■ 陳昌福 曹麗敏 陳 輝 方蘋

（1 華中農(nóng)業(yè)大學(xué) 武漢 430070；2 沈陽(yáng)元豐飼料有限公司 沈陽(yáng)遼中 110202；3 江蘇省漁業(yè)技術(shù)推廣中心 南京 210029）

從遼寧省沈陽(yáng)市遼中區(qū)及其周邊患細(xì)菌性敗血癥的草魚（Ctenopharyngodon idellus）體內(nèi)分離到嗜水氣單胞菌（Aeromonas hydrophila）的大量致病菌株中，選取毒力較強(qiáng)的菌株，制備成福爾馬林滅活菌苗后，接種健康草魚并收集其免疫血清。用血凝板法測(cè)定了免疫血清中對(duì)各分離菌株的凝集抗體效價(jià)，比較分析了分離菌株之間的抗原性（antigenicity）差異。結(jié)果表明，用6個(gè)菌株制備的滅活菌苗接種草魚后，均可以誘導(dǎo)受免草魚的血清中產(chǎn)生較高的凝集抗體效價(jià)，說(shuō)明制備的滅活菌苗具有比較高的抗原性；免疫血清與各個(gè)分離菌株制備的滅活菌苗反應(yīng)，出現(xiàn)的凝集效價(jià)高達(dá)512～2,048之間，說(shuō)明用不同菌株制備的滅活菌苗上，存在能誘導(dǎo)草魚產(chǎn)生凝集抗體的大量共同抗原。

我國(guó)發(fā)展水產(chǎn)養(yǎng)殖業(yè)的地域遼闊，在不同地方的同種致病病原生物是可能存在不同血清型的。如果將從某一個(gè)地方分離的某種致病病原生物制備的疫苗，應(yīng)用到全國(guó)所有水產(chǎn)養(yǎng)殖區(qū)域時(shí)，就有可能由于致病病原生物血型抗原等的不同，導(dǎo)致實(shí)施免疫接種后的動(dòng)物因?yàn)椴荒塬@得特異性免疫防御能力而導(dǎo)致免疫失敗。因此，在我國(guó)選擇某種致病病原生物的一個(gè)毒株制備成某種滅活疫苗，在全國(guó)范圍內(nèi)應(yīng)用是難以取得一致良好免疫效果的，而是有必要根據(jù)各地致病病原生物的血清型等抗原性特點(diǎn)，制備適合在當(dāng)?shù)厥褂玫乃^“自家疫苗（autogenous vaccine）”。

我們已經(jīng)從遼寧省沈陽(yáng)市遼中區(qū)及其周邊養(yǎng)殖草魚（Ctenopharyngodon idellus）體內(nèi)，分離到對(duì)草魚具有致病性的嗜水氣單胞菌（Aeromonas hydrophila）多株。為了研制預(yù)防有這種致病菌引起草魚細(xì)菌性敗血癥，本研究從大量分離菌株中選取毒力較強(qiáng)的菌株，制備成福爾馬林滅活菌苗后，接種健康草魚并收集免疫血清，通過(guò)血凝板測(cè)定各分離菌株的凝集抗體效價(jià)，比較研究了分離菌株的抗原性（antigenicity）差異?，F(xiàn)將結(jié)果報(bào)告如下：

1 材料與方法

1.1 致病菌培養(yǎng)

將從患病草魚體內(nèi)分離的A.hydrophila，并且通過(guò)人工感染毒力試驗(yàn)證明對(duì)健康草魚具有較強(qiáng)毒力的LCG180626（1）、LCS180626（2）、LCP180626（3）、LCS180626（5）、LCG180626（6）和LCS180626（7）等6個(gè)菌株[3]，分別將其接種在BHIA（Diffco）培養(yǎng)基中，置于25℃恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)48 h，以滅菌生理鹽水洗下菌落并以3,500r/min離心，再用滅菌生理鹽水清洗3次后集菌，采用滅菌生理鹽水將菌液濃度稀釋至107cells/mL后，作為接種草魚的免疫原（immunogen）和進(jìn)行免疫血清凝集效價(jià)測(cè)定的反應(yīng)原（reactogen）。

而將LCG180501（1）、LCS180501（2）、LCP180501（3）、LCP180510（3）、LCG180510（4）、XCG180524（1）、LCP180616（1）、LCG180616（1）、LCG180618（1）、LCP180618（1）、LCS180618（1）、XCP180625（1）、XCG180625（1）、LCS180626（1）、LCG180626（3）、LCG180626（5）、LCG180626（7）、LCP180701（1）、LCG180721（1）、LCP180721（1）、LCS180527（1）、LCG180527（1）、LCP180527（1）等23個(gè)菌株，經(jīng)過(guò)上述同樣的方法培養(yǎng)、滅活處理后，僅用作測(cè)定免疫血清中凝集效價(jià)的反應(yīng)原。

1.2 免疫原的制備

在制備的A.hydrophila菌液中定量添加0.02%的福爾馬林，放置與28.0℃恒溫培養(yǎng)箱中，放置24h后進(jìn)行滅活后，即為福爾馬林滅活A(yù).hydrophila菌液。取滅活后的菌液100.0μL，分別接種在培養(yǎng)皿中，置于28.0℃恒溫培養(yǎng)箱中，放置24h后進(jìn)行觀察，培養(yǎng)皿中無(wú)菌落長(zhǎng)出，即證明菌體已經(jīng)被徹底滅活，可以作為A.hydrophila滅活菌苗（免疫原和反應(yīng)原）使用。

1.3 免疫接種

對(duì)每尾平均體重100.0g的健康草魚，經(jīng)胸鰭基部注射0.25mL滅活A(yù).hydrophila菌苗后，每個(gè)菌株的滅活菌苗接種20尾草魚，將免疫接種后的草魚放回水族中，采用經(jīng)過(guò)曝氣自來(lái)水充氣飼養(yǎng)，每天分早、晚各投喂1次由沈陽(yáng)元豐飼料有限公司生產(chǎn)的草魚人工配合飼料。飼養(yǎng)期間，水族箱中的水溫變化在24～30℃之間。

1.4 采血

自免疫接種滅活A(yù).hydrophila菌苗后，將供試魚在水族箱中飼養(yǎng)28d后，從每一個(gè)試驗(yàn)和對(duì)照組水族箱中隨機(jī)撈取6尾草魚，采用注射器刺穿尾動(dòng)脈和切斷腹主動(dòng)脈的方法采血，采集的血液盛裝在玻璃試管中，首先在室溫下放置2.0h，待其血液凝固后將盛血液試管移放入4.0℃冰箱中過(guò)夜，讓凝血塊進(jìn)一步收縮后，分離免疫血清。

表1 受免草魚血清中凝集和交叉凝集抗體效價(jià)的變化

1.5 抗體效價(jià)的測(cè)定

免疫血清中凝集效價(jià)的測(cè)定采用血凝板法進(jìn)行。用于凝集反應(yīng)的反應(yīng)原除了用作本研究中免疫原的A.hydrophila的6個(gè)菌株的滅活菌苗外，還有從患病草魚中分離的A.hydrophila，并經(jīng)過(guò)福爾馬林滅活的另外23個(gè)菌株制備的滅活菌體。

2 結(jié)果

健康草魚在免疫接種6個(gè)菌株制備的福爾馬林滅活A(yù).hydrophila疫苗后，血清中凝集抗體效價(jià)的變化的測(cè)定結(jié)果見表1所示。由表1可以看出，每個(gè)菌株的滅活菌苗（免疫原）均可以誘導(dǎo)受免草魚血清中產(chǎn)生較高的凝集抗體效價(jià)，這種結(jié)果說(shuō)明A.hydrophila滅活菌苗具有比較高的抗原性。將A.hydrophila的6個(gè)菌株制備的免疫原，免疫接種草魚產(chǎn)生的免疫血清，與各個(gè)菌株制備的反應(yīng)原凝集反應(yīng)后，對(duì)不同菌株的反應(yīng)原呈現(xiàn)的凝集效價(jià)高達(dá)512～2,048之間，這種結(jié)果說(shuō)明用不同菌株制備的滅活菌苗上，存在能誘導(dǎo)草魚產(chǎn)生凝集抗體的大量共同抗原。尤其是LCS180626（2）、LCP180626（3）、LCS180626（5）和LCS180626（7）等4個(gè)菌株上，似乎與各個(gè)菌株均存在比較多的共同抗原。

3 討論

在世界范圍內(nèi)，我國(guó)是水產(chǎn)養(yǎng)殖業(yè)發(fā)展大國(guó)。在養(yǎng)殖水生動(dòng)物過(guò)程中，由各種細(xì)菌和病毒引起的暴發(fā)性疾病比較多見。為了預(yù)防各種疾病對(duì)水產(chǎn)養(yǎng)殖業(yè)造成的巨大損失，對(duì)養(yǎng)殖水生動(dòng)物實(shí)施免疫預(yù)防，已經(jīng)被證明是有效的途徑之一[4]。

由于我國(guó)發(fā)展水產(chǎn)養(yǎng)殖業(yè)的地域遼闊，在不同地方的同種致病病原生物是可能存在不同血清型的。因此，采用從某一個(gè)地方分離的致病病原生物（種毒）開發(fā)的商品化魚用疫苗，往往難以在全國(guó)不同養(yǎng)殖區(qū)域獲得同樣理想的免疫防御效果。因此，有必要根據(jù)各地致病病原生物的血清型等特點(diǎn)研制自家疫苗，以滿足免疫防控養(yǎng)殖水生動(dòng)物疾病的需求[1]。

漁用自家疫苗的制備菌株是來(lái)源于疫苗應(yīng)用地發(fā)病魚群，從當(dāng)?shù)匕l(fā)病魚體內(nèi)分離鑒定致病菌后，經(jīng)大量培養(yǎng)致病菌株制備自家疫苗。因此，其抗原成分基本包括了引起當(dāng)?shù)佤~群疾病的病原，比較全面的抗原可能在一定程度上對(duì)接種魚群產(chǎn)生全面多方誘導(dǎo)，達(dá)到預(yù)防和控制疾病的目的。能有效地避免因不同的地區(qū)有不同的血清型病原菌存在，而因?yàn)椴煌逍椭g的抗原交叉保護(hù)力較弱，因而難以獲得一種覆蓋所有血清型的滅活疫苗的問(wèn)題。

在本研究中，用A.hydrophila的6個(gè)菌株制備的滅活菌苗接種草魚后，證明每個(gè)菌株制備的滅活菌苗均可以誘導(dǎo)受免草魚的血清中產(chǎn)生較高的凝集抗體效價(jià)，證明了滅活菌苗均具有比較強(qiáng)的抗原性。從受免草魚獲得的免疫血清與從遼寧省遼中養(yǎng)殖區(qū)域收集的多個(gè)菌株制備的滅活菌苗進(jìn)行凝集反應(yīng)，均出現(xiàn)比較高的凝集抗體效價(jià)，證明了用不同菌株制備的滅活菌苗上存在能誘導(dǎo)草魚產(chǎn)生凝集抗體的大量共同抗原。在6個(gè)制備滅活疫苗的菌株中，除LCG180626（1）和LCG180626（6）等2個(gè)菌株外，接種LCS180626（2）、LCP180626（3）LCS180626（5）和LCS180626（7）等4個(gè)菌株后，獲得的受免草魚血清中，幾乎對(duì)所有作為反應(yīng)原的菌株滅活菌苗，均可以產(chǎn)生比較高的凝集抗體效價(jià)。這個(gè)結(jié)果預(yù)示著如果采用這些菌株作為自家疫苗的出發(fā)菌株，就可能使受免草魚獲得對(duì)細(xì)菌性敗血癥比較強(qiáng)的免疫保護(hù)力。（參考文獻(xiàn)略）