征差異明顯.再結(jié)合各支流采樣點周邊的環(huán)境特征可以看出,河流中的微生物污染源強與存在于周圍的潛在污染源具有較強關聯(lián).例如,目標研究區(qū)域下游各支流采樣點附近的商業(yè)區(qū)、居民區(qū)及養(yǎng)豬場明顯多于上游.同時,下游的潛在污染源普遍距離附近河流較近,各支流水質(zhì)受生活污水和養(yǎng)殖廢水影響較大,qHB與qPB濃度明顯上升,其中D2、E3和E5采樣點尤為嚴重.值得注意的是,D2、E3采樣點附近還存在污水處理廠.已有研究表明[25],經(jīng)污水處理廠處理后的生活污水中仍含有大量的擬桿菌標記,尤其以人源特異性標記為主.因此當污水處理廠的排放量較大時,也會導致河流中qHB的顯著升高.而E3、E5點處豬源糞便污染水平的急劇增加也是導致干流G7采樣點qPB明顯上升的主要原因.

圖4 西江流域干流和沿線支流特異性引物濃度

在上游河段,位于G2~G3之間的羅定江(B1)流經(jīng)羅定縣和郁南縣,在郁南縣匯入西江.B2所在南山河主要接納了云浮城區(qū)的生活污水及部分養(yǎng)殖廢水,工業(yè)污染相對較少.B3所在悅城河也流經(jīng)莫村鎮(zhèn)、永豐鎮(zhèn)等多個城鎮(zhèn),最后于悅城鎮(zhèn)匯入西江.同時,B1、B2、B3采樣點附近存在的居民區(qū)及養(yǎng)殖場也較A1、A2采樣點更為密集.因此,B1、B2、B3受生活污水和養(yǎng)殖廢水影響也更為嚴重, qPB較A1、A2增加了1個數(shù)量級,qHB與qCB也分別上升了0.11,0.28Log10(copy numbers/100mL).然而,相比于A1、A2下游的干流監(jiān)測點G2,位于B1、B2、B3下游的監(jiān)測點G3可能由于距離各支流采樣點距離較遠,其各引物濃度反而小于G2.

盡管qPCR技術(shù)可以分析水體微生物污染特征,但該方法由于缺少統(tǒng)一的評價標準以及對引物遷移、衰減規(guī)律的充分認識,仍存在部分缺陷.例如,對流域微生物污染水平的分析結(jié)果顯示,除E3點外,各采樣點qCB濃度均高于qPB,接近于qHB.結(jié)合引物源強實驗結(jié)果可知,若qCB濃度較高,流域內(nèi)禽類養(yǎng)殖污染水平應遠大于其它各污染源.然而,通過實地調(diào)研發(fā)現(xiàn)目標研究區(qū)域仍以人為活動影響為主,且養(yǎng)豬場數(shù)量較多,與監(jiān)測結(jié)果具有一定差異.這可能是由不同引物之間特異性的差距導致.盡管引物源強分析結(jié)果顯示qCB的靈敏性相比于qPB較差,但已有研究報道qPB的特異性顯著大于qCB[9].因此,不排除qCB在實際應用中出現(xiàn)假陽性結(jié)果.隨著歐美等發(fā)達國家對微生物污染源解析技術(shù)的深入研究,研究者們已發(fā)現(xiàn)部分引物在驗證階段雖然靈敏度與特異性均符合要求(>80%),但在實際應用中,當樣本量逐漸增加以及不同性質(zhì)水體對引物源強特征的干擾,假陽性表現(xiàn)越來越頻繁,使得部分宿主特異性引物在非目標宿主污染的水體中得到檢出[19].同時,qCB也不能區(qū)分家禽及野生飛禽的污染[15],因此qCB的檢出不能完全歸于養(yǎng)殖廢水的排放.此外,不同引物在環(huán)境中的衰減速率也不盡相同,這會導致不能準確定量分析各污染源的污染水平.例如,Skolova等[22]在研究人源和反芻動物擬桿菌引物在水體中的衰減規(guī)律時發(fā)現(xiàn),人源擬桿菌引物BacH在第8d仍可檢出,而牛源擬桿菌引物BacR在第6d已降至檢測線以下.在本研究中,qPB的濃度顯著小于qCB.同時,干流中G1~G6采樣點qPB的檢出濃度也均小于qRB,這可能是由于qPB衰減速率較快導致分析結(jié)果與流域內(nèi)養(yǎng)殖分布的實際情況存在一定差異.因此,在應用擬桿菌特異性標記分析水體污染特征時,應預先針對目標研究區(qū)域及所選引物進行引物特性驗證,分析其在不同環(huán)境條件下的遷移、衰減規(guī)律,對不同的宿主特異性引物建立相關檢出標準,以便研究者們能夠準確定量分析水體中微生物污染源強.

2.4 微生物標記與傳統(tǒng)指示菌的相關性

由于擬桿菌標記對水體中DO的變化較為敏感,因此FIB與擬桿菌標記物的搭配使用是一種監(jiān)測微生物污染的有效策略[26-28],可以判斷出FIB濃度升高的主要貢獻源及持續(xù)污染源.例如,Shane等[29]在研究指示菌的衰減規(guī)律時指出,擬桿菌標記物在環(huán)境中的衰減速率顯著大于FIB,對糞便污染的指示性有時間限制.因此根據(jù)標記物與FIB的相關關系,可以判斷出水體中的持續(xù)污染源[30].對照本研究中擬桿菌引物與傳統(tǒng)指示菌的相關性分析可知,在水質(zhì)較好的干流中,微生物標記與傳統(tǒng)指示菌不具有顯著的相關性(未列出).而在微生物污染水平較高的各支流中(表3),qHB與CEC、CFC相關性較好(<0.05),這與之前的文獻中指出在以人源糞便污染為主的城市地表水中,人源擬桿菌特異性引物與傳統(tǒng)指示菌具有較好的相關性報道一致[9],說明生活污水是導致西江流域各支流CEC、CFC濃度較高的主要原因.同時,可以初步判斷生活污水為該流域的持續(xù)污染源.

表3 特異性擬桿菌引物與傳統(tǒng)指示菌的相關性分析

注:表示相關系數(shù);表示顯著性,<0.05顯著相關.

3 結(jié)論

3.1 各特異性擬桿菌引物針對等濃度及非等濃度DNA模板的源強特征均為qHB>qPB>qRB>qCB.引物的源強特征受DNA濃度影響較小.

3.2 在目標研究區(qū)域水體,干流中的qHB、qCB、qPB呈現(xiàn)出隨河流流向緩慢升高的趨勢.而各支流監(jiān)測點中的qHB、qCB及qPB較干流均上升了1個數(shù)量級,qRB上升了0.5個數(shù)量級.下游各支流的qHB、qCB及qPB的平均濃度也均高于上游河段,而qRB略有下降,說明該流域下游水體受人源、豬源和禽類的污染強度明顯高于上游,但牛源糞便污染對水質(zhì)影響較小.

3.3 在污染水平較高的支流中,qHB與傳統(tǒng)指示菌具有一定的相關性(<0.05),表明生活污水是導致傳統(tǒng)指示菌濃度較高的主要原因,且對水體造成了持續(xù)污染.

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Quantitative source analysis of microorganism pollution in the surface water in Xijiang River Basin.

ZHANG Yang1,2, WU Ren-ren2,3*, YANG Ge4, WANG Guang2,3, WANG Yi-shu2,3, LIN Kai-rong1*, LI Kai-ming2,3, ZHONG Jie5

(1.Department of Water Resources and Environment, Sun Yat-sen University, Guangzhou 510275, China；2.South China Institute of Environmental Sciences, Ministry of Environmental Protection, Guangzhou 510530, China；3.The key Laboratory of Water and Air Pollution Control of Guangdong Province, Guangzhou 510530, China；4.Zhaoqing environmental protection monitoring station, Zhaoqing 526040, China；5.Department of Environmental Science and Engineering, Zhongkai University of Agriculture and Technology, Guangzhou 510550, China)., 2018,38(10)：3889~3896

Understanding the characteristic of source strength of the microbial gene marker is the key for quantitative analyzing the microbial contamination from different sources. In this study, the source strength of human-(qHS601F/qBac725R), porcine-(Bac41F/Bac163R), cattle-(BacB2-590F/Bac708Rm) and poultry-specific(qC160F-HU/qBac265R-HU) bacteroides primers were explored by qPCR method, and then quantitative analysis of the source and level of microbial pollution in Xijiang river in Guangdong province. The results showed that the source strength of different specific bacteroides primers was human(qHB)>porcine(qPB)>cattle(qRB)>poultry(qCB). The concentration of DNA had little effect on source strength of each primers. The selected target area was generally contaminated by human, pig, cattle and poultry feces. The concentration of human, porcine and poultry-specific primers were increased slowly from upstream to downstream in the main stream. In the tributary, the mean concentration of human-, porcine- and poultry-specific primers were increased 1-order magnitude compared to the main stream. qRB had little change in different section of the river. This suggests that the pollution of domestic sewage, porcine source and poultry excrement in the downstream was more serious. The influence of cattle source pollution was not significant. Statistic analysis showed that human-specific premier had a significant correlation with traditional fecal indicator bacteria in the tributary which had high level of fecal pollution(FIB)(<0.05). It reflected that human source was the major reason for the high concentration of FIB, and human feces was the persistent pollution source.

microbial pollution；source strength；quantitative；Xijiang river

X522

A

1000-6923(2018)10-3889-08

張 楊(1988-),男,寧夏銀川人,中山大學與環(huán)境保護部華南環(huán)境科學研究所聯(lián)合培養(yǎng)博士研究生,主要從事環(huán)境微生物研究.發(fā)表論文4篇.

2018-03-27

國家自然科學基金資助項目(41303054);中央級公益性科研院所基本科研業(yè)務專項(PM-zx703-201701-044);公益性行業(yè)科研專項資助項目(201509027);廣東省自然科學基金資助項目(2015A030313850)

* 責任作者, 吳仁人, 副研究員 wurenren@scies.org; 林凱榮, 教授, linkr@mail.sysu.edu.cn