徐 兵 ,馮兆光 ,劉 凱 ,李小東 *
(1.青州市花卉高科技博覽園管理委員會(huì),山東 青州262500;2.濟(jì)南文旅花木開(kāi)發(fā)有限公司,山東 濟(jì)南 250100)
‘青州仙子’蘭(Cymbidium ‘Qingzhou Xianzi’),是以國(guó)蘭品種企劍白墨為母本、大花蕙蘭品種金為父本,經(jīng)過(guò)雜交選育的品種,2014年培育成功,2016年通過(guò)專家審定,認(rèn)定為山東省林木良種,并大量生產(chǎn)推廣。其株型直立緊湊,葉形飄逸,著花可達(dá)15朵以上,花徑6.3 cm,淺黃綠色,唇瓣微向后卷,帶清香??共⌒詮?qiáng),易栽培,適應(yīng)性廣。從試管苗移栽到開(kāi)花約需30個(gè)月,適合溫室養(yǎng)護(hù),在山東省溫室栽培不需要高山催花就能在春節(jié)期間開(kāi)花,花期長(zhǎng)達(dá)50 d,具有較強(qiáng)的觀賞價(jià)值,適合大面積推廣應(yīng)用。本研究以‘青州仙子’蘭側(cè)芽為材料,研究組織培養(yǎng)獲得再生苗的方法,建立再生體系,為實(shí)現(xiàn)工廠化生產(chǎn)提供技術(shù)參考。
供試材料為‘青州仙子’蘭的春生側(cè)芽,取材前以多菌靈灌根,并嚴(yán)格澆水方式,避免澆到新芽上。切取5~6 cm的側(cè)芽,切除根部,剝?nèi)ゲ糠秩~片,用洗衣粉水輕輕洗凈表面[1],在超凈工作臺(tái)內(nèi)用75%酒精浸泡30 s,再用0.1%的升汞浸泡,設(shè)置不同消毒時(shí)間 8 s,10 s,12 s,14 s,16 s,然后用無(wú)菌水洗 5次,每次5 min,剝?nèi)ネ鈱尤~片后,切除底部褐化部分,接種到誘導(dǎo)培養(yǎng)基中,一月后統(tǒng)計(jì)污染率、褐化率、成活率。
(1)原球莖誘導(dǎo)培養(yǎng)基:1#MS+6-BA 2.0 mg/L+NAA 0.2 mg/L+AC 0.2 g/L;2#MS+6-BA1.0mg/L+NAA0.1mg/L+AC0.2g/L;3#MS+6-BA 2.0 mg/L+NAA 0.2 mg/L+椰汁10%;
4#MS+6-BA 1.0 mg/L+NAA 0.1 mg/L+椰汁10%。
接種完成后分別置于光照和黑暗條件下培養(yǎng),比較褐化率、誘導(dǎo)率。
(2)原球莖增殖及成苗培養(yǎng)基:
將誘導(dǎo)培養(yǎng)獲得的類原球莖塊切成直徑2~3 mm的小塊,一般2個(gè)原球莖為一塊,接種于增殖及成苗培養(yǎng)基上。篩選培養(yǎng)基采用4因素3水平的L9(34)正交設(shè)計(jì)(表1),每個(gè)處理接種6瓶,每瓶接種5組原球莖,重復(fù)3次,60 d后統(tǒng)計(jì)原球莖增殖率及成苗率。
表1 原球莖增殖及成苗培養(yǎng)供試因素及水平
(3)壯苗培養(yǎng)基:
14#MS;
15#1/2MS;
16#1/2MS+NAA0.2mg/L;
17#1/2MS+AC0.5mg/L;
18#1/2MS+AC0.5mg/L+香蕉泥50g/L。
將增殖及成苗培養(yǎng)獲得的小苗 (高度3 cm左右)接種于壯苗培養(yǎng)基上,研究MS培養(yǎng)基含量、NAA、AC、香蕉泥在壯苗培養(yǎng)中的作用。每個(gè)處理接種3瓶,每瓶接種10棵小苗,重復(fù)3次,80 d后統(tǒng)計(jì)壯苗效果、7 cm以上苗的數(shù)量。
(4)生根培養(yǎng)基:
19#1/2MS+NAA 0.5 mg/L+AC 0.5 g/L+香蕉泥50 g/L;
20#1/2MS+NAA.5 mg/L+AC 1.0 g/L+香蕉泥50 g/L;
21#1/2MS+NAA 1.0 mg/L+AC 1.0 g/L+香蕉泥50 g/L。
將壯苗培養(yǎng)基中獲得的高度7 cm以上的組培苗切除原有根系,接種到生根培養(yǎng)基中,研究NAA、AC、香蕉泥相互租用對(duì)生根情況的影響,60 d后統(tǒng)計(jì)生根率。
上述培養(yǎng)基 pH5.8,瓊脂為 6 g/L,蔗糖 30 g,于121℃殺菌 20 min。
(5)培養(yǎng)條件:培養(yǎng)溫度 25℃±1℃,光照 12 h/d,光源由LED燈提供[2],光照強(qiáng)度1500 Lx。
消毒前對(duì)側(cè)芽嚴(yán)格進(jìn)行預(yù)處理對(duì)消毒效果影響很大,4 cm以下未展開(kāi)葉的側(cè)芽由于木質(zhì)化程度較低,易被消毒液殺死;7 cm以上展開(kāi)葉的側(cè)芽由于葉芯難以消毒徹底,一般污染率較高。5~6 cm未展開(kāi)葉的側(cè)芽已具有一定程度的木質(zhì)化,抗消毒能力強(qiáng),若無(wú)機(jī)械損傷,葉芯基本無(wú)菌,故消毒成功率較高。通過(guò)對(duì)消毒時(shí)間的比較,升汞消毒10 min,無(wú)論從污染率還是褐化率上來(lái)說(shuō),都相對(duì)較低,并且側(cè)芽變綠快,成功率較高,隨著消毒時(shí)間延長(zhǎng),側(cè)芽因褐化而死亡迅速增多,因此確定升汞最佳消毒時(shí)間為10 min(表2)。通過(guò)對(duì)比發(fā)現(xiàn),黑暗培養(yǎng)雖然在一定程度上能減輕褐化,但不利于芽體變綠,脫分化較慢。
表2 消毒時(shí)間對(duì)成活率的影響
將側(cè)芽接種到原球莖誘導(dǎo)培養(yǎng)基,7 d后開(kāi)始恢復(fù)生長(zhǎng),芯葉開(kāi)始變綠,隨后整個(gè)側(cè)芽逐漸變綠,并有原球莖分化生長(zhǎng)。BA、NAA濃度較高,則分化較快;BA、NAA濃度降低后,側(cè)芽膨大,分化較慢。AC 0.2 g/L在一定程度上能抑制褐化,但總體效果不如添加10%椰汁,使用MS+6-BA 2.0 mg/L+NAA 0.2 mg/L+椰汁10%,60 d分化率最高75%,幾乎不出現(xiàn)褐化(表3)。
表3 原球莖誘導(dǎo)培養(yǎng)結(jié)果
將誘導(dǎo)獲得的原球莖轉(zhuǎn)接到增殖及成苗培養(yǎng)基中,60 d轉(zhuǎn)接一次,原球莖最高增殖倍數(shù)為6.9倍,每組原球莖最高可平均再生1.4棵苗。無(wú)機(jī)鹽含量的增加可提高原球莖的增殖倍數(shù),BA/NAA比值增大,原球莖增殖倍數(shù)提高,BA/NAA比值達(dá)到20以上時(shí),褐化嚴(yán)重原球莖死亡較多,再生苗矮化。適當(dāng)添加AC可降低褐化率,增加成苗率,AC過(guò)高會(huì)降低原球莖增殖倍數(shù),相比之下AC 0.2 g/L既能達(dá)到防止褐化的效果,對(duì)原球莖增殖影響較小。對(duì)比之下最適宜原球莖增殖同時(shí)成苗的培養(yǎng)基為6#MS+6-BA 1.0 mg/L+NAA 0.1 mg/L+AC 0.2 g/L(表4),具有較高的增殖率和成苗率,苗壯,適宜進(jìn)一步壯苗生根。
表4 原球莖增殖及成苗培養(yǎng)結(jié)果
表5 壯苗培養(yǎng)結(jié)果
選取高度3 cm左右的小苗,接種到壯苗培養(yǎng)基中。15 d后開(kāi)始有可見(jiàn)根長(zhǎng)出,添加NAA的培養(yǎng)基生根快,并且30 d后生根數(shù)最多、根長(zhǎng)度最大,有白色根毛生長(zhǎng),苗生長(zhǎng)不足,不利于壯苗。培養(yǎng)基中無(wú)機(jī)鹽含量高容易導(dǎo)致原球莖增殖,MS比1/2MS培養(yǎng)基生長(zhǎng)更過(guò)的原球莖。添加AC,苗生長(zhǎng)快,可能與AC能吸收苗內(nèi)殘留的細(xì)胞分裂素有關(guān)[3],正是由于這方面的原因,AC可作為組培壯苗的有效添加物。添加香蕉泥,大約30 d才有根生長(zhǎng),壯苗效果好,苗粗壯,80 d后根數(shù)可達(dá)到2條,因此最佳壯苗培養(yǎng)基為18#1/2MS+AC 0.5 mg/L+香蕉泥 50 g/L(表 5)。
圖1 壯苗培養(yǎng)
表6 生根培養(yǎng)結(jié)果
選取7 cm以上的壯苗接種到生根培養(yǎng)基中,多數(shù)苗在15 d后開(kāi)始有可見(jiàn)根。通過(guò)前期研究認(rèn)為,添加香蕉泥對(duì)AC具有沉降作用,大部分活性炭會(huì)沉到瓶底,活性炭對(duì)NAA的吸附作用也比較明顯,但添加NAA 0.5 mg/L以上時(shí),幾乎所有的苗都能生根,但AC 0.5 g/L以下時(shí)NAA作用較明顯,根系生長(zhǎng)快、根多、過(guò)長(zhǎng)。NAA 1.0 mg/L、AC 1.0 g/L以上時(shí),生根條數(shù)、生根率變化不大,跟系不夠粗壯,90 d后在瓶?jī)?nèi)盤織交錯(cuò),不利于出瓶。從生根數(shù)、生根率、根的長(zhǎng)度等方面綜合考慮最佳生根培養(yǎng)基為20#1/2MS+NAA 0.5 mg/L+AC 1.0 g/L+香蕉泥 50 g/L(表 6)。
生根培養(yǎng)90 d以上、苗高15 cm以上時(shí)要及時(shí)練苗移栽,否則可能會(huì)因營(yíng)養(yǎng)不足導(dǎo)致黃葉等。在散射光下(光照強(qiáng)度1500 Lx)培養(yǎng)20 d左右,開(kāi)蓋4 d后移栽。洗凈根部殘留的培養(yǎng)基,用干凈的小顆粒松樹(shù)皮包裹移栽到7 cm營(yíng)養(yǎng)缽中。把握好干透澆透的澆水原則,20 d內(nèi)光照控制在5000 Lx以下,每天噴霧2次,以后逐漸增加光照,進(jìn)行常規(guī)管理,成活率90%以上。
圖2 移栽
相對(duì)于大花蕙蘭和國(guó)蘭,雜交蘭具有花香、株高適中、價(jià)格合理、易養(yǎng)等優(yōu)勢(shì),近年來(lái)頗受消費(fèi)者歡迎,尤其是素花品種,更顯淡雅、更具清韻。本研究以青州自育品種‘青州仙子’蘭為實(shí)驗(yàn)材料,具體研究其工廠化快繁技術(shù),取得明顯成效。結(jié)果表明,選取5~6 cm未展開(kāi)葉的春生側(cè)芽消毒成活率最高,添加10%椰汁對(duì)原球莖的誘導(dǎo)具有明顯的促進(jìn)作用,添加活性炭對(duì)壯苗培養(yǎng)有利。研究表明,在‘青州仙子’蘭的工廠化快繁中,壯苗培養(yǎng)不可少,經(jīng)過(guò)壯苗培養(yǎng)的蘭苗,生根快、苗壯、成活率高,溫室養(yǎng)護(hù)過(guò)程中生長(zhǎng)快,抗病能力強(qiáng),催花質(zhì)量好。值得一提的是‘青州仙子’蘭以墨蘭為母本、但以原球莖方式增殖,這與墨蘭以根狀莖方式增殖有明顯不同,可見(jiàn)父本的增殖方式對(duì)其增殖方式影響力之大,影響蘭花增殖途徑的因素有待于進(jìn)一步研究。