常春義 ，鄭奕雄 ，吳華玲 ，崔永春 ，伍嘉倩 ，曾淼林 ，李嘉美，孫映波 ，于 波

（1.廣東省農(nóng)業(yè)科學(xué)院環(huán)境園藝研究所/農(nóng)業(yè)農(nóng)村部華南都市農(nóng)業(yè)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室/廣東省園林花卉種質(zhì)創(chuàng)新綜合利用重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，廣東 廣州 510640；2.仲愷農(nóng)業(yè)工程學(xué)院農(nóng)業(yè)與生物學(xué)院，廣東 廣州 510225；3.廣東省農(nóng)業(yè)科學(xué)院茶葉研究所/廣東省茶樹資源創(chuàng)新利用重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，廣東 廣州 510640）

細(xì)萼連蕊茶（Camellia tsofuiChien）為山茶科山茶屬連蕊茶組灌木，產(chǎn)于我國湖南、江西和四川［1］，樹形緊湊，嫩葉紅色，花小而密集，花瓣背面略帶粉紅色，芳香，可觀形觀花觀葉，可作花境、花壇、叢林及芳香類應(yīng)用，具有很高的觀賞和園林應(yīng)用價(jià)值［2］。目前，國際登錄的茶花（C.japonica）通?；ㄐ洼^大，重瓣較多、色澤濃艷，樹形壯碩挺拔，葉片硬實(shí)濃綠，但極少品種具有濃郁香氣。而連蕊茶組植物（Sect.TheopsisCoh.St.）雖然花朵單瓣、花徑較小、色澤多為白色，葉片較小較薄，樹枝較細(xì)偏軟，但花量大，花朵密集，多數(shù)種類具芳香氣味，且大多數(shù)物種分布于我國境內(nèi)。因此，利用這些芳香型連蕊茶物種資源與茶花品種進(jìn)行種間雜交，充分利用雜種優(yōu)勢改良傳統(tǒng)茶花，實(shí)現(xiàn)優(yōu)勢性狀互補(bǔ)，培育具有芳香氣味的優(yōu)良茶花新品種是今后茶花育種的重要發(fā)展方向。目前，只有少數(shù)連蕊茶物種被引種馴化并用于茶花人工雜交育種，包括細(xì)萼連蕊茶在內(nèi)的大多數(shù)連蕊茶還未見系統(tǒng)應(yīng)用于茶花育種研究。

了解連蕊茶花粉生活力和貯藏力的狀況，能夠更好地指導(dǎo)雜交育種工作，解決因花期不育、異地授粉而帶來的授粉困難。目前，已有川鄂連蕊茶和毛柄連蕊茶的花粉低溫貯藏的研究報(bào)道［3-4］,但迄今為止未見細(xì)萼連蕊茶等其他連蕊茶組植物花粉生活力和低溫貯藏的研究報(bào)道。本研究以采自浙江金華的細(xì)萼連蕊茶花粉為試材，對(duì)其進(jìn)行了花粉低溫貯藏力和生活力研究，旨在為今后開展細(xì)萼連蕊茶與山茶物種間雜交育種提供重要技術(shù)參考。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

2017年1月從浙江金華國際山茶物種園采集即將開放且尚未散粉的細(xì)萼連蕊茶花蕾。試驗(yàn)在廣東省園林花卉種質(zhì)創(chuàng)新綜合利用重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室進(jìn)行。將采回的花蕾置于25（±1）℃恒溫下干燥處理12 h。待花藥打開散粉時(shí)，收集花粉。先用鑷子將散粉的花藥輕輕取下，放在紙片上，于25（±1）℃恒溫下干燥處放置24 h。然后將花粉連同花藥殼一起分裝到1.5 mL凍存管中，擰緊管蓋，置于-80℃超低溫冰箱保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2 花粉生活力測定

1.2.1 花粉萌發(fā)適宜碳源測定 以無糖為對(duì)照，分別將含有0.292 mol/L的糖即蔗糖（100.0 g/L）、麥芽糖（105.2 g/L）、葡萄糖（52.6 g/L）、乳糖（100.0 g/L）和山梨醇（52.6 g/L）等5種固體培養(yǎng)基（8 g/L瓊脂，pH 5.5 ～ 6.0）處理滴于載玻片上，用無菌牙簽將新鮮花粉均勻涂布在固體培養(yǎng)基表面。將載玻片置于放有濕潤濾紙的培養(yǎng)盒內(nèi)，然后將培養(yǎng)盒裝入塑料自封袋密封，置于25（± 1）℃的生化培養(yǎng)箱內(nèi)，培養(yǎng)24 h 后，于ZEISS正置顯微鏡下觀察統(tǒng)計(jì)花粉的萌發(fā)率，以確定花粉萌發(fā)的最適碳源。

1.2.2 花粉萌發(fā)適宜蔗糖濃度測定 設(shè)計(jì)5種蔗糖濃度處理，分別為0.000、0.146、0.292、0.584、0.876 mol/L，pH 5.5 ～ 6.0。培養(yǎng) 24 h 后，于顯微鏡下觀察并統(tǒng)計(jì)花粉萌發(fā)率，以確定適合細(xì)萼連蕊茶花粉萌發(fā)的最佳糖源濃度。

1.2.3 低溫或高溫對(duì)花粉萌發(fā)效應(yīng)的測定 模擬華南地區(qū)冬春季溫度，將花粉培養(yǎng)分為兩個(gè)階段，第一階段設(shè)置7個(gè)溫度梯度處理，分別為5、15、20、25、30、35、40℃，進(jìn)行6 h培養(yǎng)處理，模擬夜間低溫或中午高溫，然后轉(zhuǎn)移至25（±1）℃條件下恢復(fù)培養(yǎng)18 h，于ZEISS正置顯微鏡下觀察并統(tǒng)計(jì)花粉萌發(fā)率，以測試冬季低溫和春季高溫對(duì)細(xì)萼連蕊茶花粉萌發(fā)的影響。上述試驗(yàn)培養(yǎng)基為100 g/L蔗糖，pH 5.5 ～ 6.0。

統(tǒng)計(jì)花粉萌發(fā)率時(shí)，每個(gè)處理重復(fù)3次，每個(gè)重復(fù)觀測100?；ǚ垡陨稀；ǚ酃荛L度大于花粉粒直徑作為萌發(fā)標(biāo)準(zhǔn)。計(jì)算方法為：

1.3 花粉低溫貯藏力測定

將花粉置于-80℃條件下保存，分別貯藏0、3、6、12個(gè)月，取低溫處理的花粉按上述1.2探索得到的最適宜條件進(jìn)行萌發(fā)率測定。

1.4 顯微觀察

花粉萌發(fā)觀察采用ZEISS正置顯微鏡（Axio Scope A1，德國）。使用AxioVision軟件進(jìn)行圖像捕捉和保存。

試驗(yàn)數(shù)據(jù)使用SAS V8.02軟件進(jìn)行分析，采用Duncan’s多重比較法進(jìn)行差異顯著性測驗(yàn)。

2 結(jié)果與分析

2.1 不同碳源處理花粉萌發(fā)率比較

本試驗(yàn)研究了濃度為0.292 mol/L（即100 g /L蔗糖當(dāng)量）的不同碳源處理對(duì)細(xì)萼連蕊茶花粉萌發(fā)率的影響，調(diào)查觀察結(jié)果見表1和圖1（封二）。結(jié)果表明，以蔗糖和乳糖為碳源處理的花粉萌發(fā)率最高，分別為20.07%和19.48%，與其他處理相比差異極顯著；葡萄糖處理次之，為14.42%，與無糖對(duì)照差異極顯著；山梨醇處理的萌發(fā)率為7.90%，與無糖對(duì)照相當(dāng)；麥芽糖處理的萌發(fā)率最低，僅為4.48%，低于無糖對(duì)照且差異顯著。

表1 碳源對(duì)細(xì)萼連蕊茶花粉萌發(fā)的影響

2.2 不同濃度蔗糖處理花粉萌發(fā)率比較

本試驗(yàn)還研究了培養(yǎng)基中蔗糖5個(gè)濃度梯度處理對(duì)細(xì)萼連蕊茶花粉萌發(fā)率的影響，結(jié)果見表2和圖2（封二）。結(jié)果表明，當(dāng)培養(yǎng)基中含有0.292 mol/L蔗糖時(shí)，花粉萌發(fā)率最高，達(dá)20.07%；隨著蔗糖濃度降低或升高，花粉萌發(fā)率呈現(xiàn)逐漸遞降趨勢。當(dāng)蔗糖濃度處理為0.146 mol/L時(shí)，花粉萌發(fā)率為16.08%；當(dāng)蔗糖濃度處理為0.000時(shí)，花粉萌發(fā)率降為7.96%；當(dāng)蔗糖濃度處理為0.584 mol/L時(shí)，花粉萌發(fā)率降為13.76%；當(dāng)蔗糖濃度處理升高到0.876 mol/L時(shí)，萌發(fā)率僅為3.55%，反映出高濃度蔗糖同樣對(duì)花粉萌發(fā)產(chǎn)生明顯的抑制效應(yīng)。

表2 蔗糖濃度對(duì)細(xì)萼連蕊茶花粉萌發(fā)的影響

2.3 低溫或高溫對(duì)花粉萌發(fā)的影響

本試驗(yàn)?zāi)M華南地區(qū)冬春季溫度，對(duì)花粉培養(yǎng)分為兩個(gè)階段，研究第一階段的高溫或低溫對(duì)細(xì)萼連蕊茶花粉萌發(fā)率的影響，結(jié)果見表3和圖3（封二）。結(jié)果表明，將花粉置于5、15、20、25℃環(huán)境下培養(yǎng)6 h，再恢復(fù)培養(yǎng)18 h，花粉萌發(fā)率較高，分別為20.17%、20.21%、20.22%、20.07%，各低溫處理之間差異不顯著。隨著第一階段處理溫度的升高，花粉萌發(fā)率顯著降低，當(dāng)處理溫度為30℃時(shí)，花粉萌發(fā)率降為14.30%；當(dāng)處理溫度升高到35℃時(shí)，花粉萌發(fā)率進(jìn)一步降低，僅為3.17%；當(dāng)處理溫度升高到40℃時(shí)，花粉完全沒有萌發(fā)。

表3 溫度對(duì)細(xì)萼連蕊茶花粉萌發(fā)的影響

2.4 花粉低溫貯藏力測定

花粉-80℃低溫貯藏試驗(yàn)結(jié)果（表4）顯示花粉保存前萌發(fā)率為20.07%；貯藏3個(gè)月，萌發(fā)率為20.33%；隨著貯藏時(shí)間延長，花粉萌發(fā)率有所下降，貯藏9個(gè)月，花粉萌發(fā)率降為15.43%；貯藏12個(gè)月，花粉萌發(fā)率雖然繼續(xù)下降，但仍然可達(dá)11.54%。

表4 -80℃貯藏細(xì)萼連蕊茶花粉萌發(fā)率

3 結(jié)論與討論

花粉萌發(fā)時(shí)需要能量物質(zhì)，花粉自身會(huì)貯藏一些淀粉等糖類物質(zhì)，這些物質(zhì)能夠促進(jìn)花粉在適宜條件下啟動(dòng)萌發(fā)。隨著花粉管的伸長，外源的糖類物質(zhì)將會(huì)影響花粉管生長。花粉培養(yǎng)使用較為普遍的是蔗糖。前人相似的研究結(jié)果表明，蔗糖比果糖和甘露醇更能促進(jìn)櫻桃花粉的萌發(fā)［5］；在野生龍蒿萌發(fā)試驗(yàn)中，蔗糖優(yōu)于麥芽糖和葡萄糖［6］。但也有不同結(jié)論，陳暄等對(duì)茶樹花粉萌發(fā)的研究表明，麥芽糖優(yōu)于蔗糖［7］；安國寧等對(duì)桃樹花粉萌發(fā)的研究則發(fā)現(xiàn)，葡萄糖優(yōu)于蔗糖［8］；許珂等對(duì)金銀忍冬花粉萌發(fā)的研究則表明，乳糖優(yōu)于葡萄糖、蔗糖和果糖［9］。因此，在進(jìn)行某個(gè)物種花粉培養(yǎng)時(shí)，要先試驗(yàn)才能確定適宜的碳源。本研究結(jié)果表明，蔗糖與乳糖能較好地促進(jìn)細(xì)萼連蕊茶花粉萌發(fā)，效果較佳；葡萄糖0.292 mol/L促進(jìn)花粉萌發(fā)效果次之；無糖或山梨醇再次之；麥芽糖最差。值得注意的是，山梨醇0.292 mol/L處理促進(jìn)花粉萌發(fā)的效果與無糖處理差異不顯著，表明作為碳源的山梨醇在此濃度下對(duì)花粉萌發(fā)促進(jìn)效果不明顯；麥芽糖0.292 mol/L處理培養(yǎng)基上的花粉萌發(fā)率不及無糖處理，說明麥芽糖在此濃度下對(duì)花粉萌發(fā)不僅不具有促進(jìn)作用，還具有明顯的抑制作用。

蔗糖不僅提供花粉萌發(fā)和花粉管生長所需的能量，同時(shí)也能夠維持細(xì)胞內(nèi)外滲透壓。前人研究結(jié)果表明，山茶屬多個(gè)物種如連蕊茶［3-4］、油茶［10-11］、紅山茶［12-15］、金花茶［16］、茶樹［7，17］的花粉體外萌發(fā)所需適宜蔗糖濃度為0.146 ～ 0.584 mol/L，如川鄂連蕊茶為0.584 mol/L ，毛柄連蕊茶為0.292 mol/L。本研究結(jié)果表明，細(xì)萼連蕊茶花粉體外萌發(fā)所需適宜蔗糖濃度為0.292 mol/L，因此，進(jìn)行連蕊茶組物種的花粉培養(yǎng)試驗(yàn)時(shí)，也要先試驗(yàn)適宜的糖濃度。

溫度對(duì)花粉萌發(fā)至關(guān)重要。通常，許多植物花粉萌發(fā)的適宜溫度為20～28℃［16-18］；但一些植物花粉適宜萌發(fā)溫度較高，達(dá)30℃［19-20］；而另外有的植物花粉萌發(fā)適宜溫度較低，僅為10℃［21］，超過適宜溫度范圍，花粉萌發(fā)就會(huì)受到不同程度的抑制。本研究模擬華南地區(qū)冬春季溫度，對(duì)花粉培養(yǎng)分為兩個(gè)階段，第一階段設(shè)置了7個(gè)溫度梯度處理，培養(yǎng)6 h后再轉(zhuǎn)移至25℃恢復(fù)培養(yǎng)，主要目的是為了研究第一階段的高溫或低溫對(duì)細(xì)萼連蕊茶花粉萌發(fā)率的影響。本研究結(jié)果表明，第一階段5 ～ 25℃的培養(yǎng)，花粉萌發(fā)率較高且差異不顯著，表明低溫對(duì)花粉萌發(fā)率沒有不良影響。而第一階段30 ～ 40℃的培養(yǎng)，花粉萌發(fā)率明顯降低，尤其超過40℃，花粉完全不能正常萌發(fā)。因此，在華南地區(qū)冬季、春季進(jìn)行茶花雜交授粉時(shí)，不用擔(dān)心夜間低溫對(duì)花粉的影響；而是要充分考慮中午高溫對(duì)花粉萌發(fā)的影響。

花粉保存可分為冷藏（4 ～ 5℃）、低溫（-20 ～ -80℃）和超低溫（-196℃液氮）保存等幾種方式。一般來說，冷藏保存可短期內(nèi)保持花粉活力［3］；低溫保存可較長時(shí)間保持花粉活力［22-23］；超低溫保持可長期保持花粉活力［24］，但成本較高。本研究，在-80℃保存1年后，細(xì)萼連蕊茶的花粉萌發(fā)率仍然達(dá)到10%以上，可以解決花期不遇的問題，滿足雜交授粉對(duì)花粉活力的需求。

圖1 細(xì)萼連蕊茶花粉在不同糖培養(yǎng)基上萌發(fā)情況

圖2 細(xì)萼連蕊茶花粉在不同濃度蔗糖培養(yǎng)基上萌發(fā)情況

圖3 細(xì)萼連蕊茶花粉經(jīng)不同溫度培養(yǎng)處理萌發(fā)情況