陸可鈺，孔令燦，潘紅陽，朱 松*

(1.江南大學(xué) 食品科學(xué)與技術(shù)國家重點實驗室，江南大學(xué)分析測試中心，江蘇 無錫 214122；2.無錫市疾病預(yù)防控制中心，江蘇 無錫 214023)

溫度影響各種化學(xué)和生物反應(yīng)的進程，是生物體內(nèi)被測量最頻繁的基本參數(shù)[1]。因此準(zhǔn)確測量細胞溫度及其在細胞內(nèi)的變化有助于促進細胞生物學(xué)和生物醫(yī)學(xué)的發(fā)展[2]。傳統(tǒng)的溫度傳感器是基于對侵入式探頭的熱量檢測，且無法遠程測量高分辨率的局部溫度?；跓晒獾臏囟葌鞲衅饕蚍乔秩胄詸z測和耐用性等優(yōu)點而備受關(guān)注[3]，并顯示出巨大的優(yōu)勢。最近，許多用于溫度測量的熒光探針被開發(fā)，如熒光染料[4]、熒光聚合納米顆粒[5]、量子點(QDs)[6]、稀土摻雜的納米顆粒[7]以及聚合物水凝膠納米材料[8]等。但這些熒光探針由于穩(wěn)定性差、毒性大或制備成本高等原因限制了其進一步應(yīng)用。

金屬熒光納米簇(NCs)一般由幾個至幾百個金屬原子組成，在從紫外(UV)到近紅外區(qū)域的寬光譜區(qū)存在離散的能級和尺寸依賴性熒光，同時表現(xiàn)出超小尺寸、優(yōu)異的生物相容性和強熒光性，因此它們作為潛在的生物標(biāo)記物而備受關(guān)注，并廣泛應(yīng)用于生物成像、催化和離子傳感等領(lǐng)域[9-12]。因此近年來熒光金屬納米團簇發(fā)展迅速。目前，單金屬納米簇在細胞成像和溫度傳感中也得到廣泛研究[13-15]，但由于反應(yīng)條件相對復(fù)雜、原材料昂貴或量子產(chǎn)率低等原因使其在細胞溫度傳感方面的應(yīng)用受到限制。與單金屬相比，由兩種不同金屬元素組成的雙金屬納米簇在電子、光學(xué)和催化性能等方面具有更多的優(yōu)勢[16-17]。因此近年來，許多學(xué)者開始致力于雙金屬納米材料的研究。例如,Zhang等[9]采用水熱法合成Au-AgNCs，用于選擇性分析Hg2+和Cu2+。Huang等[18]用硫辛酸制備高度熒光的Au/AgNCs檢測Fe3+。Tian等[19]利用蛋清蛋白在微波輔助下合成了具有橙色熒光的AuAgNCs，并用于CN-檢測和生物成像。但使用雙金屬納米簇特別是大粒徑(比如100 nm)金屬納米簇作為溫度傳感器檢測細菌細胞體內(nèi)溫度的相關(guān)研究卻非常少見。主要原因在于：雙金屬納米簇的制備比較困難；大粒徑的金屬納米簇一般不發(fā)光，為細胞中溫度成像帶來了困難；大粒徑的納米簇組裝體進入細胞后，在酶的作用下，可能會面臨解離的風(fēng)險，導(dǎo)致發(fā)光的納米材料進入細胞后不再發(fā)光。

本文在溫和的反應(yīng)條件下通過簡單直接的綠色合成方法，以D-青霉胺為配體制備出水溶性的銅銀熒光納米簇(Cu-AgNCs)，并對其形貌、結(jié)構(gòu)、熒光性能等進行了表征。所制備的Cu-AgNCs粒徑較大，具有很高的量子產(chǎn)率和很好的聚集誘導(dǎo)發(fā)光現(xiàn)象，有望作為熒光納米探針應(yīng)用于溫度傳感和細胞成像等領(lǐng)域。

1 實驗部分

1.1 儀器與試劑

UV-2450型紫外可見分光光度計、F-4500型熒光光譜儀(日本島津公司)，Nexus670型傅立葉變換紅外光譜儀(美國Nicolet公司)，JEM-2100型透射電子顯微鏡(日本JEOL公司)，TCS SP8激光共聚焦顯微鏡(德國徠卡公司)。

D-青霉胺(98%)、噻唑藍(MTT)、二甲基亞砜(DMSO)購自西格瑪奧德里奇(上海)貿(mào)易有限公司。硫酸銅(CuSO4·5H2O，98%)、硝酸銀(AgNO3，99%)購自阿拉丁試劑(中國)公司。所有試劑均為分析純。大腸桿菌(E.coli)購自中國普通微生物菌種保藏管理中心。實驗用水均經(jīng)Milli-Q純水系統(tǒng)過濾制備。

1.2 Cu-AgNCs的制備

參照文獻方法[20]制備Cu-AgNCs，并加以改進，具體過程如下：在室溫下將8 mg的D-青霉胺、40 μL的CuSO4溶液(100 mmol/L)以及10 μL的AgNO3溶液(100 mmol/L)依次加至5 mL水中，攪拌反應(yīng)5 min后初步制得Cu-AgNCs，所得樣品離心去溶劑，將沉淀物重新分散于水中備用。

1.3 熒光量子產(chǎn)率的測定

首先將硫酸奎寧溶于0.1 mol/L硫酸溶液中(量子產(chǎn)率為54%)，在同一條件下分別測量Cu-AgNCs和硫酸奎寧的紫外吸收光譜(360 nm處)和熒光發(fā)射光譜(360 nm激發(fā))，然后按照下式計算Cu-AgNCs的熒光量子產(chǎn)率[21]：

式中，st和x分別代表硫酸奎寧標(biāo)準(zhǔn)溶液和Cu-AgNCs溶液，φ和I分別為熒光量子產(chǎn)率和熒光強度，A和η分別為溶液的吸光度和折光率(水溶液中均為1.33)，為減少樣品的自吸收效應(yīng)，保持測試溶液在360 nm處的吸光值小于0.05。

1.4 細胞毒性實驗

將大腸桿菌細胞在LB(Luria Bertani)培養(yǎng)基中于37 ℃在振蕩培養(yǎng)箱中培養(yǎng)過夜進行活化。將活化好的細胞加入96孔板中，每孔菌液濃度約為108cfu/mL,在孔中加入LB培養(yǎng)基和不同濃度的Cu-AgNCs溶液(0～50 mg/L)繼續(xù)培養(yǎng)24 h。實驗設(shè)置空白對照組，每組設(shè)6 個平行復(fù)孔，隨后加入20 μL的MTT(5 g/L)溶液，繼續(xù)培養(yǎng)4 h。之后除去培養(yǎng)基，并向每孔中加入100 μL DMSO以溶解藍紫色結(jié)晶。測定各孔在570 nm處的吸光值(OD)。實驗至少重復(fù)3次。不同濃度Cu-AgNCs存在下的細胞存活率根據(jù)下式計算：細胞存活率(%)=OD實驗組/OD對照組×100%。

1.5 細菌成像實驗

將Cu-AgNCs(30 mg/L)溶液加至活化好的大腸桿菌中，在37 ℃下?lián)u床培養(yǎng)24 h。取培養(yǎng)后的細菌于10 000 r/min 下離心3 min，去上清液后用水洗滌3次以除去未結(jié)合的納米簇，再將細胞固定在載玻片上用激光共聚焦熒光顯微鏡進行觀察。

不同溫度下大腸桿菌成像實驗過程如下：將Cu-AgNCs(30 mg/L)溶液加至活化好的大腸桿菌中后，將溶液平均分成3份，分別置于不同的共聚焦培養(yǎng)皿中，在37 ℃下培養(yǎng)箱培養(yǎng)24 h。測試前分別將上述培養(yǎng)皿中的細菌在不同溫度(293、303、313 K)下培養(yǎng)10 min后，棄去培養(yǎng)液，立即進行激光共聚焦檢測。

2 結(jié)果與討論

2.1 Cu-AgNCs的表征

Cu-AgNCs的UV-Vis吸收光譜在305 nm處有強吸收峰,納米簇水溶液在可見光下為透明的澄清液體，而在365 nm 紫外燈下則顯示出強烈的紅色熒光(圖1A)，表明所制備的Cu-AgNCs具有良好的光致發(fā)光性。同時，熒光光譜表明Cu-AgNCs的最大激發(fā)波長和發(fā)射波長分別為340 nm和600 nm(圖1B)，這與紫外燈下觀察到的紅色熒光相一致。根據(jù)“1.3”熒光量子產(chǎn)率的測定方法，測得所制備熒光納米簇的量子產(chǎn)率可達到9.6%。

利用透射電子顯微鏡(TEM)對合成的Cu-AgNCs進行表征(圖2A)，由圖可知Cu-AgNCs近乎球形，平均粒徑約為180 nm，且具有良好的分散性，所得結(jié)果與文獻報道[20]相似。同時，利用TEM附帶的X射線能譜儀(EDS)對所得樣品進行元素分析，EDS譜圖表明Cu和Ag同時存在(圖2B)。從傅立葉變換紅外光譜(FT-IR)結(jié)果(圖3)可以看出，相比于純的D-青霉胺，Cu-AgNCs在2 520 cm-1處的峰消失，這是由于S—H鍵發(fā)生了斷裂并形成新的S—Cu(Ag)鍵。上述結(jié)果證明已形成了Cu-AgNCs。

2.2 Cu-AgNCs對溫度變化的光學(xué)響應(yīng)

制備得到的Cu-AgNCs在279～355 K溫度范圍內(nèi)具有良好的溫度敏感的熒光性質(zhì)(圖4)。從279 K增至355 K，Cu-AgNCs在580 nm處的熒光強度降低了約85%，但熒光光譜的位置未發(fā)生遷移。以熒光強度(Y)對溫度(X)進行線性擬合，結(jié)果顯示，二者之間呈良好的線性關(guān)系，其線性方程為：Y=0.022 3X+14.195，相關(guān)系數(shù)(r2)為0.995。此外，對Cu-AgNCs水溶液的熒光強度隨溫度變化的可逆循環(huán)性能進行了研究，通過連續(xù)6次測定在279 K 和323 K之間的多次加熱和冷卻循環(huán)，發(fā)現(xiàn)該熒光納米簇呈現(xiàn)良好的可重復(fù)使用性(圖5A)，并在加熱和冷卻過程中存在輕微的溫度滯后(圖5B)。該特性是溫度敏感熒光材料的典型特征，并遵循玻爾茲曼分布；隨著溫度升高，分子碰撞頻率和非輻射躍遷速率增加，而輻射躍遷速率保持不變，導(dǎo)致激發(fā)態(tài)(即熒光強度)發(fā)射強度降低[22-23]。以上結(jié)果表明Cu-AgNCs具有響應(yīng)溫度范圍廣、靈敏度高、重復(fù)性強，以及熒光強度與溫度存在線性關(guān)系等特性，可用作溫度熒光傳感器對細胞和生物體內(nèi)的溫度進行檢測。

圖3 D-青霉胺(a)和Cu-AgNCs(b)的紅外光譜圖Fig.3 FT-IR spectra of pure D-penicillamine(a) and Cu-AgNCs(b)

圖4 Cu-AgNCs熒光發(fā)射強度隨溫度的變化Fig.4 Emission spectral changes of Cu-AgNCs upon increasing temperatures from 279 K to 335 K at step of 5 Kinsert:linear relationship between emission intensity and temperature

2.3 細胞毒性及細菌成像實驗

以大腸桿菌為典型細菌代表，考察了Cu-AgNCs對細菌的細胞毒性和熒光成像。MTT實驗結(jié)果顯示，當(dāng)Cu-AgNCs質(zhì)量濃度不超過30 mg/L時，細菌細胞存活率大于90%，即使Cu-AgNCs質(zhì)量濃度達50 mg/L，細胞存活率仍在80%以上。表明Cu-AgNCs具有較低的細胞毒性。

由于其獨特的熒光性質(zhì)、良好的水溶性以及低毒性，制備的Cu-AgNCs可用于熒光標(biāo)記和成像。圖6顯示了大腸桿菌與Cu-AgNCs(30 mg/L)培養(yǎng)24 h下的明場、熒光場及疊加圖的激光共聚焦圖片。從明場圖中可見到納米簇培養(yǎng)下的細菌細胞仍保持正常形態(tài)，表明Cu-AgNCs具有良好的生物相容性。而405 nm激光照射的熒光圖像顯示，通過細胞內(nèi)吞作用，細菌內(nèi)呈現(xiàn)出明亮的紅色熒光且在細菌內(nèi)部均勻分布，說明Cu-AgNCs已成功標(biāo)記大腸桿菌細胞。同時，未觀察到任何細胞損傷，表明Cu-AgNCs可用作細菌熒光成像的探針。

為深入理解大腸桿菌細胞中溫度感應(yīng)的納米測量裝置，通過共聚焦熒光顯微鏡檢測了在293、303、313 K下Cu-AgNCs的細胞成像。圖7顯示了用30 mg/L的Cu-AgNCs與大腸桿菌孵育24 h后的共聚焦熒光圖像。熒光圖像隨著溫度的升高而大幅度猝滅，表明熒光發(fā)射強度明顯受溫度影響，所制備的納米簇可作為多功能納米測溫裝置用于細胞溫度傳感。以上結(jié)果顯示，制備的Cu-AgNCs有望作為熒光探針在細胞成像方面得到應(yīng)用。

3 結(jié) 論

在溫和條件下以D-青霉胺為配體，通過一步法制備出水溶性的銅銀熒光納米簇(Cu-AgNCs)，所需原料簡單易得，實驗操作簡便。實驗制備的Cu-AgNCs粒徑較大(平均粒徑為180 nm)，具有很好的聚集誘導(dǎo)發(fā)光現(xiàn)象，在室溫下顯示紅色熒光，量子產(chǎn)率可達到9.6%。同時，該熒光納米簇的熒光強度和溫度之間存在良好的線性關(guān)系。此外，以大腸桿菌為細菌代表的細胞毒性實驗和共聚焦熒光成像測試表明，制備的熒光納米簇細胞毒性小、生物相容性好，有望作為熒光納米探針應(yīng)用于溫度傳感和細胞成像等領(lǐng)域。