徐 兵 ，馮兆光 ，劉 凱 ，李小東 *

(1.青州市花卉高科技博覽園管理委員會(huì)，山東 青州262500；2.濟(jì)南文旅花木開(kāi)發(fā)有限公司，山東 濟(jì)南 250100)

‘青州仙子’蘭（Cymbidium ‘Qingzhou Xianzi’），是以國(guó)蘭品種企劍白墨為母本、大花蕙蘭品種金為父本，經(jīng)過(guò)雜交選育的品種，2014年培育成功，2016年通過(guò)專家審定，認(rèn)定為山東省林木良種，并大量生產(chǎn)推廣。其株型直立緊湊，葉形飄逸，著花可達(dá)15朵以上，花徑6.3 cm，淺黃綠色，唇瓣微向后卷，帶清香?？共⌒詮?qiáng)，易栽培，適應(yīng)性廣。從試管苗移栽到開(kāi)花約需30個(gè)月，適合溫室養(yǎng)護(hù)，在山東省溫室栽培不需要高山催花就能在春節(jié)期間開(kāi)花，花期長(zhǎng)達(dá)50 d，具有較強(qiáng)的觀賞價(jià)值，適合大面積推廣應(yīng)用。本研究以‘青州仙子’蘭側(cè)芽為材料，研究組織培養(yǎng)獲得再生苗的方法，建立再生體系，為實(shí)現(xiàn)工廠化生產(chǎn)提供技術(shù)參考。

1 材料與方法

1.1 取材及消毒

供試材料為‘青州仙子’蘭的春生側(cè)芽，取材前以多菌靈灌根，并嚴(yán)格澆水方式，避免澆到新芽上。切取5～6 cm的側(cè)芽，切除根部，剝?nèi)ゲ糠秩~片，用洗衣粉水輕輕洗凈表面[1]，在超凈工作臺(tái)內(nèi)用75%酒精浸泡30 s，再用0.1%的升汞浸泡，設(shè)置不同消毒時(shí)間 8 s，10 s，12 s，14 s，16 s，然后用無(wú)菌水洗 5次，每次5 min，剝?nèi)ネ鈱尤~片后，切除底部褐化部分，接種到誘導(dǎo)培養(yǎng)基中，一月后統(tǒng)計(jì)污染率、褐化率、成活率。

1.2 供試培養(yǎng)基及培養(yǎng)條件

（1）原球莖誘導(dǎo)培養(yǎng)基：1#MS+6-BA 2.0 mg/L+NAA 0.2 mg/L+AC 0.2 g/L；2#MS+6-BA1.0mg/L+NAA0.1mg/L+AC0.2g/L；3#MS+6-BA 2.0 mg/L+NAA 0.2 mg/L+椰汁10%；

4#MS+6-BA 1.0 mg/L+NAA 0.1 mg/L+椰汁10%。

接種完成后分別置于光照和黑暗條件下培養(yǎng)，比較褐化率、誘導(dǎo)率。

（2）原球莖增殖及成苗培養(yǎng)基：

將誘導(dǎo)培養(yǎng)獲得的類原球莖塊切成直徑2～3 mm的小塊，一般2個(gè)原球莖為一塊，接種于增殖及成苗培養(yǎng)基上。篩選培養(yǎng)基采用4因素3水平的L9(34)正交設(shè)計(jì)（表1），每個(gè)處理接種6瓶，每瓶接種5組原球莖，重復(fù)3次，60 d后統(tǒng)計(jì)原球莖增殖率及成苗率。

表1 原球莖增殖及成苗培養(yǎng)供試因素及水平

（3）壯苗培養(yǎng)基：

14#MS；

15#1/2MS；

16#1/2MS+NAA0.2mg/L；

17#1/2MS+AC0.5mg/L；

18#1/2MS+AC0.5mg/L+香蕉泥50g/L。

將增殖及成苗培養(yǎng)獲得的小苗 (高度3 cm左右)接種于壯苗培養(yǎng)基上，研究MS培養(yǎng)基含量、NAA、AC、香蕉泥在壯苗培養(yǎng)中的作用。每個(gè)處理接種3瓶，每瓶接種10棵小苗，重復(fù)3次，80 d后統(tǒng)計(jì)壯苗效果、7 cm以上苗的數(shù)量。

（4）生根培養(yǎng)基：

19#1/2MS+NAA 0.5 mg/L+AC 0.5 g/L+香蕉泥50 g/L；

20#1/2MS+NAA.5 mg/L+AC 1.0 g/L+香蕉泥50 g/L；

21#1/2MS+NAA 1.0 mg/L+AC 1.0 g/L+香蕉泥50 g/L。

將壯苗培養(yǎng)基中獲得的高度7 cm以上的組培苗切除原有根系，接種到生根培養(yǎng)基中，研究NAA、AC、香蕉泥相互租用對(duì)生根情況的影響，60 d后統(tǒng)計(jì)生根率。

上述培養(yǎng)基 pH5.8，瓊脂為 6 g/L，蔗糖 30 g，于121℃殺菌 20 min。

（5）培養(yǎng)條件：培養(yǎng)溫度 25℃±1℃，光照 12 h/d，光源由LED燈提供[2]，光照強(qiáng)度1500 Lx。

2 結(jié)果與分析

2.1 最佳消毒時(shí)間

消毒前對(duì)側(cè)芽嚴(yán)格進(jìn)行預(yù)處理對(duì)消毒效果影響很大，4 cm以下未展開(kāi)葉的側(cè)芽由于木質(zhì)化程度較低，易被消毒液殺死；7 cm以上展開(kāi)葉的側(cè)芽由于葉芯難以消毒徹底，一般污染率較高。5～6 cm未展開(kāi)葉的側(cè)芽已具有一定程度的木質(zhì)化，抗消毒能力強(qiáng)，若無(wú)機(jī)械損傷，葉芯基本無(wú)菌，故消毒成功率較高。通過(guò)對(duì)消毒時(shí)間的比較，升汞消毒10 min，無(wú)論從污染率還是褐化率上來(lái)說(shuō)，都相對(duì)較低，并且側(cè)芽變綠快，成功率較高，隨著消毒時(shí)間延長(zhǎng)，側(cè)芽因褐化而死亡迅速增多，因此確定升汞最佳消毒時(shí)間為10 min（表2）。通過(guò)對(duì)比發(fā)現(xiàn)，黑暗培養(yǎng)雖然在一定程度上能減輕褐化，但不利于芽體變綠，脫分化較慢。

表2 消毒時(shí)間對(duì)成活率的影響

2.1 原球莖誘導(dǎo)培養(yǎng)

將側(cè)芽接種到原球莖誘導(dǎo)培養(yǎng)基，7 d后開(kāi)始恢復(fù)生長(zhǎng)，芯葉開(kāi)始變綠，隨后整個(gè)側(cè)芽逐漸變綠，并有原球莖分化生長(zhǎng)。BA、NAA濃度較高，則分化較快；BA、NAA濃度降低后，側(cè)芽膨大，分化較慢。AC 0.2 g/L在一定程度上能抑制褐化，但總體效果不如添加10%椰汁，使用MS+6-BA 2.0 mg/L+NAA 0.2 mg/L+椰汁10%，60 d分化率最高75%，幾乎不出現(xiàn)褐化（表3）。

表3 原球莖誘導(dǎo)培養(yǎng)結(jié)果

2.2 原球莖增殖及成苗培養(yǎng)

將誘導(dǎo)獲得的原球莖轉(zhuǎn)接到增殖及成苗培養(yǎng)基中，60 d轉(zhuǎn)接一次，原球莖最高增殖倍數(shù)為6.9倍，每組原球莖最高可平均再生1.4棵苗。無(wú)機(jī)鹽含量的增加可提高原球莖的增殖倍數(shù)，BA/NAA比值增大，原球莖增殖倍數(shù)提高，BA/NAA比值達(dá)到20以上時(shí)，褐化嚴(yán)重原球莖死亡較多，再生苗矮化。適當(dāng)添加AC可降低褐化率，增加成苗率，AC過(guò)高會(huì)降低原球莖增殖倍數(shù)，相比之下AC 0.2 g/L既能達(dá)到防止褐化的效果，對(duì)原球莖增殖影響較小。對(duì)比之下最適宜原球莖增殖同時(shí)成苗的培養(yǎng)基為6#MS+6-BA 1.0 mg/L+NAA 0.1 mg/L+AC 0.2 g/L（表4），具有較高的增殖率和成苗率，苗壯，適宜進(jìn)一步壯苗生根。

表4 原球莖增殖及成苗培養(yǎng)結(jié)果

2.3 壯苗培養(yǎng)

表5 壯苗培養(yǎng)結(jié)果

選取高度3 cm左右的小苗，接種到壯苗培養(yǎng)基中。15 d后開(kāi)始有可見(jiàn)根長(zhǎng)出，添加NAA的培養(yǎng)基生根快，并且30 d后生根數(shù)最多、根長(zhǎng)度最大，有白色根毛生長(zhǎng)，苗生長(zhǎng)不足，不利于壯苗。培養(yǎng)基中無(wú)機(jī)鹽含量高容易導(dǎo)致原球莖增殖，MS比1/2MS培養(yǎng)基生長(zhǎng)更過(guò)的原球莖。添加AC，苗生長(zhǎng)快，可能與AC能吸收苗內(nèi)殘留的細(xì)胞分裂素有關(guān)[3]，正是由于這方面的原因，AC可作為組培壯苗的有效添加物。添加香蕉泥，大約30 d才有根生長(zhǎng)，壯苗效果好，苗粗壯，80 d后根數(shù)可達(dá)到2條，因此最佳壯苗培養(yǎng)基為18#1/2MS+AC 0.5 mg/L+香蕉泥 50 g/L（表 5）。

圖1 壯苗培養(yǎng)

2.4 生根培養(yǎng)

表6 生根培養(yǎng)結(jié)果

選取7 cm以上的壯苗接種到生根培養(yǎng)基中，多數(shù)苗在15 d后開(kāi)始有可見(jiàn)根。通過(guò)前期研究認(rèn)為，添加香蕉泥對(duì)AC具有沉降作用，大部分活性炭會(huì)沉到瓶底，活性炭對(duì)NAA的吸附作用也比較明顯，但添加NAA 0.5 mg/L以上時(shí)，幾乎所有的苗都能生根，但AC 0.5 g/L以下時(shí)NAA作用較明顯，根系生長(zhǎng)快、根多、過(guò)長(zhǎng)。NAA 1.0 mg/L、AC 1.0 g/L以上時(shí)，生根條數(shù)、生根率變化不大，跟系不夠粗壯，90 d后在瓶?jī)?nèi)盤織交錯(cuò)，不利于出瓶。從生根數(shù)、生根率、根的長(zhǎng)度等方面綜合考慮最佳生根培養(yǎng)基為20#1/2MS+NAA 0.5 mg/L+AC 1.0 g/L+香蕉泥 50 g/L（表 6）。

2.5 煉苗移栽

生根培養(yǎng)90 d以上、苗高15 cm以上時(shí)要及時(shí)練苗移栽，否則可能會(huì)因營(yíng)養(yǎng)不足導(dǎo)致黃葉等。在散射光下（光照強(qiáng)度1500 Lx）培養(yǎng)20 d左右，開(kāi)蓋4 d后移栽。洗凈根部殘留的培養(yǎng)基，用干凈的小顆粒松樹(shù)皮包裹移栽到7 cm營(yíng)養(yǎng)缽中。把握好干透澆透的澆水原則，20 d內(nèi)光照控制在5000 Lx以下，每天噴霧2次，以后逐漸增加光照，進(jìn)行常規(guī)管理，成活率90%以上。

3 討論

圖2 移栽

相對(duì)于大花蕙蘭和國(guó)蘭，雜交蘭具有花香、株高適中、價(jià)格合理、易養(yǎng)等優(yōu)勢(shì)，近年來(lái)頗受消費(fèi)者歡迎，尤其是素花品種，更顯淡雅、更具清韻。本研究以青州自育品種‘青州仙子’蘭為實(shí)驗(yàn)材料，具體研究其工廠化快繁技術(shù)，取得明顯成效。結(jié)果表明，選取5～6 cm未展開(kāi)葉的春生側(cè)芽消毒成活率最高，添加10%椰汁對(duì)原球莖的誘導(dǎo)具有明顯的促進(jìn)作用，添加活性炭對(duì)壯苗培養(yǎng)有利。研究表明，在‘青州仙子’蘭的工廠化快繁中，壯苗培養(yǎng)不可少，經(jīng)過(guò)壯苗培養(yǎng)的蘭苗，生根快、苗壯、成活率高，溫室養(yǎng)護(hù)過(guò)程中生長(zhǎng)快，抗病能力強(qiáng)，催花質(zhì)量好。值得一提的是‘青州仙子’蘭以墨蘭為母本、但以原球莖方式增殖，這與墨蘭以根狀莖方式增殖有明顯不同，可見(jiàn)父本的增殖方式對(duì)其增殖方式影響力之大，影響蘭花增殖途徑的因素有待于進(jìn)一步研究。