羅 軒， 韓 冰， 田 甜， 余 蕾， 鄭 璐， 湯 雷， 楊 婷， 楊 勤， 謝汝佳△， 黃建釗

(1貴州醫(yī)科大學， 貴州 貴陽 550025； 2貴州醫(yī)科大學附屬人民醫(yī)院， 貴州 貴陽 550002)

內質網(wǎng)是細胞內重要的細胞器，其主要的生理作用是對細胞內合成的蛋白質進行修飾和折疊，從而使之形成正確的構象。此外，內質網(wǎng)還參與類固醇激素的合成、脂質代謝以及Ca2+的儲存[1]。內質網(wǎng)應激(endoplasmic reticulum stress，ERS)是指在有害因素的刺激下引起內質網(wǎng)的生理功能發(fā)生紊亂，從而導致大量錯誤折疊或未折疊的蛋白質在內質網(wǎng)腔內聚集的一種亞細胞器的病理過程[2]。通過ERS可使錯誤折疊或未折疊的蛋白質恢復正確的構象，因此適度的ERS是細胞進行自我保護的一種重要機制[3]，但是過度的ERS也會對細胞造成不可逆的損傷甚至促進細胞凋亡的發(fā)生[4]。目前越來越多的研究發(fā)現(xiàn)，許多肝臟疾病，如非酒精性脂肪肝、酒精性肝病、病毒性肝炎及肝纖維化均與ERS引起的細胞凋亡有關[5-7]。因此，深入研究ERS介導細胞凋亡的分子機制可以為臨床上各種肝臟疾病的防治提供新的思路和方法。鈣蛋白酶2 (calpain-2)是一種鈣離子依賴性的高度保守的蛋白水解酶。近年來有研究發(fā)現(xiàn)，calpain-2可能通過激活特異定位于內質網(wǎng)表面的caspase-12，啟動ERS介導的細胞凋亡過程，從而加重組織細胞的損傷[8]。本研究擬用ERS誘導劑二硫蘇糖醇(dithiothreitol，DTT)誘導體外培養(yǎng)的大鼠正常肝細胞株BRL-3A發(fā)生ERS，觀察在ERS狀態(tài)下肝細胞內calpain-2及ERS介導凋亡過程中關鍵信號分子caspase-12的表達變化，并探討它們在ERS介導細胞凋亡過程中的作用。

材 料 和 方 法

1 材料

大鼠正常肝細胞株BRL-3A購自中國科學院典型培養(yǎng)物保藏中心昆明細胞庫(編號為KCB92013YJ)；DMEM、胎牛血清和0.25% 胰酶購自GIBCO；DTT、MTT和二甲基亞砜購自Genview；Triton X-100購自Amresco；抗兔DyLight 549及抗兔Alexa Fluor 488熒光 II 抗、免疫染色固定液、洗滌液、封閉液、 I 抗稀釋液、Annexin V-異硫氰酸熒光素(fluorescein isothiocyanate，F(xiàn)ITC)細胞凋亡檢測試劑盒及蛋白定量試劑盒均購自南京碧云天生物技術研究所；抗calpain-2、cleaved caspase-12及cleaved caspase-3抗體購自Cell Signaling Technology；抗葡萄糖調節(jié)蛋白78(glucose-regulated protein 78，GRP78)抗體購自Abcam；抗caspase-12和caspase-3抗體購自北京博奧森生物技術有限公司；TRIzol由Invitrogen提供；SYBR Green購自大連寶生物工程有限公司；逆轉錄試劑盒購自Fermentas；增強化學發(fā)光試劑盒及聚偏二氟乙烯(polyvinylidene difluoride，PVDF)膜購自Millipore； β-actin、calpain-2、caspase-12、caspase-3及GRP78引物購自上海捷瑞生物工程有限公司。

2 方法

2.1細胞培養(yǎng)及傳代 BRL-3A細胞用含10%胎牛血清和1%青、鏈霉素的DEME培養(yǎng)液于37 ℃、5% CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，普通倒置顯微鏡觀察細胞生長狀態(tài)，每隔2～3 d進行換液，待細胞生長至80%～90% 融合狀態(tài)時用0.25% 胰酶消化進行傳代培養(yǎng)。

2.2MTT法篩選DTT的合適藥物濃度 用0.25% 胰蛋白酶消化并收集處于對數(shù)生長期的BRL-3A細胞，細胞計數(shù)后調整細胞懸液濃度至5×108/L，在96孔細胞培養(yǎng)板中每孔加入100 μL的細胞懸液，待細胞單層鋪滿孔底后，分別加入終濃度為0.5、1.0、2.0、2.5、4.0和6.0 mmol/L的DTT。同時設置正常對照孔(不加DTT處理)和空白調零孔(加DTT不加細胞)，上述每組均設5個復孔。37 ℃，5% CO2培養(yǎng)箱中繼續(xù)孵育24 h。每孔加入20 μL MTT溶液(5 g/L)，繼續(xù)培養(yǎng)4 h。從培養(yǎng)箱中取出96孔細胞培養(yǎng)板，小心吸去孔內培養(yǎng)液，每孔加入150 μL 二甲基亞砜，置搖床上低速振蕩10 min，使結晶物充分溶解。在全波長酶標儀490 nm處測量各孔的吸光度(A)值。

2.3DTT處理體外培養(yǎng)的BRL-3A細胞 根據(jù)MTT實驗結果，給予終濃度為2.5 mmol/L的DTT處理細胞，處理時間為12 h和24 h，同時設置不加DTT處理的細胞為正常對照(control)組。

2.4Real-time PCR檢測calpain-2、caspase-12、caspase-3及GRP78的mRNA水平 用0.25% 胰蛋白酶消化并收集各實驗組細胞，向細胞沉淀中加入1.0 mL TRIzol提取肝細胞總RNA。嚴格按照Fermentas逆轉錄試劑盒說明書將總RNA逆轉錄合成cDNA，隨后以DNA為模板進行real-time PCR，反應體系配制及反應條件嚴格按照說明書執(zhí)行。以β-actin為內參照，2-ΔΔCt法[9]計算calpain-2、caspase-12、caspase-3和GRP78的mRNA相對表達量。引物序列見表1。

表1 Real-time PCR實驗引物序列

2.5細胞免疫熒光檢測calpain-2、GRP78、caspase-12及caspase-3的蛋白表達 經DTT處理后的細胞小心吸去培養(yǎng)液，每孔加入1.0 mL 免疫染色固定液室溫固定15 min；棄固定液，每孔加入1.0 mL 免疫染色洗滌液，搖床上漂洗3次，每次5 min，然后加入免疫染色封閉液于搖床上封閉1 h，棄封閉液后加入 I 抗[GRP78(1∶100)、calpain-2(1∶100)、caspase-12(1∶200)和caspase-3(1∶100)]進行孵育，于搖床上 4 ℃振搖過夜；次日棄去 I 抗，用免疫染色洗滌液漂洗3次，每次5 min,加入熒光染料標記的 II 抗(1∶1 000)，室溫避光孵育 1 h，免疫染色洗滌液避光漂洗3次，每次5 min,將抗熒光淬滅封片劑滴加于載玻片上，將細胞爬片從培養(yǎng)板內取出，將細胞面貼于封片劑上，熒光倒置顯微鏡下觀察并拍照。應用Image-Pro Plus圖像分析軟件對每個視野下熒光強度計算平均灰度值(總灰度值/灰度區(qū)域)。

2.6Western blot檢測cleaved caspase-12及cleaved caspase-3的蛋白表達 在各組細胞中加入0.5 mL細胞裂解液裂解細胞，將收集的細胞裂解液12 000 r/min離心20 min，收集上清并檢測蛋白濃度。將各組蛋白進行SDS-PAGE，電泳后經轉膜、封閉，隨后加入cleaved caspase-12(1∶1 000)及cleaved caspase-3(1∶800)I 抗孵育過夜。次日，用洗膜緩沖液洗膜3次，每次5 min，然后加入II 抗(1∶1 000)室溫孵育2 h，洗膜緩沖液充分洗膜后加入增強化學發(fā)光試劑進行成像。采用Image Lab圖像分析軟件對條帶灰度值進行半定量分析。

2.7N-琥珀?；?亮氨酰-酪氨酰-7-胺基-4-甲基香豆素(N-Suc-Leu-Tyr-7-amido-4-methylcoumarin，N-Suc-Leu-Tyr-AMC)底物法測定calpain-2活性 取含80 μg總蛋白的肝細胞勻漿液，加入1.0 mL反應緩沖液(145 mmol/L NaCl、100 mmol/L Tris-HCl，pH 7.3)，37 ℃水浴箱中振蕩10 min，加入150 μL 的500 μmol/L 的N-Suc-Leu-Tyr-AMC，37 ℃水浴箱中振蕩60 min，在熒光分光光度計上測定熒光強度(激發(fā)波長360 nm，發(fā)射波長440 nm)，以N-Suc-Leu-Tyr-AMC與肝細胞勻漿反應釋放出AMC的熒光強度來代表不同樣品中calpain-2的活性。

2.8流式細胞術檢測細胞凋亡 DTT處理細胞的方法同前。用0.25% 胰蛋白酶消化細胞，適時終止消化并收集各實驗組細胞。用10 mL 磷酸鹽緩沖液(phosphate-buffered saline，PBS)洗滌細胞2次，1 000 r/min離心5 min，棄PBS。加入195 μL Annexin V-FITC結合液重懸細胞沉淀，然后加入5 μL Annexin V-FITC染料，輕輕混勻，室溫避光孵育10 min。1 000 r/min離心5 min，棄上清液。加入190 μL Annexin V-FITC結合液重懸細胞沉淀，加入10 μL碘化丙啶(propidium iodide，PI)染料，輕輕混勻，上流式細胞儀進行檢測。

3 統(tǒng)計學處理

所有數(shù)據(jù)均用SPSS 19.0統(tǒng)計軟件分析，計量資料以均數(shù)±標準差(mean±SD)表示。多組數(shù)據(jù)的差異采用單因素方差分析(one-way ANOVA)，兩兩比較采用LSD法進行。以P<0.05表示差異有統(tǒng)計學意義。

結 果

1 MTT法測定不同濃度DTT處理BRL-3A細胞后細胞的存活率

不同濃度DTT處理BRL-3A細胞24 h后，經MTT法測定各組細胞的存活率發(fā)現(xiàn)，DTT抑制BRL-3A細胞存活的50%抑制濃度(IC50)為4.0 mmol/L。為了降低DTT對BRL-3A細胞的毒性作用，在后續(xù)實驗中，選用接近2/3 IC50的濃度即2.5 mmol/L作為DTT的最佳作用濃度。不同濃度DTT處理BRL-3A細胞后細胞存活率的變化見圖1。

Figure 1.The viability of BRL-3A cells treated with DTT at different concentrations was measured by MTT assay. Mean±SD.n=5.*P<0.01vscontrol group.

圖1MTT法測定不同濃度DTT處理BRL-3A細胞后細胞的存活率

2 Real-time PCR 檢測DTT處理BRL-3A細胞后GRP78、calpain-2、caspase-12及caspase-3的mRNA水平

Real-time PCR結果顯示，BRL-3A細胞經DTT處理12 h及24 h后，GRP78、calpain-2及caspase-12的mRNA表達較正常對照組顯著升高(P<0.01)，而caspase-3的mRNA水平與正常對照組比較無顯著變化，見圖2。

Figure 2.The mRNA expression of GRP78, calpain-2, caspase-12 and caspase-3 in the BRL-3A cells treated with DTT. Mean±SD.n=5.**P<0.01vscontrol group;##P<0.01vsDTT (12 h) group.

圖2DTT處理BRL-3A細胞后GRP78、calpain-2、caspase-12及caspase-3的mRNA表達變化

3 細胞免疫熒光法檢測DTT處理BRL-3A細胞后GRP78、calpain-2、caspase-12及caspase-3的蛋白表達

細胞免疫熒光檢測發(fā)現(xiàn)GRP78、calpain-2、caspase-12及caspase-3蛋白主要分布于細胞胞漿內。BRL-3A細胞經DTT處理12 h及24 h后，胞漿中GRP78、calpain-2、caspase-12及caspase-3蛋白水平較正常對照組顯著升高(P<0.01),見圖3。

4 Western blot檢測DTT處理BRL-3A細胞后cleaved caspase-12及cleaved caspase-3的蛋白表達

Western blot結果顯示，BRL-3A細胞經DTT處理12 h及24 h后，細胞中cleaved caspase-12及cleaved caspase-3蛋白較正常對照組明顯增多(P<0.01),見圖4。

5 N-Suc-Leu-Tyr-AMC底物法檢測DTT處理BRL-3A細胞后calpain-2活性的變化

經DTT處理12 h及24 h后，BRL-3A細胞中calpain-2的活性較正常對照組顯著增高(P<0.01),見圖5。

6 流式細胞術檢測細胞凋亡的變化

正常對照組僅有少量細胞發(fā)生凋亡；經DTT處理12 h后，細胞凋亡率較正常對照組顯著增加；DTT處理細胞24 h后，細胞凋亡率進一步增高(P<0.01)，見圖6。

討 論

細胞凋亡是受細胞外微環(huán)境和細胞內基因調控的一種細胞主動性死亡方式，許多生理及病理因素都可以誘導肝細胞發(fā)生凋亡[10-13]。肝細胞凋亡是一柄雙刃劍，一方面與肝臟的生理活動密切相關，通過肝細胞凋亡可調節(jié)肝組織正常的細胞更新、增殖以及再生，而另一方面，如果肝細胞過度凋亡也可導致肝臟的損傷和肝臟疾病的發(fā)生。例如病毒性肝炎、自身免疫性肝炎以及肝纖維化等多種肝病都表現(xiàn)為大量肝細胞凋亡，從而影響肝臟的功能，加速病情的惡化。因此，深入了解肝細胞凋亡的發(fā)生機制可為臨床上防治各種肝臟疾病提供新的思路和方法。

內質網(wǎng)是細胞內重要的細胞器，參與蛋白質的合成、修飾、折疊以及維持細胞內Ca2+穩(wěn)定，在內膜系統(tǒng)中占有中心地位[14]。凡是能引起內質網(wǎng)攝取、釋放Ca2+障礙或蛋白質加工、運輸障礙的因素均能導致ERS的發(fā)生。GRP78屬于熱休克蛋白(heat shock protein，HSP)70 家族，是細胞內重要的分子伴侶，其主要作用是促進未折疊/錯誤折疊蛋白進行正確折疊。ERS時由于大量未折疊/錯誤折疊蛋白在內質網(wǎng)腔中堆積，GRP78表達上調有助于蛋白質的正確折疊，恢復內質網(wǎng)的正常功能，從而促進細胞的存活。因此，GRP78可作為ERS的標志蛋白[15]。本次研究采用DTT(一種可影響蛋白質翻譯后修飾的物質)誘導體外培養(yǎng)的大鼠正常肝細胞BRL-3A發(fā)生ERS反應，經real-time PCR和細胞免疫熒光檢測GRP78的表達發(fā)現(xiàn)，隨著DTT刺激時間的延長，細胞內GRP78在mRNA及蛋白水平的表達逐漸增高，提示采用2.5 mmol/L的DTT誘導BRL-3A細胞發(fā)生ERS是成功的。

ERS的程度及持續(xù)時間決定了應激細胞的結局。一定程度的ERS能激活細胞的保護機制，例如增加內質網(wǎng)分子伴侶表達及減少蛋白質合成來改善細胞的狀態(tài)，發(fā)揮保護細胞的作用；相反，當應激原強度超過細胞自身處理能力時，保護機制不能與損傷抗衡，ERS則可通過啟動細胞凋亡途徑來清除受損的細胞[16-17]。Caspase-12作為內質網(wǎng)外膜上的促凋亡分子，是ERS介導細胞凋亡的特異性啟動蛋白酶之一，其活化是ERS介導凋亡的中心環(huán)節(jié)[18]。研究發(fā)現(xiàn)，敲除caspase-12基因的細胞雖然仍對其它各種凋亡誘導因素敏感，但對ERS誘導的凋亡可產生耐受[19]，說明caspase-12信號通路是ERS介導細胞凋亡的特有信號通路之一。本次研究發(fā)現(xiàn)，給予2.5mmol/L DTT處理BRL-3A細胞后，細胞中caspase-12的mRNA及活性caspase-12蛋白的水平均較正常對照組顯著增加，說明在內質網(wǎng)應激狀態(tài)下，不僅caspase-12的mRNA水平上調且蛋白質活性也是增加的。本研究還觀察了caspase-12下游促凋亡蛋白caspase-3的表達變化，結果發(fā)現(xiàn)DTT處理細胞后caspase-3的mRNA水平未發(fā)生顯著變化，但活性caspase-3蛋白較正常對照組顯著增加，提示內質網(wǎng)應激不能上調caspase-3 mRNA水平，但可增加其蛋白活性，這可能與caspase-12活化后進一步激活其下游的caspase-3有關。采用流式細胞術對細胞凋亡的檢測發(fā)現(xiàn)，隨著DTT刺激時間的延長，細胞凋亡率逐步增加。上述結果表明DTT處理BRL-3A細胞后可通過激活caspase-12/caspase-3信號通路促進細胞凋亡的發(fā)生。但關于caspase-12/caspase-3信號通路是如何激活的，目前尚不清楚，推測可能與calpain-2有關。

Figure 3.The immunofluorescence observation for the protein levels of GRP78, calpain-2, caspase-12 and caspase-3 in the BRL-3A cells treated with DTT (×200). Mean±SD.n=3.**P<0.01vscontrol group.

圖3細胞免疫熒光顯示DTT處理BRL-3A細胞后GRP78、calpain-2、caspase-12及caspase-3蛋白水平的比較

Figure 4.The protein levels of cleaved caspase-12 and cleaved caspase-3 in the BRL-3A cells treated with DTT. Mean±SD.n=3.*P<0.01vscontrol group.

圖4DTT處理BRL-3A細胞后cleavedcaspase-12及cleavedcaspase-3的蛋白表達水平

Figure 5.The change of calpain-2 activity in BRL-3A cells treated with DTT. Mean±SD.n=3.*P<0.01vscontrol group.

圖5DTT處理BRL-3A細胞后calpain-2活性變化

Calpain-2是鈣離子依賴性的蛋白水解酶[20]，近年來有研究發(fā)現(xiàn)，calpain-2可能通過激活特異定位于內質網(wǎng)表面的caspase-12，啟動ERS介導的細胞凋亡過程，從而加重組織細胞的損傷[21]。本次研究結果發(fā)現(xiàn)，DTT處理BRL-3A細胞后，細胞中calpain-2的mRNA及蛋白的表達較正常對照組顯著增加。進一步對calpain-2的活性進行檢測發(fā)現(xiàn)，經DTT處理后BRL-3A細胞中calpain-2的活性較正常對照組顯著增加。由于calpain-2是細胞內的一種蛋白水解酶，其活性增加可導致多種底物蛋白的水解，這其中可能也包括對caspase-12的水解和激活。有研究發(fā)現(xiàn)ERS時calpain-2可移位到內質網(wǎng)，并對位于內質網(wǎng)上的caspase-12進行水解，從而激活caspase-12[8]。上述結果提示ERS狀態(tài)下calpain-2表達上調及活性增加可能通過激活ERS凋亡通路中關鍵信號分子caspase-12從而介導細胞凋亡過程。

Figure 6.The apoptosis of BRL-3A cells treated with DTT was detected by flow cytometry. Mean±SD.n=3.**P<0.01vscontrol group.

圖6流式細胞術檢測DTT處理BRL-3A細胞后細胞凋亡率的變化