高登峰，馮雁京，邢玉潔，牛小麟

克山病是一種原因未明的地方性心肌病，曾多次暴發(fā)流行，病死率較高［1］。硒是一種與人類健康息息相關(guān)的微量元素，與多種心血管疾病的發(fā)生、發(fā)展有關(guān)［2］。目前研究認(rèn)為體內(nèi)硒缺乏是克山病的重要發(fā)病原因之一，體內(nèi)硒水平較低會(huì)引起左心室收縮功能下降，最終導(dǎo)致心力衰竭，但低硒與心功能不全的關(guān)系及具體機(jī)制尚不清楚［3-5］。近年研究發(fā)現(xiàn)，微小RNA（miRNA）在心臟發(fā)育及心臟病發(fā)生發(fā)展過(guò)程中發(fā)揮著重要作用，其已成為心血管疾病研究領(lǐng)域的熱點(diǎn)［6-7］。但低硒所致克山病是否存在miRNA異常表達(dá)尚不清楚。本研究擬給予低硒飼料制備低硒大鼠模型，并分析心肌組織中miRNA的差異表達(dá)，為克山病的發(fā)病機(jī)制研究及防治提供參考。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 30只清潔級(jí)SD大鼠購(gòu)自西安交通大學(xué)動(dòng)物中心，3周齡，平均體質(zhì)量（75±10）g；按照隨機(jī)數(shù)字表法將大鼠分為對(duì)照組、低硒組、補(bǔ)硒組，每組10只。

1.2 方法 對(duì)照組大鼠給予AIN-93標(biāo)準(zhǔn)飼料（西安交通大學(xué)動(dòng)物中心提供）喂養(yǎng)，低硒組及補(bǔ)硒組大鼠均給予AIN-93 M（低硒）飼料（西安交通大學(xué)動(dòng)物中心提供）喂養(yǎng)；3組大鼠均喂養(yǎng)14周。之后補(bǔ)硒組大鼠給予亞硒酸鈉溶液（南京通盈生物科技有限公司生產(chǎn)）0.05 mg·kg-1·d-1灌胃，對(duì)照組和低硒組大鼠則給予相同劑量蒸餾水灌胃；3組大鼠均連續(xù)灌胃3周。入組17周后腹腔內(nèi)注射10%水合氯醛0.03 ml/100 g，麻醉滿意后處死3組大鼠，腹主動(dòng)脈留取全血，采用2，3-二氨基萘熒光法檢測(cè)血清硒水平；采用Triage 腦鈉肽（BNP）快速檢測(cè)試驗(yàn)檢測(cè)血漿BNP水平。

1.3 HE染色 留取3組大鼠部分心肌組織標(biāo)本，采用4%多聚甲醛固定24 h，石蠟包埋切片，厚度10 μm/片，之后按照HE標(biāo)準(zhǔn)流程進(jìn)行染色，光鏡下觀察心肌組織形態(tài)學(xué)結(jié)構(gòu)。

1.4 基因芯片測(cè)序 留取3組大鼠剩余心臟組織并迅速投入液氮20～30 s，置于-80 ℃環(huán)境下凍存，采用TRIzol試劑（Invitrogen公司生產(chǎn)）和Qiagen miRNeasy Mini Kit提取總RNA，使用NanoDrop 1000超微量分光光度計(jì)檢測(cè)RNA質(zhì)量及數(shù)量，并通過(guò)凝膠電泳確定RNA完整性。采用miRCURY?Hy3?/Hy5?標(biāo)記試劑盒（Exiqon，Vedbaek，Denmark）對(duì)miRNA進(jìn)行標(biāo)記，根據(jù)陣列說(shuō)明書(shū)在miRCURYTMLNA陣列（v.16.0）上對(duì)Hy3TM標(biāo)記的樣品進(jìn)行雜交。采用洗滌緩沖液試劑盒（Exiqon）洗滌，400 r/min離心5 min，最后干燥。采用AXON GenePix 4000B生物芯片掃描儀掃描切片，采用Significant Analysis of Microarrays（SAM）v4.0軟件挑選差異表達(dá)基因，差異表達(dá)基因篩選標(biāo)準(zhǔn)：錯(cuò)誤發(fā)現(xiàn)率（FDR）≤5%，F(xiàn)old change＞2倍。miRNA表達(dá)的聚類分析采用每張芯片平均值歸一化后的數(shù)據(jù)，采用Cluster 3.0軟件進(jìn)行聚類分析。

1.5 靶基因功能的顯著性分析 采用miRNA生物信息學(xué)分析軟件Targetscan和miRanda對(duì)芯片檢測(cè)的差異表達(dá)miRNA進(jìn)行靶基因預(yù)測(cè)，選擇兩種軟件交集的靶基因?；诨虮倔w（gene ontology，GO）數(shù)據(jù)庫(kù)，應(yīng)用DAVID軟件根據(jù)靶基因的功能富集程度進(jìn)行GO顯著性分析；基于KEEG數(shù)據(jù)庫(kù)，應(yīng)用DAVID軟件根據(jù)靶基因在信號(hào)通路中的富集程度進(jìn)行Pathway顯著性分析。

1.6 實(shí)時(shí)熒光定量聚合酶鏈反應(yīng)（PCR） 選取差異表達(dá)顯著的miRNA作為驗(yàn)證基因，設(shè)計(jì)miRNA特異性反反錄引物和PCR引物。取500 ng總RNA，利用miRNA特異性反轉(zhuǎn)錄引物和oligo-dT16在反轉(zhuǎn)錄酶作用下反轉(zhuǎn)錄合成cDNA。以U6為內(nèi)參，在冰上按照實(shí)時(shí)熒光定量PCR試劑盒SYBR Premix Ex TaqTMⅡ說(shuō)明書(shū)進(jìn)行反應(yīng)體系配制。反應(yīng)體系為20 μl：試劑盒中SYBR Premix Ex Taq 10 μl，cDNA 模板，引物 0.4 μmol/L，并使用RNase Free H2O溶解至20 μl。95 ℃預(yù)變性3 min，變性 95 ℃ 10 s、退火 67 ℃ 30 s、延伸 72 ℃ 30 s，共40個(gè)循環(huán)。采用2-ΔΔCT法計(jì)算miRNA相對(duì)表達(dá)量。

1.7 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 采用SPSS 17.0統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)處理，計(jì)量資料以（±s）表示，多組間比較采用單因素方差分析，組間兩兩比較采用q檢驗(yàn)，兩組間比較采用兩獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)。以P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 血清硒和血漿BNP水平 3組大鼠血清硒和血漿BNP水平比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）；低硒組和補(bǔ)硒組大鼠血清硒水平低于對(duì)照組，血漿BNP水平高于對(duì)照組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）；低硒組大鼠血清硒水平低于補(bǔ)硒組，血漿BNP水平高于補(bǔ)硒組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05，見(jiàn)表1）。

2.2 HE染色結(jié)果 對(duì)照組大鼠心肌組織結(jié)構(gòu)清晰，閏盤(pán)連接結(jié)構(gòu)良好，肌絲排列、肌走形均正常（見(jiàn)圖1A）。低硒組大鼠肌纖維腫脹、排列紊亂（見(jiàn)圖1B），心肌細(xì)胞壞死、細(xì)胞核固縮（見(jiàn)圖1C），部分肌纖維斷續(xù)（見(jiàn)圖1D），部分地方可見(jiàn)小的心肌壞死灶，且壞死灶周圍伴有炎性浸潤(rùn)（見(jiàn)圖1E）。補(bǔ)硒組大鼠心肌纖維較對(duì)照組輕度腫脹，但肌纖維排列基本整齊有序（見(jiàn)圖1F）。

2.3 miRNA表達(dá)差異及聚類分析 基因芯片測(cè)序結(jié)果顯示，3組大鼠共119個(gè)miRNA差異表達(dá)，共8種變化趨勢(shì)，其中低硒組較對(duì)照組上調(diào)、補(bǔ)硒組與對(duì)照組間無(wú)差異的miRNA共30個(gè)（見(jiàn)圖2趨勢(shì)1）；低硒組較對(duì)照組下調(diào)、補(bǔ)硒組與對(duì)照組間無(wú)差異的miRNA共10個(gè)（見(jiàn)圖2趨勢(shì)6），上述40個(gè)miRNA為硒敏感性miRNA。

2.4 靶基因功能的顯著性分析 GO功能富集分析結(jié)果顯示，上述40種差異表達(dá)miRNA靶基因功能主要富集于脂代謝、心臟發(fā)育、細(xì)胞黏附、血管發(fā)育、軸突導(dǎo)向、細(xì)胞遷移調(diào)控、輸尿管芽發(fā)育、跨膜受體蛋白酪氨酸激酶信號(hào)通路、細(xì)胞分化、有機(jī)氮化物反應(yīng)、棕色脂肪分化、髓系祖細(xì)胞分化、細(xì)胞-基質(zhì)黏附、細(xì)胞增殖調(diào)控、生物鐘節(jié)律，見(jiàn)圖3。靶基因投射的13條信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路為腎細(xì)胞癌、轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)、多巴胺能突觸、焦點(diǎn)黏附、Rap信號(hào)通路、脂代謝、PPAR信號(hào)通路、Ras信號(hào)通路、Oxytocin信號(hào)通路、長(zhǎng)期抑制、PI3K-Akt信號(hào)通路、MAPK信號(hào)通路、HTLV-1感染，見(jiàn)圖4。

表1 3組大鼠血清硒和血漿BNP水平比較（±s）Table 1 Comparison of serum selenium level and plasma BNP level in the three groups

表1 3組大鼠血清硒和血漿BNP水平比較（±s）Table 1 Comparison of serum selenium level and plasma BNP level in the three groups

注：BNP=腦鈉肽；與對(duì)照組比較，aP＜0.05；與低硒組比較，bP＜0.05

組別 只數(shù) 硒（mg/L） BNP（pg/ml）對(duì)照組 10 0.144±0.007 894.3±11.3低硒組 10 0.026±0.004a 1 436.4±121.7a補(bǔ)硒組 10 0.092±0.012ab 1 174.2±132.8ab F值 4.32 3.96 P值 0.02 0.03

2.5 實(shí)時(shí)熒光定量PCR結(jié)果 上述40個(gè)miRNA中表達(dá)上調(diào)最顯著的5個(gè)miRNA分別為miRNA-374、miRNA-16、miRNA-199a-5p、miRNA-195、miRNA-30e*，表達(dá)下調(diào)最顯著的3個(gè)miRNA分別為miRNA-3571、miRNA-675、miRNA-450a*。實(shí)時(shí)熒光定量PCR結(jié)果顯示，以對(duì)照組心肌組織miRNA為參照，補(bǔ)硒組大鼠心肌組織miRNA-374、miRNA-16、miRNA-199a-5p、miRNA-195、miRNA-30e*相對(duì)表達(dá)量低于低硒組，心肌組織miRNA-3571、miRNA-675、miRNA-450a*相對(duì)表達(dá)量高于低硒組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05，見(jiàn)表2）。

3 討論

克山病的病因迄今尚未完全明確，主要包括微生物地球化學(xué)病因和生物病因。目前，流行病學(xué)研究證實(shí)，地方性克山病幾乎全部發(fā)生在低硒地帶，該地區(qū)患者頭發(fā)和血液中的硒明顯低于非病區(qū)居民，故認(rèn)為克山病的發(fā)生與當(dāng)?shù)仫嬍持形厝狈τ嘘P(guān)，而口服亞硒酸鈉后患者病情得到明顯緩解，提示補(bǔ)硒能預(yù)防克山病的發(fā)生［3，8］。本研究采用低硒飼料喂養(yǎng)大鼠以構(gòu)建低硒模型，結(jié)果顯示，低硒組大鼠血清硒水平低于對(duì)照組和補(bǔ)硒組，提示低硒大鼠模型構(gòu)建成功。

近期一項(xiàng)前瞻性隊(duì)列研究結(jié)果顯示，血清硒基線水平與急性冠脈綜合征患者病死率呈負(fù)相關(guān)，且低硒是其獨(dú)立危險(xiǎn)因素［9］。動(dòng)物實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，低硒與心功能惡化及心肌肥厚有關(guān)，其水平可伴心臟組織中谷胱甘肽過(guò)氧化物酶（GPx）活性降低而下降［10］。本研究結(jié)果顯示，低硒組大鼠血漿BNP水平高于對(duì)照組和補(bǔ)硒組，補(bǔ)硒組大鼠血漿BNP水平高于對(duì)照組，提示低硒大鼠存在心功能損傷。

表2 低硒組和補(bǔ)硒組大鼠心肌組織表達(dá)最顯著的8種miRNA相對(duì)表達(dá)量比較（±s）Table 2 Comparison of relative expression quantity of 8 miRNA with the most significant differential expression in myocardium tissue between low-selenium group and selenium supplement group

表2 低硒組和補(bǔ)硒組大鼠心肌組織表達(dá)最顯著的8種miRNA相對(duì)表達(dá)量比較（±s）Table 2 Comparison of relative expression quantity of 8 miRNA with the most significant differential expression in myocardium tissue between low-selenium group and selenium supplement group

組別 只數(shù) miRNA-374 miRNA-16 miRNA-199a-5p miRNA-195 miRNA-30e*miRNA-3571 miRNA-675 miRNA-450a*低硒組 10 342.1±41.2 107.2±12.5 72.3±9.6 59.4±8.3 38.1±5.8 0.14±0.02 0.12±0.02 0.24±0.03補(bǔ)硒組 10 87.4±12.8 12.9±1.2 14.7±1.9 5.4±0.9 4.9±0.4 0.76±0.04 0.28±0.02 0.56±0.07 t值 10.31 8.24 9.02 5.42 4.12 3.92 3.65 5.21 P值 ＜0.01 ＜0.01 ＜0.01 0.01 0.02 0.03 0.03 0.01

圖1 HE染色結(jié)果Figure 1 HE staining results

圖2 3組大鼠miRNA變化趨勢(shì)圖Figure 2 miRNA change trends in the three groups

近年來(lái)，miRNA在心血管疾病領(lǐng)域的研究報(bào)道日益增多，其在高血壓、先天性心臟病、冠心病的發(fā)生發(fā)展中發(fā)揮著重要作用［8，11］。本研究通過(guò)基因芯片測(cè)序篩選出40個(gè)硒敏感性miRNA，包括30個(gè)表達(dá)上調(diào)的miRNA和10個(gè)表達(dá)下調(diào)的miRNA；進(jìn)一步行GO功能富集分析結(jié)果顯示，上述40種差異表達(dá)miRNA靶基因功能主要富集于脂代謝、心臟發(fā)育、細(xì)胞黏附、血管發(fā)育、軸突導(dǎo)向、細(xì)胞遷移調(diào)控、輸尿管芽發(fā)育、跨膜受體蛋白酪氨酸激酶信號(hào)通路、細(xì)胞分化、有機(jī)氮化物反應(yīng)、棕色脂肪分化、髓系祖細(xì)胞分化、細(xì)胞-基質(zhì)黏附、細(xì)胞增殖調(diào)控、生物鐘節(jié)律，且靶基因主要投射13條信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路。為了驗(yàn)證基因芯片測(cè)序結(jié)果，本研究選取8個(gè)表達(dá)顯著的miRNA，結(jié)果提示基因芯片測(cè)序結(jié)果與實(shí)時(shí)熒光定量PCR結(jié)果相一致。既往研究表明，miRNA在低硒所致克山病的發(fā)生發(fā)展中發(fā)揮著重要作用，其可能的作用機(jī)制為miRNA通過(guò)影響某種信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路而導(dǎo)致心臟結(jié)構(gòu)或功能異常，最終發(fā)展為心力衰竭［12］。

圖3 差異表達(dá)miRNA靶基因GO功能富集分析結(jié)果Figure 3 Gene ontology functional enrichment analysis results of target gene of miRNA with differential expression

圖4 靶基因投射的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路Figure 4 Target gene projected signal transduction pathways

綜上所述，低硒會(huì)導(dǎo)致大鼠心功能損傷，低硒大鼠心肌組織中存在多個(gè)差異表達(dá)的miRNA，主要涉及15種生物學(xué)功能和13條信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路，這些差異表達(dá)的miRNA可能參與克山病的發(fā)生發(fā)展。但本研究存在以下不足：（1）低硒大鼠模型并不能完全模擬和反映克山病的自然病程；（2）實(shí)驗(yàn)大鼠數(shù)量較少；（3）芯片基因篩選時(shí)采用了樣本混合方法，以節(jié)約成本，但可能降低研究結(jié)論的可靠性。

作者貢獻(xiàn)：高登峰、牛小麟進(jìn)行文章的構(gòu)思與設(shè)計(jì)，對(duì)文章整體負(fù)責(zé)，監(jiān)督管理；高登峰進(jìn)行研究的實(shí)施與可行性分析；馮雁京進(jìn)行數(shù)據(jù)收集、整理、分析；邢玉潔進(jìn)行結(jié)果分析與解釋；高登峰、馮雁京負(fù)責(zé)撰寫(xiě)論文。

本文無(wú)利益沖突。