李宏帥，王鑫廷，王媛，楊潔

(天津醫(yī)科大學(xué)，天津300070)

內(nèi)質(zhì)網(wǎng)是真核細胞中蛋白質(zhì)合成和鈣離子貯積的主要場所，它能夠參與細胞的蛋白質(zhì)質(zhì)量控制、糖基化修飾、蛋白質(zhì)降解、細胞凋亡以及鈣離子穩(wěn)態(tài)等多種生物學(xué)功能，分子伴侶在其中發(fā)揮著十分重要的作用。Calnexin作為一種重要的伴侶蛋白，其特征在于協(xié)助蛋白質(zhì)折疊和質(zhì)量控制，確保正確折疊和組裝的蛋白質(zhì)進行進一步的加工[1，2]。在Calnexin中包含內(nèi)質(zhì)網(wǎng)腔結(jié)構(gòu)域、跨膜結(jié)構(gòu)域和C末端結(jié)構(gòu)域[3]。Calnexin C端尾部結(jié)構(gòu)域可被半胱氨酸蛋白酶8切割，觸發(fā)依賴表皮生長因子的方式促進STAT3轉(zhuǎn)錄[4]。Calnexin細胞質(zhì)C端尾部結(jié)構(gòu)域也存在小泛素相關(guān)修飾(small ubiquitinrelated-modifier SUMO)，與SUMO化E2連接酶UBC9和酪氨酸磷酸酶1B相互作用[5]。Calnexin作為一種ER伴侶分子介導(dǎo)粗面內(nèi)質(zhì)網(wǎng)上的蛋白質(zhì)折疊，在未成熟胸腺細胞的細胞膜發(fā)現(xiàn)高水平的Calnexin，而在內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激情況下細胞膜表面的Calnexin可以減少，細胞膜上Calnexin表達量的改變可影響細胞表面的一些特性，并可能影響細胞與細胞的相互作用[6]。為了進一步研究Calnexin蛋白在腫瘤細胞中潛在作用，本研究構(gòu)建了人Calnexin基因慢病毒載體，包裝病毒后感染并篩選穩(wěn)定表達Calnexin蛋白的人宮頸癌Hela細胞株，為探討Calnexin基因?qū)m頸癌潛在的調(diào)控作用提供細胞模型。

1 材料與方法

1.1 細胞及試劑 人宮頸癌細胞株Hela及人腎上皮細胞株293T (人腎上皮細胞株改良后廣泛應(yīng)用于病毒包裝的工具細胞)來自天津醫(yī)科大學(xué)免疫學(xué)系楊潔實驗室。慢病毒載體質(zhì)粒pLVX-IRES-puro、包裝質(zhì)粒1和包裝質(zhì)粒2由天津醫(yī)科大學(xué)生物化學(xué)與分子生物學(xué)系石磊教授饋贈。嘌呤霉素和氨芐青霉素購自solarbio公司。大腸桿菌Trans1-T1感受態(tài)購自天津索羅門生物科技有限公司。小量DNA回收純化試劑盒購自Vazyme公司。除內(nèi)毒素質(zhì)粒抽提試劑盒購自Biomiga公司。DreamTaq Green PCR Master Mix(2X)、EcoR1、和BamH1限制性內(nèi)切酶、T4 DNA 連接酶購自thermo公司。引物合成和基因測序由天津GENEWIZ公司完成。鼠源Flag M2 抗體購自Sigma公司。兔源Calnexin多克隆抗體購自Proteintech公司。蛋白濃度檢測試劑盒購自Thermo公司。ECL Western blotting 試劑盒購自solarbio公司。

1.2 嘌呤霉素最低致死濃度監(jiān)測 將Hela細胞按2×105/孔鋪到6孔板內(nèi)，用含10%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)基培養(yǎng)24 h，分別加入0、0.5、0.75、1.0、1.25、1.5 μg/mL嘌呤霉素培養(yǎng)48 h。結(jié)果顯示，加入1.25、1.5 μg/mL嘌呤霉素培養(yǎng)基培養(yǎng)的Hela細胞全部死亡，加入1.0 μg/mL嘌呤霉素培養(yǎng)基培養(yǎng)的Hela細胞部分死亡，因此將1.0 μg/mL嘌呤霉素劑量定為Hela細胞的最低致死濃度(慢病毒載體含有嘌呤霉素抗性基因，可以對一定濃度的嘌呤霉素耐受。為了后期篩選出成功轉(zhuǎn)入慢病毒載體的細胞株，要先檢測嘌呤霉素對Hela細胞的最低致死濃度)?？顾幒Y選擇1.0 μg/mL嘌呤霉素進行實驗。

1.3 重組慢病毒載體pLVX-FLAG-Calnexin的構(gòu)建與鑒定 設(shè)計FLAG-Calnexin基因的PCR引物，在兩條引物中分別加入FLAG標(biāo)簽及EcoR1、BamH1限制性酶切位點。設(shè)計的上游引物為5′-CCGGAATTCATGGATTACAAGGATGACGACGATAAGAT-GGAAGGGAAGTGGTTG-3′，下游引物為5′-TGCGGATCCTCACTCTCTTCGTGGCTTTCTGT-3′。按照說明書要求，設(shè)置PCR反應(yīng)體系的程序，從Hela細胞野生型cDNA中克隆出完整的FLAG-Calnexin片段。用1%的瓊脂糖凝膠將PCR產(chǎn)物進行電泳鑒定，所得 PCR目的產(chǎn)物大小為1 824 bp。用EcoR1和BamH1雙酶切純化后的PCR產(chǎn)物及pLVX-IRES-puro慢病毒載體，瓊脂糖凝膠電泳后回收并純化。用T4 DNA連接酶將具有相同黏性末端的線性化慢病毒載體與FLAG-Calnexin片段進行連接，連接條件為25 ℃、30 min。將連接后的產(chǎn)物轉(zhuǎn)化至大腸桿菌Trans1-T1感受態(tài)內(nèi)，在氨芐青霉素抗性的 LB 平板上篩選出陽性單克隆菌落，并編號。進行菌落PCR鑒定。挑取PCR后條帶位置與目的條帶大小一致的鑒定為陽性的單克隆菌落，37 ℃搖菌擴大培養(yǎng)，使用質(zhì)粒提取試劑盒提取重組質(zhì)粒。采用EcoR1、BamH1對重組質(zhì)粒雙酶切進行鑒定，并用1%瓊脂糖凝膠電泳跑膠查看片段大小。對雙酶切鑒定正確的重組質(zhì)粒采用FLAG-Calnexin引物進行質(zhì)粒PCR，將雙酶切后顯示條帶位置對應(yīng)的大小與目的基因大小一致的質(zhì)粒進行DNA測序，進一步確定插入序列的正確性。

1.4 穩(wěn)定表達FLAG-Calnexin的Hela細胞株的建立及鑒定 將293T細胞正常傳代培養(yǎng)，在細胞生長到大約60%匯合后，包裝質(zhì)粒1和2與空載質(zhì)粒及包裝質(zhì)粒1和2與重組質(zhì)粒，在轉(zhuǎn)染試劑聚乙烯亞胺介導(dǎo)下共轉(zhuǎn)染至293T細胞內(nèi)。6 h后換液，正常培養(yǎng)。24 h及48 h收取培養(yǎng)上清，常溫500 g離心5 min，0.45 μm的濾器過濾后，-80 ℃保存用于后續(xù)實驗。將Hela細胞按照2×105/孔接種于6孔板，細胞大約60%匯合后吸去培養(yǎng)上清，留取空白對照孔，選兩孔分別加入空載的慢病毒液與重組后慢病毒液，再加100 μL胎牛血清和20 μL助轉(zhuǎn)試劑聚凝胺。感染12 h換正常培養(yǎng)液。48 h加入嘌呤霉素1.0 μg/mL進行抗藥篩選。藥篩72 h后篩選出能夠穩(wěn)定表達FLAG-Calnexin的Hela穩(wěn)定株。用加入蛋白降解抑制劑的RIPA細胞裂解液收取Hela野生型及穩(wěn)定株細胞的總蛋白，采用BCA法檢測總蛋白濃度后取10 μg，以β-actin為內(nèi)參，用Western blotting法檢測Calnexin蛋白，曝光結(jié)果，灰度掃描后使用Image J軟件分析，計算灰度值。利用TRIzol法提取Hela野生型細胞及FLAG-Calnexin穩(wěn)定株總的RNA，每個樣品按5.0 μg逆轉(zhuǎn)錄為cDNA，采用熒光定量PCR法，以β-actin為內(nèi)參，檢測Calnexin mRNA，利用Stepone軟件計算表達量。

2 結(jié)果

2.1 重組慢病毒質(zhì)粒pLVX-FLAG-Calnexin的鑒定結(jié)果 挑取的15個陽性克隆菌落PCR后，產(chǎn)物瓊脂糖凝膠電泳結(jié)果顯示第 4、6、7、8、9、10、12、13、15條帶位于2 000 bp左右，大小與Calnexin大小基本相符，證明轉(zhuǎn)化成功(圖1)。挑選4、9、10號菌液提取質(zhì)粒，雙酶切后得到兩個條帶，分別為9 000 bp和2 000 bp左右(圖2)，質(zhì)粒PCR產(chǎn)物的條帶均在2 000 bp左右(圖3)，初步鑒定質(zhì)粒正確。4、9、10號菌液基因測序結(jié)果與目的基因Calnexin序列比對后顯示完全一致，證明FLAG-Calnexin已成功插入到pLVX-IRES-puro載體中。

注:M為DNA Marker;1～15泳道為菌落PCR產(chǎn)物;“+”為陽性對照;“-” 為陰性對照。

圖1重組質(zhì)粒菌落PCR產(chǎn)物

注: M為 DNA Marker; Vec為 pLVX-IRES-Puro載體;1、2、3泳道為1號、2號、3號陽性克隆菌落提取的環(huán)狀pLVX-FLAG-Calnexin 重組質(zhì)粒; “-”為酶切前質(zhì)粒;“+”為質(zhì)粒經(jīng)過EcoR1和BamH1雙酶切后產(chǎn)物。

圖2重組慢病毒質(zhì)粒EcoR1和BamH1雙酶切產(chǎn)物

注：M為 DNA Marker；1、2、3泳道為pLVX-FLAG-Calnexin重組質(zhì)粒PCR產(chǎn)物

圖3重組慢病毒質(zhì)粒PCR產(chǎn)物

2.2 穩(wěn)定表達Calnexin Hela細胞株鑒定結(jié)果 空載對照及穩(wěn)定表達Calnexin的Hela細胞株中Calnexin蛋白相對表達量分別為0.92±0.17、2.14±0.25，Calnexin mRNA的相對表達量分別為1.93 ±0.25、6.15±0.21，穩(wěn)定表達Calnexin的Hela細胞株中Calnexin蛋白及mRNA的相對表達量較空白對照及空載對照明顯升高(P均<0.01)。

3 討論

內(nèi)質(zhì)網(wǎng)(ER)是最復(fù)雜的細胞器之一，具有蛋白質(zhì)合成、蛋白質(zhì)折疊、蛋白質(zhì)降解、糖基化、脂質(zhì)合成、脂質(zhì)轉(zhuǎn)移、鈣信號傳導(dǎo)和鈣儲存等多種功能，包含多個結(jié)構(gòu)域，但參與內(nèi)質(zhì)網(wǎng)蛋白分選和調(diào)節(jié)及分布的蛋白質(zhì)是未知的。在線粒體相關(guān)膜(MAMs)與線粒體相互作用的內(nèi)質(zhì)網(wǎng)的子結(jié)構(gòu)域上發(fā)現(xiàn)大量的Calnexin，MAMs已經(jīng)成為富含大量但不是全部內(nèi)質(zhì)網(wǎng)伴侶分子和氧化還原酶的內(nèi)質(zhì)網(wǎng)區(qū)域，表明該區(qū)域存在定位機制，例如，Calnexin主要存在于滑面內(nèi)質(zhì)網(wǎng)上，與粗面內(nèi)質(zhì)網(wǎng)相關(guān)的蛋白質(zhì)二硫鍵異構(gòu)酶(PDI)相反，但可以在激活Rab32后重新分布到粗面內(nèi)質(zhì)網(wǎng)上[7～9]。在粗面內(nèi)質(zhì)網(wǎng)腔中存在廣泛的蛋白質(zhì)調(diào)控網(wǎng)絡(luò)，負責(zé)維持蛋白質(zhì)穩(wěn)態(tài)，控制蛋白質(zhì)的合成和降解，作為分子伴侶或折疊酶的Calnexin通過翻譯后修飾穩(wěn)定蛋白質(zhì)、識別錯誤折疊的蛋白質(zhì)并調(diào)節(jié)正確的亞細胞終點。接下來，正確折疊的蛋白質(zhì)從粗面內(nèi)質(zhì)網(wǎng)上離開并通過分泌途徑轉(zhuǎn)運至其最終目的地，通過Calnexin-Calreticulin(鈣聯(lián)蛋白-鈣網(wǎng)蛋白)循環(huán)高效控制機制準(zhǔn)確地協(xié)調(diào)新合成蛋白質(zhì)的轉(zhuǎn)運過程。而將錯誤折疊的蛋白質(zhì)轉(zhuǎn)移到胞質(zhì)，并通過ER相關(guān)降解途徑降解[10]。在Calnexin介導(dǎo)的糖蛋白折疊和細胞外表達中絲氨酸蛋白酶、腸肽酶和凝血酶原的蛋白酶結(jié)構(gòu)域中的N-糖基化存在的共同機制，該機制獨立于鈣網(wǎng)蛋白，并以自主方式運作，這一過程涉及兩個步驟：直接鈣連蛋白與靶蛋白的結(jié)合以及隨后鈣連接蛋白與單葡糖基化N-聚糖的結(jié)合。絲氨酸蛋白酶、腸肽酶和凝血酶原的蛋白酶結(jié)構(gòu)域中的N-糖基化位點的消除抑制細胞中的絲氨酸蛋白酶和腸肽酶細胞表面表達和凝血酶原分泌[11]。

Calnexin的表達已被證明是細胞對內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激介導(dǎo)的細胞死亡的敏感性的良好預(yù)測因子，并通過其依賴性Caspase酶切割來抑制細胞凋亡[12]。Calnexin也定位于酵母、菌絲和孢子的表面[13]。二倍體真菌感染、機會性霉菌感染、不同子囊菌感染會誘導(dǎo)Calnexin特異性CD4+T細胞的擴增。在葡聚糖顆粒中傳遞Calnexin誘導(dǎo)真菌抗原特異性CD4+T細胞擴增，因此，Calnexin的免疫原性和保守性可以成為疫苗靶標(biāo)[13]。在多發(fā)性硬化癥(MS)患者、中樞神經(jīng)系統(tǒng)脫髓鞘炎性疾病患者及動物模型中，其循環(huán)免疫細胞通過血腦屏障進入中樞神經(jīng)系統(tǒng)，導(dǎo)致炎癥、髓鞘破壞和神經(jīng)元損傷，在MS患者的腦內(nèi)皮細胞中發(fā)現(xiàn)豐富的Calnexin，Calnexin的缺失導(dǎo)致了腦內(nèi)皮細胞功能的缺陷[14]。

宮頸癌是一種死亡率很高的惡性腫瘤[15～18]。Hela細胞株是研究宮頸癌很好的細胞模型。為了便于研究Calnexin在宮頸癌細胞中潛在的作用，同時克服轉(zhuǎn)染效率低對實驗開展的影響，我們使用慢病毒載體能夠效地將外源目的基因穩(wěn)定整合入宿主細胞的基因組中,從而達到目的基因持久穩(wěn)定性表達的目的。本研究將FLAG-Calnexin基因插入慢病毒表達載體pLVX-IRES-puro中，成功構(gòu)建了重組慢病毒載體pLVX-FLAG-Calnexin，并建立了穩(wěn)定表達Calnexin的Hela細胞株，為從細胞與分子水平上探討Calnexin基因?qū)m頸癌調(diào)控作用及機制提供了體外細胞系模型，為進一步明確Calnexin在宮頸癌形成、發(fā)展及轉(zhuǎn)移中的作用奠定了基礎(chǔ)。