孫治霞， 索紅亮， 王麗輝， 郭艷青， 李宗尚

[河南省中醫(yī)院(河南中醫(yī)藥大學(xué)第二附屬醫(yī)院)心血管科， 河南 鄭州 450002]

近年來研究表明，行冠狀動脈造影和支架植入術(shù)的患者其術(shù)后的心肌酶譜或肌鈣蛋白I均可見瞬時(shí)升高，提示在冠狀動脈侵入性治療時(shí)可對心肌造成一定損傷，這種現(xiàn)象被定義為“冠狀動脈侵入性損傷”[1-2]，這種損傷主要是指由經(jīng)皮冠狀動脈介入術(shù)對血管內(nèi)皮造成不可避免的損傷，進(jìn)而引發(fā)炎性反應(yīng)和血管重塑等，導(dǎo)致心肌缺血以及再灌注損傷等。

五參順脈膠囊(Wushen-Shunmai capsule)是國家首屆名中醫(yī)毛德西教授汲取古人孫思邈《千金翼方》四參湯的經(jīng)驗(yàn)，融合現(xiàn)代藥理學(xué)研究結(jié)果，逐漸成為行之有效的經(jīng)驗(yàn)方劑，療效包括可顯著改善心肌梗死以及心絞痛等疾病癥狀[3-4]。因此在本實(shí)驗(yàn)中，我們在傳統(tǒng)研究基礎(chǔ)上對五參順脈膠囊的適應(yīng)證進(jìn)行進(jìn)一步拓展，以大鼠體內(nèi)心肌缺血再灌注為損傷模型，觀察五參順脈膠囊對大鼠冠狀動脈侵入性損傷是否具有治療作用。

多種外界刺激和病理狀況(例如缺氧、氧化損傷、低血糖和高脂飲食等)可以引起內(nèi)質(zhì)網(wǎng)中未折疊蛋白的堆積導(dǎo)致細(xì)胞處于一種應(yīng)激狀態(tài)，即內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激(endoplasmic reticulum stress，ERS)[5]。內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激信號通路被激活的初衷是為了減輕錯誤折疊蛋白的堆積，然而，內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激過度時(shí)將會引起細(xì)胞的死亡[6]。隨著內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激與人類疾病之間關(guān)系被逐漸揭示[7-8]，內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激在心肌損傷中的作用也逐漸受到人們關(guān)注。五參順脈膠囊是否可通過改善大鼠內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激狀態(tài)治療冠狀動脈侵入性損傷目前尚未見報(bào)道。本研究以內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激為切入點(diǎn)，為五參順脈膠囊的臨床應(yīng)用進(jìn)一步提供科學(xué)理論依據(jù)。

材 料 和 方 法

1 實(shí)驗(yàn)動物與試劑

50只SPF級健康雄性SD大鼠(4～6月齡)，購自中科院上海斯萊克實(shí)驗(yàn)動物有限公司[生產(chǎn)許可證號為SCXK(滬)2017-0005]，飼養(yǎng)于河南省中醫(yī)院SPF級動物房[使用許可證號為SYXK(豫)2016-0009]，普通大鼠飼料喂養(yǎng)，飲自來水，12 h光照輪換。

五參順脈膠囊購自河南省中醫(yī)院(含西洋參30 g，丹參30 g，北沙參30 g，三七參30 g，苦參30 g，赤芍50 g，川芎30 g，降香50 g，秦艽30 g，冰片15 g；研為細(xì)末，裝膠囊，每粒含生藥0.45 g)，丟棄膠囊殼，將藥物取出后采用羧甲基纖維素鈉制成含生藥100 g/L的混懸劑；2,3,5-氯化三苯基四氮唑(2，3，5-triphenyltetrazolium chloride, TTC;分析純)購自天津市科密歐化學(xué)試劑有限公司；TUNEL染色試劑盒購自于Roche；caspase-3/7和caspase-8分析試劑盒均購自江蘇碧云天生物研究所；ECL化學(xué)發(fā)光法顯色系統(tǒng)購自Bio-Rad；轉(zhuǎn)錄激活因子4(activating transcription factor 4, ATF4)、C/EBP同源蛋白(C/EBP homologous protein,CHOP)和α-tubulin抗體購自Cell Signaling Technology。

2 方法

2.1大鼠心肌缺血再灌注模型制作 大鼠心肌缺血再灌注模型制作參考文獻(xiàn)[9]。SD大鼠術(shù)前使用戊巴比妥鈉進(jìn)行腹腔注射麻醉，固定四肢與頭部于手術(shù)臺上，腹部皮膚消毒，待大鼠呼吸平穩(wěn)后進(jìn)行開胸術(shù)，打開心包，暴露心臟。找出冠狀動脈左前降支，在分支處穿入結(jié)扎線并套入一塑料管進(jìn)行冠狀動脈結(jié)扎。冠脈缺血30 min后恢復(fù)心臟血液灌流，再灌注180 min。對照組其余處理與模型組相同，但不進(jìn)行冠狀動脈結(jié)扎。

2.2動物分組與給藥處理 對照組10只大鼠；模型大鼠隨機(jī)分為模型組、五參順脈膠囊低劑量組、五參順脈膠囊中劑量組和五參順脈膠囊高劑量組，每組10只大鼠。五參順脈大劑量組大鼠每次給藥2 mL(0.900 g/kg)，中劑量組大鼠每次給藥1 mL(0.450 g/kg)，小劑量組大鼠每次給藥0.5 mL(0.225 g/kg)；對照組和模型組大鼠每次給予2 mL溶劑。給藥2周后取心臟，每組取5只做冰凍切片用于TTC染色和TUNEL染色，另外5只保留組織用于caspase-3/7和caspase-8的活性測定和Western blot檢測。

2.3心肌梗死體積測定 取梗死區(qū)心肌組織做0.5 μm厚度切片，將心肌切片置于預(yù)先溫?zé)嶂?7 ℃的2% TTC溶液中，于37 ℃恒溫敷箱中孵育15～20 min。待未梗死區(qū)(TTC染色呈紅色)和梗死區(qū)(TTC染色呈白色)界限清晰后，去除TTC溶液，加入4%多聚甲醛溶液進(jìn)行固定，拍照。之后利用Adobe Photoshop CS6軟件計(jì)算出心肌缺血梗死區(qū)比例，梗死區(qū)比例(%)=梗死區(qū)/危險(xiǎn)區(qū)×100%。

2.4TUNEL染色檢測心肌組織中壞死細(xì)胞數(shù)目 TUNEL染色按照試劑盒提供說明書進(jìn)行，每組樣本隨機(jī)選取相同部位進(jìn)行染色。取各處理組心臟梗死區(qū)組織切片4%多聚甲醛固定30 min，PBS洗3次，每次3 min；3% H2O2封閉10 min，PBS洗3次，每次3 min；0.1% Triton X-100 透膜2 min；滴加100 μL TDT工作液37 ℃孵育1 h，PBS洗3次,每次3 min；滴加0.3% H2O2封閉內(nèi)源性過氧化物酶活性，PBS洗3次,每次3 min；滴加100 μL Streptavidin-HRP工作液37 ℃孵育1 h，PBS洗3次,每次3 min；DAB顯色5 min，中性樹脂封片，顯微鏡觀察拍照。TUNEL染色后任意選取梗死區(qū)域周圍10個(gè)視野進(jìn)行細(xì)胞計(jì)數(shù)，同時(shí)對TUNEL染色陽性細(xì)胞進(jìn)行計(jì)數(shù)，計(jì)算凋亡指數(shù)(%)=TUNEL染色陽性細(xì)胞數(shù)目/總細(xì)胞數(shù)目×100%。

2.5Caspase-3/7和caspase-8活性的測定 按照caspase-3/7和caspase-8活性分析試劑盒說明書進(jìn)行caspase-3/7和caspase-8活性測定。取各處理組心臟梗死區(qū)組織利用勻漿器進(jìn)行勻漿,加入10倍體積組織裂解液在冰上將樣品裂解20 min。裂解結(jié)束后，4 000 r/min 在4 ℃離心5 min，取各組樣品上清，繼續(xù)在13 200 r/min離心15 min。取上清，按照BCA試劑盒進(jìn)行定量。蛋白濃度進(jìn)行標(biāo)準(zhǔn)化處理后，分別加入底物Ac-DEVD-pNA和Ac-IETD-pNA室溫孵育90 min，酶標(biāo)儀檢測波長在405 nm化學(xué)發(fā)光值。

2.6Western blot檢測ATF4和CHOP蛋白的表達(dá)量 取各處理組心臟缺血區(qū)組織經(jīng)勻漿、裂解、離心萃取蛋白，然后利用BCA試劑盒進(jìn)行定量。取蛋白樣品50 μg，加入5×SDS蛋白上樣緩沖液，在沸水中煮5 min后以15% SDS-PAGE分離；之后用濕轉(zhuǎn)法轉(zhuǎn)移到PVDF膜。5%脫脂奶粉室溫封閉1 h，加入 I 抗ATF4(1∶ 1 000稀釋)、CHOP(1∶ 2 000稀釋)和ɑ-tubulin(1∶ 8 000稀釋)，4 ℃孵育過夜；TBST 洗滌3次,每次5 min，加入相應(yīng) II 抗，室溫孵育1 h，TBST洗滌3次,每次5 min。ECL化學(xué)發(fā)光法顯色系統(tǒng)拍照，并以ɑ-tubulin為內(nèi)參照，采用系統(tǒng)軟件計(jì)算相對灰度值。

3 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

使用GraphPad Prism 6 軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。定量資料采用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差(mean±SD)表示，兩組間比較采用t檢驗(yàn)，多組間比較采用方差分析并用Bonferroni校正的t檢驗(yàn)對各組均數(shù)進(jìn)行兩兩比較，以P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

結(jié) 果

1 五參順脈膠囊對大鼠心肌缺血再灌注損傷所致梗死體積的影響

TTC染色結(jié)果顯示，給予心肌缺血再灌注損傷處理后，心肌出現(xiàn)顯著梗死區(qū)域,而在給予五參順脈膠囊處理后，心肌梗死區(qū)域明顯減小。經(jīng)軟件分析，與模型組相比，五參順脈膠囊低、中、高劑量組心臟梗死體積與危險(xiǎn)區(qū)體積之比均顯著減少(P<0.05)，見圖1。

Figure 1. Wushen-Shunmai capsule attenuated ischemia-reperfusion injury-induced myocardial infarction (TTC staining). Mean±SD.n=5.*P<0.05vscontrol group;#P<0.05vsmodel group.

圖1五參順脈膠囊減少大鼠心肌缺血再灌注損傷所致心肌梗死面積

2 五參順脈膠囊對缺血再灌注損傷所致心肌細(xì)胞凋亡率的影響

心肌缺血再灌注后，心臟梗死區(qū)組織切片中TUNEL陽性細(xì)胞明顯增加，在給予五參順脈膠囊處理后，可以觀察到梗死區(qū)TUNEL陽性細(xì)胞明顯減少。模型組中心臟梗死區(qū)TUNEL陽性細(xì)胞與總細(xì)胞之比為(13.48±2.52)%，五參順脈膠囊低、中、高劑量組心臟梗死區(qū)TUNEL陽性細(xì)胞與總細(xì)胞之比較模型組均顯著降低(P<0.05)，見圖2。

Figure 2.Wushen-Shunmai capsule inhibited ischemia-reperfusion injury-induced cardiomyocyte apoptosis (TUNEL staining, ×200). Mean±SD.n=5.*P<0.05vscontrol group;#P<0.05vsmodel group.

圖2五參順脈膠囊抑制大鼠心肌缺血再灌注損傷所致心肌細(xì)胞凋亡

3 五參順脈膠囊對大鼠心肌缺血再灌注損傷時(shí)caspase-3/7和caspase-8活性的影響

在心肌缺血再灌注模型組，伴隨著梗死面積的增加，凋亡信號通路效應(yīng)分子caspase-3/7和caspase-8活性明顯增加；在給予五參順脈膠囊處理后，caspase-3/7和caspase-8活性相較于模型組顯著降低(P<0.05)，見圖3。

4 五參順脈膠囊對內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激標(biāo)志物ATF4和CHOP蛋白表達(dá)的影響

Western blot結(jié)果顯示，心肌缺血再灌注后，內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激標(biāo)志物ATF4和CHOP的蛋白表達(dá)量明顯增加，給予五參順脈膠囊處理后，ATF4和CHOP的表達(dá)被顯著逆轉(zhuǎn)(P<0.05)，見圖4。該結(jié)果提示五參順脈膠囊可通過抑制內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激所介導(dǎo)的細(xì)胞凋亡過程減輕大鼠心肌缺血再灌注損傷，從而對大鼠冠脈侵入性損傷有一定的治療作用。

討 論

隨著經(jīng)皮冠狀動脈介入手術(shù)的廣泛普及，越來越多研究認(rèn)識到手術(shù)本身可能對患者造成一些損傷[10-11]。由于手術(shù)造成的血管內(nèi)皮損傷或者脫落，將不可避免引起炎癥反應(yīng)與血管重塑等，從而造成心肌缺血以及再灌注損傷等，這些侵入性損傷事件并逐漸成為各項(xiàng)研究熱點(diǎn)。因此，研究冠狀動脈侵入性損傷的發(fā)病機(jī)理，尋找有效減輕損傷策略，對臨床治療冠狀動脈侵入性損傷具有重要價(jià)值。

Figure 3.Wushen-Shunmai capsule inhibited ischemia-reperfusion injury-induced activities of caspase-3/7 (A) and caspase-8 (B). Mean±SD.n=5.*P<0.05vscontrol group;#P<0.05vsmodel group.

圖3五參順脈膠囊對大鼠心肌缺血再灌注損傷心肌caspase-3/7和caspase-8活性的影響

Figure 4. Wushen-Shunmai capsule reversed ischemia-reperfusion injury-induced expression of ERS-regulating proteins. Mean±SD.n=5.*P<0.05vscontrol group;#P<0.05vsmodel group.

圖4五參順脈膠囊逆轉(zhuǎn)心肌缺血再灌注損傷所致內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激調(diào)控蛋白ATF4和CHOP的表達(dá)

除經(jīng)典的死亡受體途徑和線粒體凋亡途徑，內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激介導(dǎo)的細(xì)胞凋亡逐步引起關(guān)注。內(nèi)質(zhì)網(wǎng)是調(diào)節(jié)Ca2+和加工蛋白質(zhì)的重要場所，在外界刺激或者病理情況下將會導(dǎo)致內(nèi)質(zhì)網(wǎng)中未折疊蛋白的堆積，從而觸發(fā)內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激狀態(tài)，在未折疊蛋白不能得到有效清除時(shí)，將會導(dǎo)致細(xì)胞趨向死亡[12]。近來研究表明，內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激反應(yīng)是心肌缺血再灌注病理過程發(fā)生與發(fā)展中的重要損傷因素[13-14]。

在本研究中，我們以大鼠心肌缺血再灌注模型為代表，觀察到五參順脈膠囊可顯著減輕由心肌缺血再灌注所造成的損傷，提示五參順脈膠囊對大鼠冠狀動脈侵入性損傷可具有保護(hù)作用。在這里我們進(jìn)一步進(jìn)行機(jī)理探討發(fā)現(xiàn)，五參順脈膠囊可抑制心肌缺血再灌注損傷時(shí)內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激標(biāo)志物ATF4和CHOP的表達(dá)，同時(shí)對凋亡執(zhí)行分子caspase-3/7和caspase-8的活性也有顯著抑制作用。這些結(jié)果表明五參順脈膠囊可通過抑制內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激介導(dǎo)的細(xì)胞凋亡對大鼠心肌缺血再灌注發(fā)揮保護(hù)作用，這為五參順脈膠囊應(yīng)用于治療冠狀動脈侵入性損傷提供了可靠的臨床前研究資料。

綜上所述，五參順脈膠囊可用于治療冠狀動脈侵入性損傷，其分子機(jī)制與五參順脈膠囊對內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激介導(dǎo)的細(xì)胞凋亡有關(guān)。通過本研究我們豐富與完善了冠狀動脈侵入性損傷的發(fā)病機(jī)制，并依此提出有效減輕冠狀動脈侵入性損傷的措施，拓展了五參順脈膠囊的臨床應(yīng)用。