薛潔，廖昕玥，俞春娜，薛婧萍，馮尚國(guó)，王慧中，展曉日

(浙江省藥用植物種質(zhì)改良與質(zhì)量控制技術(shù)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室 杭州師范大學(xué)生命與環(huán)境科學(xué)學(xué)院，浙江 杭州 310036)

苦蘵(PhysalisangulataL.)是茄科酸漿屬一年生草本植物，是一種民間常用的藥用植物，其根、莖、葉、宿萼、果實(shí)均可用藥。其化學(xué)成分主要為甾體類(酸漿苦味素類和睡茄內(nèi)酯類)、黃酮類、有機(jī)酸類、多糖類等化合物[1]，具有清熱，利尿，解毒，消腫之功?，F(xiàn)代藥理研究發(fā)現(xiàn)，苦蘵具有抗腫瘤、抗氧化、免疫調(diào)節(jié)、抗炎、抗菌等藥理活性[2-6]。黃酮類化合物作為其主要有效成分之一，具有保護(hù)心血管、抗肝臟毒、抗炎、抗菌、抗病毒等作用[7]。但目前苦蘵化學(xué)成分及質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)研究多集中于甾體類化合物，對(duì)苦蘵中黃酮類化合物研究相對(duì)較少。本研究針對(duì)苦蘵中總黃酮的提取及含量測(cè)定方法進(jìn)行了研究，為更加有效地開發(fā)和利用苦蘵提供一定的科學(xué)依據(jù)。

1 儀器與試藥

1.1 儀器

Evolution 201 紫外分光光度計(jì)(美國(guó)Thermo公司)；MS104S電子天平(瑞士梅特勒公司)；DHG9203A電熱恒溫鼓風(fēng)干燥箱(上海精宏實(shí)驗(yàn)設(shè)備有限公司)；KQ5200DE超聲波清洗器(昆山市超聲儀器有限公司)；5418R離心機(jī)(德國(guó)Eppendorf公司)等。

1.2 試劑

蘆丁對(duì)照品購(gòu)自中國(guó)食品藥品檢定研究院(批號(hào)100080-201409)；乙醇，亞硝酸鈉，硝酸鋁，氫氧化鈉等均為分析純；水為蒸餾水。

苦蘵果實(shí)采自不同產(chǎn)地，經(jīng)杭州師范大學(xué)生命與環(huán)境科學(xué)學(xué)院馮尚國(guó)老師鑒定為茄科酸漿屬苦蘵的果實(shí)。將其宿萼剝下，40 ℃烘干48 h，粉碎，過(guò)40目(孔徑0.42 mm)篩，備用。

1.3 溶液的制備

1.3.1 供試品

取苦蘵宿萼粉末約0.02 g，精密稱定，于 2 mL離心管中，加入1.2 mL體積分?jǐn)?shù)為30%的乙醇水溶液，超聲提取60 min。12 000 r·min-1離心10 min，取上清液，備用。

1.3.2 對(duì)照品

取蘆丁適量，精密稱定，于容量瓶中，30%乙醇溶解并定容至刻度，搖勻，即得0.1 mg·mL-1的對(duì)照品儲(chǔ)備溶液。

2 結(jié)果與分析

2.1 方法學(xué)的考察

2.1.1 線性關(guān)系

分別精密吸取對(duì)照品儲(chǔ)備液溶液1、2、3、4、5 mL于10 mL容量瓶中，加入5%亞硝酸鈉0.4 mL，搖勻，靜置6 min，加10%硝酸鋁0.4 mL，搖勻，靜置6 min，加1 mol·L-1的氫氧化鈉4 mL，再加30%乙醇定容至刻度，搖勻，靜置15 min，以空白對(duì)照液調(diào)零，在波長(zhǎng)505 nm處測(cè)定吸光度，以吸光度(Y)為縱坐標(biāo)，以濃度(X)為橫坐標(biāo)，進(jìn)行線性回歸，得蘆丁標(biāo)準(zhǔn)曲線。其線性回歸方程：Y=1.009X-0.004，r=0.999 5，說(shuō)明0.1～0.5 mg·mL-1，線性關(guān)系良好。

2.1.2 精密度

精密吸取對(duì)照品儲(chǔ)備液3 mL，共6份。按2.1.1節(jié)方法操作，測(cè)定吸光度?？傸S酮含量的相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差為1.38%，說(shuō)明儀器精密度良好。

2.1.3 穩(wěn)定性

精密吸取對(duì)照品儲(chǔ)備液3 mL，按2.1.1節(jié)方法操作。分別放置0、15、30、45、60 min，測(cè)定其吸光度?？傸S酮含量的相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差為0.93%，說(shuō)明在60 min內(nèi)穩(wěn)定性良好。

2.1.4 重復(fù)性

取同一批苦蘵宿萼粉末6份，按1.3.1節(jié)樣品溶液制備方法進(jìn)行制備，按2.1.1節(jié)方法操作，測(cè)定吸光度。總黃酮含量的相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差為0.99%，說(shuō)明該方法重復(fù)性良好。

通過(guò)分析，對(duì)于細(xì)菌總數(shù)最優(yōu)組合為A3B3C3；對(duì)于揮發(fā)性鹽基氮最優(yōu)組合為A3B3C3；對(duì)于pH值最優(yōu)組合是A1B1C3。綜合評(píng)定，確定最優(yōu)組合為A3B3C3，即乳酸鏈球菌素0.50%，茶多酚0.30%，植酸0.20%。

2.1.5 加樣回收率

取已知含量的同一批苦蘵宿萼粉末0.02 g，6份，精密稱定，精密加入對(duì)照品儲(chǔ)備液1 mL，按1.3.1節(jié)樣品溶液制備方法進(jìn)行制備。按2.1.1節(jié)方法操作，測(cè)量吸光值，計(jì)算加樣回收率。

總黃酮的平均回收率為98.0%，相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差為1.00%，說(shuō)明加樣回收率符合要求。

2.2 苦蘵總黃酮提取工藝的優(yōu)化

2.2.1 單因素試驗(yàn)

分別考察乙醇體積分?jǐn)?shù)、提取時(shí)間、料液比對(duì)苦蘵總黃酮提取的影響。

乙醇體積分?jǐn)?shù)對(duì)苦蘵總黃酮提取的影響。按料液比1∶50加入體積分?jǐn)?shù)分別為30%、40%、50%、60%、70%、80%、90%的乙醇超聲提取60 min，12 000 r·min-1離心10 min，取上清液，測(cè)定樣品總黃酮含量。

由圖1可知，隨著乙醇體積分?jǐn)?shù)的不斷增加，總黃酮得率先增加后減少。當(dāng)乙醇體積分?jǐn)?shù)為40%時(shí)，總黃酮得率最高。

圖1 乙醇體積分?jǐn)?shù)對(duì)總黃酮得率的影響

提取時(shí)間對(duì)苦蘵總黃酮提取的影響。按料液比1∶50，加入體積分?jǐn)?shù)為40%的乙醇溶液，分別超聲提取15、30、45、60、75 min，測(cè)定樣品總黃酮含量。

由圖2可知，隨著提取時(shí)間的增加，總黃酮得率先增加后減少。當(dāng)提取時(shí)間增加到60 min時(shí)，總黃酮得率最高。

圖2 提取時(shí)間對(duì)總黃酮得率的影響

料液比對(duì)苦蘵總黃酮提取的影響。分別按1∶20、1∶30、1∶40、1∶50、1∶60、1∶70的料液比(m/V)用體積分?jǐn)?shù)為40%的乙醇超聲提取60 min，測(cè)定樣品總黃酮含量。

由圖3可知，隨著料液比的不斷增大，總黃酮得率逐漸增加。當(dāng)料液比為1∶50時(shí)，總黃酮得率最高。

圖3 料液比對(duì)總黃酮得率的影響

2.2.2 正交試驗(yàn)

根據(jù)單因素實(shí)驗(yàn)結(jié)果，選用L9(34)因素水平表進(jìn)行正交試驗(yàn)。1～3水平，乙醇體積分?jǐn)?shù)(A)分別為30%、40%和50%，提取時(shí)間(B)分別為30、45和60 min，料液比(m/V，C)分別為1∶40、1∶50和1∶60。有關(guān)結(jié)果見表1。

表1 多因素對(duì)總黃酮含量的影響

由表1分析可知：不同因素對(duì)總黃酮提取效果的影響順序?yàn)锳>C>B，即乙醇體積分?jǐn)?shù)>料液比>提取時(shí)間?？嗵u總黃酮的最佳提取條件為A1B3C3，即30% 乙醇溶液，料液比1∶60，提取60 min。

2.3 不同產(chǎn)地苦蘵中總黃酮的含量

取不同產(chǎn)地苦蘵宿萼粉末，按2.1.1節(jié)方法制備供試品溶液，按1.3.2節(jié)加入5%亞硝酸鈉0.4 mL在波長(zhǎng)505 nm處測(cè)定吸光度，計(jì)算不同產(chǎn)地苦蘵中總黃酮的含量(表2)。

表2 不同產(chǎn)地苦蘵的總黃酮含量

3 小結(jié)

結(jié)合單因素試驗(yàn)和正交試驗(yàn)，比較了乙醇體積分?jǐn)?shù)、料液比、提取時(shí)間3個(gè)因素對(duì)苦蘵總黃酮提取率的影響，確定了苦蘵總黃酮的最佳提取工藝為30%乙醇溶液，料液比1∶60，提取60 min。并采用亞硝酸鈉-硝酸鋁-氫氧化鈉比色法測(cè)定了苦蘵中總黃酮的含量，該方法操作簡(jiǎn)便、快速、準(zhǔn)確，為苦蘵的進(jìn)一步開發(fā)利用提供了一種可行的質(zhì)量控制方法。