趙忠勤

（遼寧省撫順市第四醫(yī)院結(jié)核二病房，遼寧 撫順 113123）

結(jié)核性胸膜炎是一種肺外結(jié)核病，在我國(guó)被列為結(jié)核病的第四類型，是引起患者胸腔積液的主要原因，占比可達(dá)49.5%～54.5%[1]。結(jié)核性胸膜炎沒(méi)有特異性的臨床表現(xiàn)，增大了診斷的難度。目前在為結(jié)核性胸膜炎患者實(shí)施很短的過(guò)程中，最為主要的診斷參考依據(jù)有：胸腔積液的常規(guī)檢查、影像學(xué)表現(xiàn)、臨床表現(xiàn)、病史問(wèn)詢等，并要結(jié)合臨床治療效果實(shí)施判斷，通過(guò)這種常規(guī)的診斷方式，其診斷準(zhǔn)確率是比較低的，難以將其與惡性胸腔積液予以良好的鑒別，很容易導(dǎo)致出現(xiàn)誤診，從而引發(fā)嚴(yán)重后果。隨著各項(xiàng)技術(shù)的進(jìn)步與發(fā)展，在結(jié)核性胸膜炎的臨床診斷工作中，逐漸引進(jìn)了病理學(xué)檢查與細(xì)菌學(xué)檢查，隨著一段時(shí)間的研究與發(fā)展，這意見(jiàn)逐漸發(fā)展成為結(jié)核性胸膜炎診斷的金標(biāo)準(zhǔn)，但是在實(shí)際的臨床應(yīng)用中，結(jié)核性胸腔積液當(dāng)中所包含的細(xì)菌含量是比較小的，胸腔積液中結(jié)核菌培養(yǎng)及涂片分枝桿菌陽(yáng)性率是比較低的，再加上胸腔積液中結(jié)核分枝桿菌的培養(yǎng)時(shí)間比較長(zhǎng)，通過(guò)胸腔鏡取病理檢查或者是胸膜活檢的方式檢查出的陽(yáng)性率是比較高的，但是這都是有創(chuàng)的檢查方式，很難在臨床上大規(guī)模的常規(guī)應(yīng)用。隨著分子生物學(xué)技術(shù)及免疫學(xué)技術(shù)的進(jìn)一步發(fā)展，其在大規(guī)模篩查中的適用性越來(lái)越高，并且具有快速、簡(jiǎn)便的特點(diǎn)，但是還是存在操作不當(dāng)影響檢查結(jié)果、假陽(yáng)性等缺陷，這導(dǎo)致其在結(jié)核性胸膜炎診斷中的應(yīng)用存在一定的局限性，探究一種新型的檢測(cè)技術(shù)，促使結(jié)核性胸膜炎診斷準(zhǔn)確性的提升具有非常重要的意義。為了提高診斷的準(zhǔn)確率，以本院2015年11月～2017年11月收治的55例結(jié)核性胸膜炎的患者為研究對(duì)象，現(xiàn)報(bào)道如下。

1 資料與方法

1.1 臨床資料 研究對(duì)象選為2015年11月～2017年11月于本院接受診治的結(jié)核性胸膜炎患者、惡性胸腔積液患者、非結(jié)核性胸膜炎患者和健康志愿者各55例，所選患者均無(wú)合并其他嚴(yán)重的器官性疾病和精神疾病等。結(jié)核性胸膜炎組有男28例和女27例，年齡20～70歲，平均（42.8±13.5）歲；惡性胸腔積液組有男29例和女26例，年齡24～68歲，平均（43.5±11.8）歲；非結(jié)核性胸膜炎組有男27例和女28例，年齡22～69歲，平均（43.0±11.4）歲；健康志愿者組有男28例和女27例，年齡22～70歲，平均（43.7±11.2）歲。對(duì)4組患者的臨床資料進(jìn)行比較差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，具有可比性。1.2 方法 采集被檢者的外周靜脈血4 ml，放置于抗凝試管中，加入一定量的肝素鋰并使其混合均勻，在4小時(shí)內(nèi)完成外周血單個(gè)核細(xì)胞（PBMC）的分離，具體操作如下：取一個(gè)離心管，記為1號(hào)，注入4 ml RPMI1640培養(yǎng)液，將混合均勻的4 ml抗凝血液樣本導(dǎo)入此離心管中，使二者均勻混合。再取一個(gè)離心管，記為2號(hào)，注入淋巴細(xì)胞分離液3 ml，將先前完成混合的血壓樣本緩慢倒入2號(hào)離心管中淋巴細(xì)胞分離液的上方，然后置于離心機(jī)中進(jìn)行離心操作，時(shí)間設(shè)置在20 min左右，離心完成后用加樣器吸取白細(xì)胞層，放入一個(gè)15 ml的離心管中，記為3號(hào)，再加入RPMI1640培養(yǎng)液11 ml，離心7 min，待沉淀完全后取分離出的上清液于離心管4號(hào)，加入一定量的無(wú)血清培養(yǎng)液，即AIMV，配置細(xì)胞工作液。

以細(xì)胞工作液進(jìn)行結(jié)核感染T細(xì)胞斑點(diǎn)試驗(yàn)：在板條上制4孔，分別加入50μl的AIMV、抗原A（ESAT-6：結(jié)核分枝桿菌早期分泌靶向抗原6）、抗原B（CFP-10：培養(yǎng)濾液蛋白10）和陽(yáng)性對(duì)照[2]，在每個(gè)孔中均加入100μl的細(xì)胞工作液。將板條放置入CO2培養(yǎng)箱中進(jìn)行16～20 h的溫育，箱內(nèi)溫度維持在37℃，CO2濃度為5%。溫育時(shí)間到達(dá)后，取出板條，倒出孔中液體，使用磷酸鹽緩沖液沖洗4次后，于每孔加入堿性磷酸酶標(biāo)記過(guò)的小鼠抗人IFN-γ單克隆抗體50μl，再次置于CO2培養(yǎng)箱中進(jìn)行1 h的溫育，箱內(nèi)溫度設(shè)定在4～8℃，板條取出后再次用磷酸鹽緩沖液沖洗4次。沖洗過(guò)后，加入50μl的顯色底物，置于培養(yǎng)箱中在暗處、室溫下溫育7 min，取出板條后用自來(lái)水沖洗，晾干，2～3 h后讀取結(jié)果。

1.3 觀察指標(biāo) 比較4組被檢者的陽(yáng)性率，以T-SPOT.TB試劑盒的使用說(shuō)明書(shū)為所測(cè)血液樣本結(jié)果的判定依據(jù)，陽(yáng)性：血液樣本的陰性對(duì)照孔斑點(diǎn)形成細(xì)胞（SFC）小于6，且（檢測(cè)孔SFC-陰性對(duì)照孔SFC）×4的計(jì)算值不小于24；陰性：血液樣本的陰性對(duì)照孔SFC不小于6，且檢測(cè)孔SFC為陰性對(duì)照孔SFC的2倍。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 本研究數(shù)據(jù)均用SPSS 19.0統(tǒng)計(jì)軟件處理，計(jì)數(shù)資料用例數(shù)（n）表示，計(jì)數(shù)資料組間率（%）的比較采用χ2檢驗(yàn)。P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

以ESAT-6抗原、CFP-10抗原作為刺激物時(shí)，結(jié)核性胸膜炎組的陽(yáng)性率大幅超出惡性胸腔積液組、非結(jié)核性胸膜炎組和健康志愿者，組間比較差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。ESAT-6/CFP-10聯(lián)合2種抗原檢測(cè)的陽(yáng)性率顯著高于單種抗原檢測(cè)的陽(yáng)性率，對(duì)比差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05），見(jiàn)表1。

表1 4組被檢者的測(cè)試結(jié)果統(tǒng)計(jì)情況[n（%）]Table 1 4 Statistics of test results for 4 groups of subjects[n(%)]

3 討論

胸膜炎是致病因子侵犯人體的胸膜引起炎癥的疾病，可分為10種類型，結(jié)核性胸膜炎是最為常見(jiàn)的一種，是結(jié)核桿菌及其自溶產(chǎn)物、代謝產(chǎn)物進(jìn)入機(jī)體的胸膜腔而引發(fā)的[3-4]。結(jié)核性胸膜炎患者的臨床表現(xiàn)不存在特異性，難以根據(jù)臨床癥狀來(lái)確診。臨床上將在胸腔積液中檢查到抗酸桿菌和結(jié)核分枝桿菌培養(yǎng)陽(yáng)性作為診斷的金標(biāo)準(zhǔn)，如果利用細(xì)菌學(xué)方法診斷，檢測(cè)的陽(yáng)性率很低；胸膜活檢的準(zhǔn)確性高，但是對(duì)患者的創(chuàng)傷很大[5-6]。因此，臨床上需要一種無(wú)創(chuàng)微創(chuàng)、檢測(cè)陽(yáng)性率高的方式來(lái)進(jìn)行早期診斷。

本研究中使用的結(jié)核感染T細(xì)胞斑點(diǎn)試驗(yàn)是在酶聯(lián)免疫斑點(diǎn)技術(shù)的基礎(chǔ)上發(fā)展而來(lái)的，檢測(cè)原理是基于結(jié)核分枝桿菌的基因中存在著“RD1”的序列，該序列編碼能產(chǎn)生兩種蛋白，分別是本研究中使用的ESAT-6和CFP-10，以這兩種蛋白作為特異性抗原，能將機(jī)體中的T淋巴細(xì)胞刺激成為致敏T淋巴細(xì)胞，并分泌出IFN-γ細(xì)胞因子[7-8]；結(jié)核感染T細(xì)胞斑點(diǎn)試驗(yàn)?zāi)軌驈膯渭?xì)胞水平檢測(cè)到分泌抗體細(xì)胞或者是分泌細(xì)胞因子細(xì)胞，每個(gè)顯色斑點(diǎn)均代表著一個(gè)結(jié)核分枝桿菌致敏的T淋巴細(xì)胞，因此，通過(guò)斑點(diǎn)的數(shù)目即可判定機(jī)體內(nèi)是否存在著致敏T淋巴細(xì)胞，并可計(jì)算數(shù)目，從而可知是否存在著結(jié)核分枝桿菌[9]。從研究結(jié)果來(lái)看，結(jié)核性胸膜炎組結(jié)核感染T細(xì)胞斑點(diǎn)試驗(yàn)的陽(yáng)性檢出率高達(dá)85.5%和78.2%，聯(lián)合使用ESAT-6和CFP-10的話，可將陽(yáng)性率大幅提高至92.7%。已有的研究結(jié)果指出，效應(yīng)T淋巴細(xì)胞的存活期是非常短的，一般在病原體被消滅之后就會(huì)消失，所以臨床上對(duì)外周血結(jié)核感染T細(xì)胞斑點(diǎn)試驗(yàn)結(jié)果來(lái)進(jìn)行評(píng)估，也能夠?qū)颊叩呐R床療效評(píng)估及病情活動(dòng)性的監(jiān)測(cè)提供一定的參考依據(jù)。結(jié)核感染T細(xì)胞斑點(diǎn)試驗(yàn)出現(xiàn)假陰性或者是假陽(yáng)性的概率也是非常低的，出現(xiàn)假陰性可能與在細(xì)胞免疫發(fā)生前獲取了標(biāo)本存在一定的關(guān)聯(lián)性，有時(shí)也會(huì)因?yàn)樯贁?shù)免疫系統(tǒng)功能的不健全導(dǎo)致其值與臨界值接近，對(duì)于這種情況，對(duì)所選取的參考值應(yīng)仔細(xì)考量、慎重選擇，綜合的考慮其他輔助檢查結(jié)果及患者的臨床表現(xiàn)來(lái)進(jìn)行進(jìn)一步的判斷，對(duì)于假陽(yáng)性的出現(xiàn)，可能與患者曾今有過(guò)結(jié)核分枝桿菌潛伏性感染存在一定的關(guān)聯(lián)性[10]。與傳統(tǒng)的酶聯(lián)免疫法相比，結(jié)核感染T細(xì)胞斑點(diǎn)試驗(yàn)應(yīng)用于結(jié)核性胸膜炎患者臨床診斷中的穩(wěn)定性更高，但是實(shí)驗(yàn)人員操作手法等外在因素也會(huì)對(duì)試驗(yàn)結(jié)果產(chǎn)生影響，并且在溫度環(huán)境比較低的情況下，環(huán)境中的效應(yīng)T淋巴數(shù)量會(huì)有所減少，若是將獲取的胸水長(zhǎng)時(shí)間放置，會(huì)導(dǎo)致其T淋巴數(shù)量逐漸減少，甚至是消失，因此，臨床診斷過(guò)程中，送檢的胸水必須是新鮮采集的。

綜上所述，核感染T細(xì)胞斑點(diǎn)試驗(yàn)用于結(jié)核性胸膜炎的診斷有較高的準(zhǔn)確率，操作簡(jiǎn)單，建議臨床采納和推廣。