羅 軒， 韓 冰， 田 甜， 余 蕾， 鄭 璐， 湯 雷， 楊 婷， 楊 勤， 謝汝佳△， 黃建釗

(1貴州醫(yī)科大學(xué)， 貴州 貴陽 550025； 2貴州醫(yī)科大學(xué)附屬人民醫(yī)院， 貴州 貴陽 550002)

內(nèi)質(zhì)網(wǎng)是細(xì)胞內(nèi)重要的細(xì)胞器，其主要的生理作用是對細(xì)胞內(nèi)合成的蛋白質(zhì)進(jìn)行修飾和折疊，從而使之形成正確的構(gòu)象。此外，內(nèi)質(zhì)網(wǎng)還參與類固醇激素的合成、脂質(zhì)代謝以及Ca2+的儲存[1]。內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激(endoplasmic reticulum stress，ERS)是指在有害因素的刺激下引起內(nèi)質(zhì)網(wǎng)的生理功能發(fā)生紊亂，從而導(dǎo)致大量錯誤折疊或未折疊的蛋白質(zhì)在內(nèi)質(zhì)網(wǎng)腔內(nèi)聚集的一種亞細(xì)胞器的病理過程[2]。通過ERS可使錯誤折疊或未折疊的蛋白質(zhì)恢復(fù)正確的構(gòu)象，因此適度的ERS是細(xì)胞進(jìn)行自我保護(hù)的一種重要機(jī)制[3]，但是過度的ERS也會對細(xì)胞造成不可逆的損傷甚至促進(jìn)細(xì)胞凋亡的發(fā)生[4]。目前越來越多的研究發(fā)現(xiàn)，許多肝臟疾病，如非酒精性脂肪肝、酒精性肝病、病毒性肝炎及肝纖維化均與ERS引起的細(xì)胞凋亡有關(guān)[5-7]。因此，深入研究ERS介導(dǎo)細(xì)胞凋亡的分子機(jī)制可以為臨床上各種肝臟疾病的防治提供新的思路和方法。鈣蛋白酶2 (calpain-2)是一種鈣離子依賴性的高度保守的蛋白水解酶。近年來有研究發(fā)現(xiàn)，calpain-2可能通過激活特異定位于內(nèi)質(zhì)網(wǎng)表面的caspase-12，啟動ERS介導(dǎo)的細(xì)胞凋亡過程，從而加重組織細(xì)胞的損傷[8]。本研究擬用ERS誘導(dǎo)劑二硫蘇糖醇(dithiothreitol，DTT)誘導(dǎo)體外培養(yǎng)的大鼠正常肝細(xì)胞株BRL-3A發(fā)生ERS，觀察在ERS狀態(tài)下肝細(xì)胞內(nèi)calpain-2及ERS介導(dǎo)凋亡過程中關(guān)鍵信號分子caspase-12的表達(dá)變化，并探討它們在ERS介導(dǎo)細(xì)胞凋亡過程中的作用。

材 料 和 方 法

1 材料

大鼠正常肝細(xì)胞株BRL-3A購自中國科學(xué)院典型培養(yǎng)物保藏中心昆明細(xì)胞庫(編號為KCB92013YJ)；DMEM、胎牛血清和0.25% 胰酶購自GIBCO；DTT、MTT和二甲基亞砜購自Genview；Triton X-100購自Amresco；抗兔DyLight 549及抗兔Alexa Fluor 488熒光 II 抗、免疫染色固定液、洗滌液、封閉液、 I 抗稀釋液、Annexin V-異硫氰酸熒光素(fluorescein isothiocyanate，F(xiàn)ITC)細(xì)胞凋亡檢測試劑盒及蛋白定量試劑盒均購自南京碧云天生物技術(shù)研究所；抗calpain-2、cleaved caspase-12及cleaved caspase-3抗體購自Cell Signaling Technology；抗葡萄糖調(diào)節(jié)蛋白78(glucose-regulated protein 78，GRP78)抗體購自Abcam；抗caspase-12和caspase-3抗體購自北京博奧森生物技術(shù)有限公司；TRIzol由Invitrogen提供；SYBR Green購自大連寶生物工程有限公司；逆轉(zhuǎn)錄試劑盒購自Fermentas；增強(qiáng)化學(xué)發(fā)光試劑盒及聚偏二氟乙烯(polyvinylidene difluoride，PVDF)膜購自Millipore； β-actin、calpain-2、caspase-12、caspase-3及GRP78引物購自上海捷瑞生物工程有限公司。

2 方法

2.1細(xì)胞培養(yǎng)及傳代 BRL-3A細(xì)胞用含10%胎牛血清和1%青、鏈霉素的DEME培養(yǎng)液于37 ℃、5% CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，普通倒置顯微鏡觀察細(xì)胞生長狀態(tài)，每隔2～3 d進(jìn)行換液，待細(xì)胞生長至80%～90% 融合狀態(tài)時(shí)用0.25% 胰酶消化進(jìn)行傳代培養(yǎng)。

2.2MTT法篩選DTT的合適藥物濃度 用0.25% 胰蛋白酶消化并收集處于對數(shù)生長期的BRL-3A細(xì)胞，細(xì)胞計(jì)數(shù)后調(diào)整細(xì)胞懸液濃度至5×108/L，在96孔細(xì)胞培養(yǎng)板中每孔加入100 μL的細(xì)胞懸液，待細(xì)胞單層鋪滿孔底后，分別加入終濃度為0.5、1.0、2.0、2.5、4.0和6.0 mmol/L的DTT。同時(shí)設(shè)置正常對照孔(不加DTT處理)和空白調(diào)零孔(加DTT不加細(xì)胞)，上述每組均設(shè)5個復(fù)孔。37 ℃，5% CO2培養(yǎng)箱中繼續(xù)孵育24 h。每孔加入20 μL MTT溶液(5 g/L)，繼續(xù)培養(yǎng)4 h。從培養(yǎng)箱中取出96孔細(xì)胞培養(yǎng)板，小心吸去孔內(nèi)培養(yǎng)液，每孔加入150 μL 二甲基亞砜，置搖床上低速振蕩10 min，使結(jié)晶物充分溶解。在全波長酶標(biāo)儀490 nm處測量各孔的吸光度(A)值。

2.3DTT處理體外培養(yǎng)的BRL-3A細(xì)胞 根據(jù)MTT實(shí)驗(yàn)結(jié)果，給予終濃度為2.5 mmol/L的DTT處理細(xì)胞，處理時(shí)間為12 h和24 h，同時(shí)設(shè)置不加DTT處理的細(xì)胞為正常對照(control)組。

2.4Real-time PCR檢測calpain-2、caspase-12、caspase-3及GRP78的mRNA水平 用0.25% 胰蛋白酶消化并收集各實(shí)驗(yàn)組細(xì)胞，向細(xì)胞沉淀中加入1.0 mL TRIzol提取肝細(xì)胞總RNA。嚴(yán)格按照Fermentas逆轉(zhuǎn)錄試劑盒說明書將總RNA逆轉(zhuǎn)錄合成cDNA，隨后以DNA為模板進(jìn)行real-time PCR，反應(yīng)體系配制及反應(yīng)條件嚴(yán)格按照說明書執(zhí)行。以β-actin為內(nèi)參照，2-ΔΔCt法[9]計(jì)算calpain-2、caspase-12、caspase-3和GRP78的mRNA相對表達(dá)量。引物序列見表1。

表1 Real-time PCR實(shí)驗(yàn)引物序列

2.5細(xì)胞免疫熒光檢測calpain-2、GRP78、caspase-12及caspase-3的蛋白表達(dá) 經(jīng)DTT處理后的細(xì)胞小心吸去培養(yǎng)液，每孔加入1.0 mL 免疫染色固定液室溫固定15 min；棄固定液，每孔加入1.0 mL 免疫染色洗滌液，搖床上漂洗3次，每次5 min，然后加入免疫染色封閉液于搖床上封閉1 h，棄封閉液后加入 I 抗[GRP78(1∶100)、calpain-2(1∶100)、caspase-12(1∶200)和caspase-3(1∶100)]進(jìn)行孵育，于搖床上 4 ℃振搖過夜；次日棄去 I 抗，用免疫染色洗滌液漂洗3次，每次5 min,加入熒光染料標(biāo)記的 II 抗(1∶1 000)，室溫避光孵育 1 h，免疫染色洗滌液避光漂洗3次，每次5 min,將抗熒光淬滅封片劑滴加于載玻片上，將細(xì)胞爬片從培養(yǎng)板內(nèi)取出，將細(xì)胞面貼于封片劑上，熒光倒置顯微鏡下觀察并拍照。應(yīng)用Image-Pro Plus圖像分析軟件對每個視野下熒光強(qiáng)度計(jì)算平均灰度值(總灰度值/灰度區(qū)域)。

2.6Western blot檢測cleaved caspase-12及cleaved caspase-3的蛋白表達(dá) 在各組細(xì)胞中加入0.5 mL細(xì)胞裂解液裂解細(xì)胞，將收集的細(xì)胞裂解液12 000 r/min離心20 min，收集上清并檢測蛋白濃度。將各組蛋白進(jìn)行SDS-PAGE，電泳后經(jīng)轉(zhuǎn)膜、封閉，隨后加入cleaved caspase-12(1∶1 000)及cleaved caspase-3(1∶800)I 抗孵育過夜。次日，用洗膜緩沖液洗膜3次，每次5 min，然后加入II 抗(1∶1 000)室溫孵育2 h，洗膜緩沖液充分洗膜后加入增強(qiáng)化學(xué)發(fā)光試劑進(jìn)行成像。采用Image Lab圖像分析軟件對條帶灰度值進(jìn)行半定量分析。

2.7N-琥珀?；?亮氨酰-酪氨酰-7-胺基-4-甲基香豆素(N-Suc-Leu-Tyr-7-amido-4-methylcoumarin，N-Suc-Leu-Tyr-AMC)底物法測定calpain-2活性 取含80 μg總蛋白的肝細(xì)胞勻漿液，加入1.0 mL反應(yīng)緩沖液(145 mmol/L NaCl、100 mmol/L Tris-HCl，pH 7.3)，37 ℃水浴箱中振蕩10 min，加入150 μL 的500 μmol/L 的N-Suc-Leu-Tyr-AMC，37 ℃水浴箱中振蕩60 min，在熒光分光光度計(jì)上測定熒光強(qiáng)度(激發(fā)波長360 nm，發(fā)射波長440 nm)，以N-Suc-Leu-Tyr-AMC與肝細(xì)胞勻漿反應(yīng)釋放出AMC的熒光強(qiáng)度來代表不同樣品中calpain-2的活性。

2.8流式細(xì)胞術(shù)檢測細(xì)胞凋亡 DTT處理細(xì)胞的方法同前。用0.25% 胰蛋白酶消化細(xì)胞，適時(shí)終止消化并收集各實(shí)驗(yàn)組細(xì)胞。用10 mL 磷酸鹽緩沖液(phosphate-buffered saline，PBS)洗滌細(xì)胞2次，1 000 r/min離心5 min，棄PBS。加入195 μL Annexin V-FITC結(jié)合液重懸細(xì)胞沉淀，然后加入5 μL Annexin V-FITC染料，輕輕混勻，室溫避光孵育10 min。1 000 r/min離心5 min，棄上清液。加入190 μL Annexin V-FITC結(jié)合液重懸細(xì)胞沉淀，加入10 μL碘化丙啶(propidium iodide，PI)染料，輕輕混勻，上流式細(xì)胞儀進(jìn)行檢測。

3 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

所有數(shù)據(jù)均用SPSS 19.0統(tǒng)計(jì)軟件分析，計(jì)量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差(mean±SD)表示。多組數(shù)據(jù)的差異采用單因素方差分析(one-way ANOVA)，兩兩比較采用LSD法進(jìn)行。以P<0.05表示差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

結(jié) 果

1 MTT法測定不同濃度DTT處理BRL-3A細(xì)胞后細(xì)胞的存活率

不同濃度DTT處理BRL-3A細(xì)胞24 h后，經(jīng)MTT法測定各組細(xì)胞的存活率發(fā)現(xiàn)，DTT抑制BRL-3A細(xì)胞存活的50%抑制濃度(IC50)為4.0 mmol/L。為了降低DTT對BRL-3A細(xì)胞的毒性作用，在后續(xù)實(shí)驗(yàn)中，選用接近2/3 IC50的濃度即2.5 mmol/L作為DTT的最佳作用濃度。不同濃度DTT處理BRL-3A細(xì)胞后細(xì)胞存活率的變化見圖1。

Figure 1.The viability of BRL-3A cells treated with DTT at different concentrations was measured by MTT assay. Mean±SD.n=5.*P<0.01vscontrol group.

圖1MTT法測定不同濃度DTT處理BRL-3A細(xì)胞后細(xì)胞的存活率

2 Real-time PCR 檢測DTT處理BRL-3A細(xì)胞后GRP78、calpain-2、caspase-12及caspase-3的mRNA水平

Real-time PCR結(jié)果顯示，BRL-3A細(xì)胞經(jīng)DTT處理12 h及24 h后，GRP78、calpain-2及caspase-12的mRNA表達(dá)較正常對照組顯著升高(P<0.01)，而caspase-3的mRNA水平與正常對照組比較無顯著變化，見圖2。

Figure 2.The mRNA expression of GRP78, calpain-2, caspase-12 and caspase-3 in the BRL-3A cells treated with DTT. Mean±SD.n=5.**P<0.01vscontrol group;##P<0.01vsDTT (12 h) group.

圖2DTT處理BRL-3A細(xì)胞后GRP78、calpain-2、caspase-12及caspase-3的mRNA表達(dá)變化

3 細(xì)胞免疫熒光法檢測DTT處理BRL-3A細(xì)胞后GRP78、calpain-2、caspase-12及caspase-3的蛋白表達(dá)

細(xì)胞免疫熒光檢測發(fā)現(xiàn)GRP78、calpain-2、caspase-12及caspase-3蛋白主要分布于細(xì)胞胞漿內(nèi)。BRL-3A細(xì)胞經(jīng)DTT處理12 h及24 h后，胞漿中GRP78、calpain-2、caspase-12及caspase-3蛋白水平較正常對照組顯著升高(P<0.01),見圖3。

4 Western blot檢測DTT處理BRL-3A細(xì)胞后cleaved caspase-12及cleaved caspase-3的蛋白表達(dá)

Western blot結(jié)果顯示，BRL-3A細(xì)胞經(jīng)DTT處理12 h及24 h后，細(xì)胞中cleaved caspase-12及cleaved caspase-3蛋白較正常對照組明顯增多(P<0.01),見圖4。

5 N-Suc-Leu-Tyr-AMC底物法檢測DTT處理BRL-3A細(xì)胞后calpain-2活性的變化

經(jīng)DTT處理12 h及24 h后，BRL-3A細(xì)胞中calpain-2的活性較正常對照組顯著增高(P<0.01),見圖5。

6 流式細(xì)胞術(shù)檢測細(xì)胞凋亡的變化

正常對照組僅有少量細(xì)胞發(fā)生凋亡；經(jīng)DTT處理12 h后，細(xì)胞凋亡率較正常對照組顯著增加；DTT處理細(xì)胞24 h后，細(xì)胞凋亡率進(jìn)一步增高(P<0.01)，見圖6。

討 論

細(xì)胞凋亡是受細(xì)胞外微環(huán)境和細(xì)胞內(nèi)基因調(diào)控的一種細(xì)胞主動性死亡方式，許多生理及病理因素都可以誘導(dǎo)肝細(xì)胞發(fā)生凋亡[10-13]。肝細(xì)胞凋亡是一柄雙刃劍，一方面與肝臟的生理活動密切相關(guān)，通過肝細(xì)胞凋亡可調(diào)節(jié)肝組織正常的細(xì)胞更新、增殖以及再生，而另一方面，如果肝細(xì)胞過度凋亡也可導(dǎo)致肝臟的損傷和肝臟疾病的發(fā)生。例如病毒性肝炎、自身免疫性肝炎以及肝纖維化等多種肝病都表現(xiàn)為大量肝細(xì)胞凋亡，從而影響肝臟的功能，加速病情的惡化。因此，深入了解肝細(xì)胞凋亡的發(fā)生機(jī)制可為臨床上防治各種肝臟疾病提供新的思路和方法。

內(nèi)質(zhì)網(wǎng)是細(xì)胞內(nèi)重要的細(xì)胞器，參與蛋白質(zhì)的合成、修飾、折疊以及維持細(xì)胞內(nèi)Ca2+穩(wěn)定，在內(nèi)膜系統(tǒng)中占有中心地位[14]。凡是能引起內(nèi)質(zhì)網(wǎng)攝取、釋放Ca2+障礙或蛋白質(zhì)加工、運(yùn)輸障礙的因素均能導(dǎo)致ERS的發(fā)生。GRP78屬于熱休克蛋白(heat shock protein，HSP)70 家族，是細(xì)胞內(nèi)重要的分子伴侶，其主要作用是促進(jìn)未折疊/錯誤折疊蛋白進(jìn)行正確折疊。ERS時(shí)由于大量未折疊/錯誤折疊蛋白在內(nèi)質(zhì)網(wǎng)腔中堆積，GRP78表達(dá)上調(diào)有助于蛋白質(zhì)的正確折疊，恢復(fù)內(nèi)質(zhì)網(wǎng)的正常功能，從而促進(jìn)細(xì)胞的存活。因此，GRP78可作為ERS的標(biāo)志蛋白[15]。本次研究采用DTT(一種可影響蛋白質(zhì)翻譯后修飾的物質(zhì))誘導(dǎo)體外培養(yǎng)的大鼠正常肝細(xì)胞BRL-3A發(fā)生ERS反應(yīng)，經(jīng)real-time PCR和細(xì)胞免疫熒光檢測GRP78的表達(dá)發(fā)現(xiàn)，隨著DTT刺激時(shí)間的延長，細(xì)胞內(nèi)GRP78在mRNA及蛋白水平的表達(dá)逐漸增高，提示采用2.5 mmol/L的DTT誘導(dǎo)BRL-3A細(xì)胞發(fā)生ERS是成功的。

ERS的程度及持續(xù)時(shí)間決定了應(yīng)激細(xì)胞的結(jié)局。一定程度的ERS能激活細(xì)胞的保護(hù)機(jī)制，例如增加內(nèi)質(zhì)網(wǎng)分子伴侶表達(dá)及減少蛋白質(zhì)合成來改善細(xì)胞的狀態(tài)，發(fā)揮保護(hù)細(xì)胞的作用；相反，當(dāng)應(yīng)激原強(qiáng)度超過細(xì)胞自身處理能力時(shí)，保護(hù)機(jī)制不能與損傷抗衡，ERS則可通過啟動細(xì)胞凋亡途徑來清除受損的細(xì)胞[16-17]。Caspase-12作為內(nèi)質(zhì)網(wǎng)外膜上的促凋亡分子，是ERS介導(dǎo)細(xì)胞凋亡的特異性啟動蛋白酶之一，其活化是ERS介導(dǎo)凋亡的中心環(huán)節(jié)[18]。研究發(fā)現(xiàn)，敲除caspase-12基因的細(xì)胞雖然仍對其它各種凋亡誘導(dǎo)因素敏感，但對ERS誘導(dǎo)的凋亡可產(chǎn)生耐受[19]，說明caspase-12信號通路是ERS介導(dǎo)細(xì)胞凋亡的特有信號通路之一。本次研究發(fā)現(xiàn)，給予2.5mmol/L DTT處理BRL-3A細(xì)胞后，細(xì)胞中caspase-12的mRNA及活性caspase-12蛋白的水平均較正常對照組顯著增加，說明在內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激狀態(tài)下，不僅caspase-12的mRNA水平上調(diào)且蛋白質(zhì)活性也是增加的。本研究還觀察了caspase-12下游促凋亡蛋白caspase-3的表達(dá)變化，結(jié)果發(fā)現(xiàn)DTT處理細(xì)胞后caspase-3的mRNA水平未發(fā)生顯著變化，但活性caspase-3蛋白較正常對照組顯著增加，提示內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激不能上調(diào)caspase-3 mRNA水平，但可增加其蛋白活性，這可能與caspase-12活化后進(jìn)一步激活其下游的caspase-3有關(guān)。采用流式細(xì)胞術(shù)對細(xì)胞凋亡的檢測發(fā)現(xiàn)，隨著DTT刺激時(shí)間的延長，細(xì)胞凋亡率逐步增加。上述結(jié)果表明DTT處理BRL-3A細(xì)胞后可通過激活caspase-12/caspase-3信號通路促進(jìn)細(xì)胞凋亡的發(fā)生。但關(guān)于caspase-12/caspase-3信號通路是如何激活的，目前尚不清楚，推測可能與calpain-2有關(guān)。

Figure 3.The immunofluorescence observation for the protein levels of GRP78, calpain-2, caspase-12 and caspase-3 in the BRL-3A cells treated with DTT (×200). Mean±SD.n=3.**P<0.01vscontrol group.

圖3細(xì)胞免疫熒光顯示DTT處理BRL-3A細(xì)胞后GRP78、calpain-2、caspase-12及caspase-3蛋白水平的比較

Figure 4.The protein levels of cleaved caspase-12 and cleaved caspase-3 in the BRL-3A cells treated with DTT. Mean±SD.n=3.*P<0.01vscontrol group.

圖4DTT處理BRL-3A細(xì)胞后cleavedcaspase-12及cleavedcaspase-3的蛋白表達(dá)水平

Figure 5.The change of calpain-2 activity in BRL-3A cells treated with DTT. Mean±SD.n=3.*P<0.01vscontrol group.

圖5DTT處理BRL-3A細(xì)胞后calpain-2活性變化

Calpain-2是鈣離子依賴性的蛋白水解酶[20]，近年來有研究發(fā)現(xiàn)，calpain-2可能通過激活特異定位于內(nèi)質(zhì)網(wǎng)表面的caspase-12，啟動ERS介導(dǎo)的細(xì)胞凋亡過程，從而加重組織細(xì)胞的損傷[21]。本次研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)，DTT處理BRL-3A細(xì)胞后，細(xì)胞中calpain-2的mRNA及蛋白的表達(dá)較正常對照組顯著增加。進(jìn)一步對calpain-2的活性進(jìn)行檢測發(fā)現(xiàn)，經(jīng)DTT處理后BRL-3A細(xì)胞中calpain-2的活性較正常對照組顯著增加。由于calpain-2是細(xì)胞內(nèi)的一種蛋白水解酶，其活性增加可導(dǎo)致多種底物蛋白的水解，這其中可能也包括對caspase-12的水解和激活。有研究發(fā)現(xiàn)ERS時(shí)calpain-2可移位到內(nèi)質(zhì)網(wǎng)，并對位于內(nèi)質(zhì)網(wǎng)上的caspase-12進(jìn)行水解，從而激活caspase-12[8]。上述結(jié)果提示ERS狀態(tài)下calpain-2表達(dá)上調(diào)及活性增加可能通過激活ERS凋亡通路中關(guān)鍵信號分子caspase-12從而介導(dǎo)細(xì)胞凋亡過程。

Figure 6.The apoptosis of BRL-3A cells treated with DTT was detected by flow cytometry. Mean±SD.n=3.**P<0.01vscontrol group.

圖6流式細(xì)胞術(shù)檢測DTT處理BRL-3A細(xì)胞后細(xì)胞凋亡率的變化