史 鎧，雷春陽，聶 舟

(湖南大學(xué) 化學(xué)生物傳感與計(jì)量學(xué)國家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，化學(xué)化工學(xué)院，湖南 長沙 410082)

CRISPR(Clustered regularly interspaced short palindromic repeats)是大多數(shù)細(xì)菌及古細(xì)菌中抵御病毒入侵的一種獲得性免疫方式。CRISPR/Cas系統(tǒng)的發(fā)現(xiàn)可以追溯到1987年，Nakata等[1]首次在大腸桿菌的基因組中發(fā)現(xiàn)了串聯(lián)的間隔重復(fù)序列，但在當(dāng)時(shí)并未引起學(xué)術(shù)界的關(guān)注。2002年，Jansen等[2]將這一奇特的重復(fù)間隔序列正式命名為串聯(lián)間隔短回文重復(fù)序列(Clustered regularly interspaced short palindromic repeats，CRISPR)。2005年，Bolotin等[3-4]發(fā)現(xiàn)這些重復(fù)間隔序列來源于外援入侵的噬菌體的基因，推測CRISPR/Cas系統(tǒng)可能與細(xì)菌的免疫系統(tǒng)有關(guān)。直至2011年，Koonin等[5-7]才揭示了CRISPR/Cas系統(tǒng)介導(dǎo)的免疫機(jī)理：當(dāng)病毒首次入侵時(shí)，細(xì)菌會將病毒的小片段DNA整合到自身的CRISPR間隔區(qū)；病毒再次入侵時(shí)，CRISPR轉(zhuǎn)錄生成一條前體CRISPR RNA(pre-crRNA)，然后pre-crRNA被RNA內(nèi)切酶切割生成含有與病毒靶標(biāo)序列匹配的成熟CRISPR RNA(crRNA)。該crRNA引導(dǎo)具有核酸內(nèi)切酶活性的Cas蛋白(CRISPR-associated proteins)對靶標(biāo)序列進(jìn)行識別和降解。其中Cas蛋白對靶標(biāo)序列的識別必須依賴于原型間隔序列毗鄰基序(Protospacer adjacent motif，PAM)，因此PAM在CRISPR/Cas系統(tǒng)中起著至關(guān)重要的作用。按Cas蛋白的組成,CRISPR/Cas系統(tǒng)可分為兩大類：第一大類的Cas蛋白為多亞基組成的多蛋白效應(yīng)復(fù)合物，包括Ⅰ、Ⅲ和Ⅳ型；第二大類的Cas蛋白為單個(gè)效應(yīng)蛋白，包括Ⅱ型的Cas9、Ⅴ型的Cas12和Ⅵ型的Cas13[8-9]。2012年，Doudna等[10]證實(shí)結(jié)合crRNA的Cas9可在體外條件下與基因組中DNA靶序列的特定位點(diǎn)結(jié)合并切割，由此揭開了將CRISPR/Cas系統(tǒng)改造為基因編輯工具的序幕。利用經(jīng)過改造的CRISPR/Cas系統(tǒng)，研究者能夠精確、高效地對基因組進(jìn)行切割、替換或添加。近年來，科學(xué)家發(fā)現(xiàn)部分Ⅱ類Cas蛋白具有附屬切割活性，并將其應(yīng)用于核酸快速檢測領(lǐng)域，取得了顯著的成就[11-13]。本文主要介紹CRISPR/Cas系統(tǒng)在核酸檢測領(lǐng)域的最新進(jìn)展，主要涉及Cas9、Cas12a(又名Cpf1)和Cas13a(又名C2c2)3種Ⅱ類Cas蛋白(見表1)在病毒快速檢測、癌癥標(biāo)志物的早期診斷以及遺傳性疾病的診斷等領(lǐng)域的應(yīng)用[11-14]。

表1 3種用于核酸檢測的Cas蛋白的性質(zhì)Table 1 The property of the Cas proteins used for nucleic acid detection

1 Cas9輔助的特異性診斷系統(tǒng)

基于CRISPR/Cas優(yōu)異的序列識別能力，著名的合成生物學(xué)家Collins首次將CRISPR/Cas技術(shù)引入核酸分子診斷[14]，開發(fā)了一種用于低成本區(qū)分寨卡病毒(Zika virus，ZIKV)亞型的紙基傳感器。該傳感器由3個(gè)步驟組成：擴(kuò)增、ZIKV檢測和CRISPR-Cas9輔助的毒株鑒別。從樣本中提取RNA靶標(biāo)并進(jìn)行擴(kuò)增，然后將擴(kuò)增產(chǎn)物滴加到含有凍干細(xì)胞組分和生物蛋白的紙片上，激活凍干組分產(chǎn)生生化反應(yīng)，使紙片發(fā)生肉眼可見的顏色變化(黃→紫)，從而指示ZIKV的存在。ZIKV和登革熱病毒(Dengue)因臨床癥狀相似而很難辨別[15]，在該檢測平臺的幫助下，研究者可在3 h內(nèi)確定患者感染的病毒類型。如果檢測到ZIKV，第3步將樣品與凍干的CRISPR-Cas9混合。利用CRISPR-Cas9對PAM區(qū)域優(yōu)異的序列識別能力，該檢測平臺可精準(zhǔn)區(qū)分不同亞型的ZIKV。這種檢測系統(tǒng)能在現(xiàn)場準(zhǔn)確地進(jìn)行毒株特異性的診斷，可能對實(shí)時(shí)追蹤病毒流行病擴(kuò)散和制定遏制策略與治療計(jì)劃的國家和全球衛(wèi)生機(jī)構(gòu)非常有價(jià)值。

2 Cas13a在核酸檢測中的應(yīng)用

2016年6月，張鋒等[9]報(bào)道了一種Ⅱ類Ⅵ型CRISPR效應(yīng)蛋白Cas13a。Cas13a是一種在crRNA引導(dǎo)下與靶標(biāo)RNA特定位點(diǎn)結(jié)合并切割的核酸內(nèi)切酶。從結(jié)構(gòu)上看，Cas13a含有兩個(gè)負(fù)責(zé)切割靶標(biāo)單鏈RNA的HEPN結(jié)構(gòu)域。同年10月Doudna研究組[11]發(fā)現(xiàn)LeptotrichiabuccalisCas13a(LbuCas13a)不僅具有對靶標(biāo)RNA切割活性，而且還具有切割非靶標(biāo)RNA的活性，這種非特異性切割后來被稱為附屬切割[12]。利用這種附屬切割活性，該研究組將Cas13a用于RNA靶標(biāo)檢測，其檢出限約10 pmol/L。但是對大多數(shù)核酸的檢測方法，檢出限達(dá)到amol/L數(shù)量級才具有實(shí)際應(yīng)用價(jià)值[16]。2017年，張鋒課題組與 Collins合作[12]將LeptotrichiawadeiCas13a(LwCas13a)與重組酶聚合酶等溫?cái)U(kuò)增技術(shù)(Recombinase polymerase amplification，RPA)結(jié)合，開發(fā)了一個(gè)基于高特異性和靈敏性的酶解鎖報(bào)告探針(Specific High-Sensitivity Enzymatic Reporter UnLOCKing，SHERLOCK)的核酸檢測系統(tǒng)。在該檢測系統(tǒng)中(圖1)，靶標(biāo)核酸分子經(jīng)RPA和T7 RNA聚合酶轉(zhuǎn)錄擴(kuò)增后，激活LwCas13a的附屬切割活性，切割底物產(chǎn)生熒光信號。引入RPA顯著提高核酸檢測靈敏度，SHERLOCK對靶標(biāo)的檢出限低至2×103copies/mL(3.2 amol/L)，實(shí)現(xiàn)了單個(gè)核酸分子的檢測。該研究組還構(gòu)建出一種基于SHERLOCK試紙的快速、低成本的便攜式核酸診斷工具，利用這套系統(tǒng)成功識別出腫瘤特有的突變，鑒定了人類基因組中的多個(gè)單核苷酸多態(tài)性。這項(xiàng)重磅研究成果再次證實(shí)了CRISPR/Cas核酸診斷領(lǐng)域的應(yīng)用價(jià)值，有望對全球公共衛(wèi)生產(chǎn)生革命性的影響。自然界中核糖核酸酶(RNase)廣泛存在且十分穩(wěn)定，而SHERLOCK系統(tǒng)的關(guān)鍵組分均為RNA，因此該系統(tǒng)對操作環(huán)境要求較為苛刻。

3 Cas12a在核酸檢測中的應(yīng)用

2015年，張鋒等[17]發(fā)現(xiàn)一種Ⅱ類Ⅴ型CRISPR效應(yīng)蛋白Cas12a。Cas12a可在crRNA引導(dǎo)下與靶標(biāo)雙鏈DNA結(jié)合并切割基因組DNA，該crRNA的長度為42～44個(gè)堿基，與Cas9系統(tǒng)相比簡化了實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)。2018年，Doudna等[13]發(fā)現(xiàn)當(dāng)Cas12a特異性結(jié)合和切割目標(biāo)dsDNA后，具有類似Cas13a的非特異性切割單鏈DNA(ssDNA)的活性，并利用Cas12a的該附屬切割活性開發(fā)了一個(gè)基于DNA內(nèi)切酶靶向CRISPR非特異性的報(bào)告探針(DNA Endonuclease Targeted CRISPR Trans Reporter，DETECTR)的核酸檢測系統(tǒng)。與SHERLOCK類似，DETECTR將RPA與Cas12a相結(jié)合，擴(kuò)增產(chǎn)物激活Cas12a的附屬切割活性，切割底物產(chǎn)生熒光信號(圖2)。DETECTR能夠從感染多種不同人乳頭瘤病毒(Human papilloma virus，HPV)亞型的樣本中準(zhǔn)確檢測出高風(fēng)險(xiǎn)的HPV16和HPV18，在單核苷酸多態(tài)性分析、癌癥篩查、細(xì)菌和病毒感染檢測以及耐藥性篩查等方面有廣泛的應(yīng)用潛力。DETECTR系統(tǒng)中靶標(biāo)及底物均為DNA，其穩(wěn)定性較強(qiáng)，因此該系統(tǒng)對實(shí)驗(yàn)操作環(huán)境要求低，可應(yīng)用于現(xiàn)場的快速檢測。

圖1 用于檢測單分子水平核酸的診斷平臺-SHERLOCK[12]Fig.1 Single-molecule nucleic acid detection based on SHERLOCK[12]

4 Cas13/Cas12a在多靶標(biāo)檢測中的應(yīng)用

圖3 基于Ⅱ類CRISPR-Cas蛋白附屬切割活性的SHERLOCK v2系統(tǒng)[18]Fig.3 Multiplexed detection of SHERLOCK based on the orthogonal collateral activity of type Ⅱ Cas proteins[18]

SHERLOCK和DETECTR系統(tǒng)雖可快速、靈敏地檢測核酸分子，但存在一些局限，例如一次只能檢測一種核酸、依賴于熒光設(shè)備讀取信號等。針對以上缺點(diǎn)，張鋒等[18]發(fā)展了第二代SHERLOCK(SHERLOCK v2)系統(tǒng)，在保持快速、便捷和低成本等優(yōu)點(diǎn)的基礎(chǔ)上，實(shí)現(xiàn)了一次分析同時(shí)檢測4種不同靶標(biāo)。SHERLOCK v2由3種底物特異性的Cas13蛋白(LwaCas13a，PsmCas13b和CcaCas13b)和Cas12a組成，每種核酸靶標(biāo)的擴(kuò)增產(chǎn)物激活對應(yīng)Cas蛋白切割其特異性底物，產(chǎn)生多色熒光信號，以實(shí)現(xiàn)對不同核酸靶標(biāo)的熒光響應(yīng)(圖3)。ZIKV和Dengue因臨床癥狀相似而很難辨別[15]，使用SHERLOCK v2能夠在單一反應(yīng)中同時(shí)檢測出樣本是否含有ZIKV或Dengue病毒。除檢測靶標(biāo)數(shù)量的提升，SHERLOCK v2還引入CRISPR相關(guān)酶(Csm6)進(jìn)一步放大檢測信號，使得該工具的靈敏度較最初版本提高了3.5倍，這對檢測血液樣本中循環(huán)腫瘤DNA等低豐度的靶標(biāo)尤為重要。該研究組進(jìn)一步開發(fā)出基于SHERLOCK v2系統(tǒng)的試紙條，在無需復(fù)雜儀器輔助的情況下，實(shí)現(xiàn)了肉眼觀察檢測結(jié)果。經(jīng)過改進(jìn)的SHERLOCK v2不僅實(shí)現(xiàn)了多靶標(biāo)同時(shí)檢測，而且提供了更高的靈敏度和更便利的檢測結(jié)果讀取方式。

5 總結(jié)及展望

SHERLOCK和DETECTR系統(tǒng)在核酸診斷方面卓越的表現(xiàn)，證明了CRISPR/Cas技術(shù)不僅具有強(qiáng)大的基因編輯能力，而且在分子診斷領(lǐng)域有重要的應(yīng)用價(jià)值。目前，分子診斷一般包括病原的分離、核酸的提取與擴(kuò)增、檢測結(jié)果分析等過程，耗時(shí)長且對醫(yī)療設(shè)備和操作人員的專業(yè)水準(zhǔn)要求很高[19-20]。SHERLOCK和DETECTR系統(tǒng)不需依賴貴重設(shè)備和醫(yī)護(hù)人員經(jīng)驗(yàn)，將給缺乏先進(jìn)設(shè)備和訓(xùn)練有素人員的發(fā)展中國家?guī)砗艽蟊憷?，具有影響人類健康和全社會的真正潛力。雖然SHERLOCK和DETECTR已展現(xiàn)出它們在診斷中的強(qiáng)大力量，但在進(jìn)入臨床使用前，尚需進(jìn)一步研究以確保診斷的準(zhǔn)確性。此外，CRISPR/Cas技術(shù)在小分子和蛋白質(zhì)等生物大分子檢測方面的應(yīng)用也亟待開發(fā)。隨著對Cas蛋白研究的深入以及更多Cas蛋白被發(fā)現(xiàn)，CRISPR/Cas系統(tǒng)將在POCT(point-of-care testing)領(lǐng)域有著巨大的應(yīng)用前景。