張偉，宋小英，李蕓

熱休克蛋白（heat shock protein，HSP）是一類廣泛存在于哺乳動(dòng)物體內(nèi)的高度保守的熱應(yīng)激蛋白，按照蛋白大小分為HSP110、HSP90、HSP70、HSP60及小分子HSP。近年來(lái)越來(lái)越多研究證實(shí)，HSP70可維持鈣離子動(dòng)態(tài)平衡，減輕由鈣離子介導(dǎo)的心肌損傷［1-2］；此外，其還參與慢性心力衰竭（chronic heart failure，CHF）病理生理過(guò)程，且與CHF患者病情嚴(yán)重程度及遠(yuǎn)期預(yù)后有關(guān)［3-4］。HSP70-hom基因+2437 T/C位點(diǎn)屬于非同義突變，該位點(diǎn)突變可直接影響HSP70結(jié)構(gòu)、穩(wěn)定性并與多種疾病有關(guān)［5-6］。本研究旨在探討HSP70-hom基因+2437 T/C位點(diǎn)基因多態(tài)性與CHF患者預(yù)后的關(guān)系，為改善CHF患者預(yù)后提供參考依據(jù)。

1 對(duì)象與方法

1.1 研究對(duì)象 選取2013年1月—2015年7月延安大學(xué)附屬醫(yī)院東關(guān)分院心內(nèi)科收治的CHF患者366例，年齡18～80歲，均符合中華醫(yī)學(xué)會(huì)心血管病學(xué)分會(huì)制定的《中國(guó)心力衰竭診斷和治療指南2014》［7］中的CHF診斷標(biāo)準(zhǔn)；并排除合并心臟瓣膜病、先天性心臟病、心包疾病、心肌炎等其他類型心臟病者，合并嚴(yán)重肝腎疾病、惡性腫瘤、內(nèi)分泌系統(tǒng)疾病、血液系統(tǒng)疾病、風(fēng)濕免疫系統(tǒng)疾病、感染性疾病者，妊娠期婦女。按照隨訪結(jié)果將所有患者分為預(yù)后不良組90例和預(yù)后良好組276例。本研究經(jīng)延安大學(xué)附屬醫(yī)院東關(guān)分院倫理委員會(huì)審核批準(zhǔn)，所有患者及其家屬知情并簽署知情同意書(shū)。

1.2 觀察指標(biāo)

1.2.1 臨床特征 分析所有患者臨床特征，包括年齡、性別、體質(zhì)指數(shù)、有無(wú)冠心病、有無(wú)高血壓、有無(wú)糖尿病、吸煙（吸煙≥1支/d且至少吸煙3個(gè)月者定義為吸煙）、三酰甘油（triglyceride，TG）、低密度脂蛋白膽固醇（low density lipoprotein cholesterol，LDL-C）、腦鈉肽（brain natriuretic peptide，BNP）、紐約心臟病協(xié)會(huì)（NYHA）分級(jí)。所有患者入院后采用Philips公司生產(chǎn)的Elite型多普勒彩色超聲心動(dòng)圖檢測(cè)左心室舒張末期內(nèi)徑（left ventricular end diastolic diameter，LVEDD）、右心室舒張末期內(nèi)徑（right ventricular end diastolic diameter，RVEDD）及左心室射血分?jǐn)?shù)（1eft ventrieular ejection fraction，LVEF）。

1.2.2 血清HSP70水平 采集所有患者清晨空腹外周靜脈血并置于肝素抗凝的無(wú)菌聚丙烯試管中，3 000 r/min離心5 min（離心半徑13.5 cm），留取上清液并置于-20 ℃冰箱中保存待測(cè)，采用酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)（ELISA）檢測(cè)血清HSP70水平，試劑盒購(gòu)自美國(guó)R&D公司，并嚴(yán)格按照試劑盒說(shuō)明書(shū)進(jìn)行操作。

1.2.3 基因多態(tài)性 基因多態(tài)性檢測(cè)方法如下：（1）DNA提?。翰杉颊咔宄靠崭雇庵莒o脈血，采用DNA提取試劑盒〔天根生化科技（北京）有限公司生產(chǎn)〕提取全血基因組DNA；（2）聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（PCR）擴(kuò)增：PCR反應(yīng)體系主要包括上游引物（上游引物序列：5′-GGACAAGTCTGAGAAGGTACAG-3′）和下游引物（下游引物序列：5′-GTAACTTAGATTCAGGTCTGG-3′）各 1 μl、dNTP混合物 2 μl、Taq DNA聚合酶0.25 μl、模板 DNA 1 μl、10×Buffer 2.5 μl。反應(yīng)條件：95 ℃預(yù)變性4 min，然后按照變性95 ℃ 20 s、退火60 ℃ 30 s、延長(zhǎng)72 ℃ 50 s的順序循環(huán)30個(gè)周期，最后72 ℃延長(zhǎng)3 min；（3）酶切：取0.5 μl延伸產(chǎn)物，采用限制性內(nèi)切酶NcoⅠ進(jìn)行酶切，酶切體系包括 PCR 產(chǎn)物 17 μl、10×Buffer 2 μl、內(nèi)切酶 1 μl，反應(yīng)條件為37 ℃ 16 h，然后于65 ℃下酶切10 min終止反應(yīng)；（4）基因型判讀：取酶切產(chǎn)物進(jìn)行電泳，其中僅有1條878 bp電泳帶為C/C基因型，有2條長(zhǎng)度分別為327、551 bp電泳帶為T/T基因型，有3條長(zhǎng)度分別為327、551、878 bp電泳帶為T/C基因型，HSP70-hom基因+2437 T/C位點(diǎn)聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)-限制性片段長(zhǎng)度多態(tài)性（PCR-RFLP）電泳圖見(jiàn)圖1。

1.3 隨訪 所有患者出院后1個(gè)月內(nèi)門診隨訪1次，之后每3個(gè)月門診或電話隨訪1次，至少隨訪2年。記錄所有患者隨訪期間心血管事件發(fā)生情況，包括心源性死亡（心源性猝死及充血性心力衰竭導(dǎo)致的死亡）、心臟移植、惡性心律失常及CHF再住院。本研究將隨訪期間發(fā)生心血管事件定義為預(yù)后不良，未發(fā)生心血管事件定義為預(yù)后良好。

圖1 HSP70-hom基因+2437 T/C位點(diǎn)PCR-RFLP電泳圖Figure 1 PCR-RFLP electrophoresis for HSP70-hom gene +2437 T/C locus

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 采用SPSS 19.0統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)處理，符合正態(tài)分布的計(jì)量資料以（x ±s）表示，組間比較采用兩獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)；不符合正態(tài)分布的計(jì)量資料以M（QR）表示，組間比較采用Kruskal-Wallis檢驗(yàn)；計(jì)數(shù)資料分析采用χ2檢驗(yàn)；Hardy-Weinberg平衡定律采用吻合度檢驗(yàn)；CHF患者預(yù)后影響因素分析采用多因素Logistic回歸分析。以P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 Hardy-Weinberg遺傳平衡 本組患者中T/T基因型者236例（占64.5%）、T/C基因型者115例（占31.4%）、C/C基因型者15例（占4.1%），基因型分布符合Hardy-Weinberg遺傳平衡（χ2=0.044，P＞0.05）。

2.2 不同基因型患者血清HSP70水平比較 T/T基因型患者血清HSP70水平為12.4（3.6）μg/L，T/C基因型患者為12.3（3.4）μg/L，C/C基因型患者為11.0（3.1）μg/L；不同基因型患者血清HSP70水平比較，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（u=1.329，P＞0.05）。

2.3 不同預(yù)后患者臨床特征比較 預(yù)后良好組和預(yù)后不良組患者男性比例、體質(zhì)指數(shù)、冠心病發(fā)生率、高血壓發(fā)生率、糖尿病發(fā)生率、吸煙率、TG、LDL-C比較，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）；預(yù)后不良組患者年齡大于預(yù)后良好組，BNP、NYHA分級(jí)Ⅲ～Ⅳ級(jí)者所占比例及LVEF高于預(yù)后良好組，LVEDD、RVEDD長(zhǎng)于預(yù)后良好組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05，見(jiàn)表1）。

2.4 不同預(yù)后患者基因型及等位基因比較 預(yù)后良好組和預(yù)后不良組患者基因型比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）；而等位基因分布頻率比較，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05，見(jiàn)表2）。

2.5 CHF患者預(yù)后影響因素分析 將表1～2中有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異的指標(biāo)作為自變量，將預(yù)后作為因變量（變量賦值見(jiàn)表3）進(jìn)行多因素Logistic回歸分析，結(jié)果顯示，BNP、RVEDD、LVEF及基因型是CHF患者預(yù)后的獨(dú)立影響因素（P＜0.05，見(jiàn)表4）。

表1 不同預(yù)后患者臨床特征比較Table 1 Comparison of clinical features in patients with different prognosis

表2 不同預(yù)后患者基因型和等位基因分布頻率比較〔n（%）〕Table 2 Comparison of genotypes and allelic frequency in patients with different prognosis

表3 變量賦值Table 3 Variable assignment

表4 CHF患者預(yù)后影響因素的多因素Logistic回歸分析Table 4 Multivariate Logistic regression analysis on influencing factors of prognosis in patients with CHF

3 討論

HSP家族最重要的生物學(xué)功能是在各種應(yīng)激狀態(tài)下維持細(xì)胞自身穩(wěn)定，故被認(rèn)為是細(xì)胞損傷的保護(hù)因素。近年來(lái)不斷有研究發(fā)現(xiàn)，多個(gè)HSP家族成員均參與了CHF的發(fā)生發(fā)展過(guò)程，其中HSP70關(guān)注較多［3-4，8］。既往有研究顯示，急性心力衰竭（acute heart failure，AHF）患者血清HSP70水平明顯升高，分析原因可能與壞死的心肌細(xì)胞釋放大量HSP70入血及機(jī)體啟動(dòng)應(yīng)激保護(hù)機(jī)制有關(guān)［9］；而CHF患者血清HSP70水平明顯降低，分析原因可能為心力衰竭患者心肌細(xì)胞功能減退，長(zhǎng)期慢性炎性反應(yīng)可抑制HSP70表達(dá)，且血清HSP70水平與年齡、CHF病程呈負(fù)相關(guān)［3］。但也有研究結(jié)果顯示，HSP70水平與CHF嚴(yán)重程度呈正相關(guān)，病情越重則HSP70水平越高［10］。筆者分析研究結(jié)果產(chǎn)生不同的原因可能與納入的CHF患者病程長(zhǎng)短有關(guān)，病程短者HSP70水平趨近于AHF患者。

人類HSP70基因位于6p21.3，是一種高度保守基因，由HSP70-1、HSP70-2、HSP-hom組成。HSP70-hom基因+2437 T/C位點(diǎn)是目前研究最多的單核苷酸多態(tài)性位點(diǎn)之一，該位點(diǎn)的T→C突變是一種非同義突變，可將HSP70肽鏈中的一個(gè)蛋氨酸替換為蘇氨酸，進(jìn)而直接影響HSP70的結(jié)構(gòu)及穩(wěn)定性［5-6］。本研究結(jié)果顯示，本組患者基因型分布符合Hardy-Weinberg遺傳平衡，具有群體代表性；且不同基因型患者血清HSP70水平間無(wú)差異，提示HSP70-hom基因+2437 T/C位點(diǎn)基因多態(tài)性發(fā)揮生物學(xué)功能與HSP70水平無(wú)關(guān)，可能與HSP70蛋白自身結(jié)構(gòu)及穩(wěn)定性有關(guān)；但本研究中C/C基因型患者例數(shù)較少，故不能排除檢驗(yàn)效能不足。

另外，不同地區(qū)、不同種族人群基因型和等位基因分布頻率間具有明顯差異。既往有關(guān)西方人群HSP70-hom基因+2437 T/C位點(diǎn)基因多態(tài)性的研究顯示，突變純合子基因型頻率為5%～20%［11-12］；而我國(guó)漢族健康人群突變純合子基因型頻率為1%～5%［5-6，13-14］，本研究結(jié)果與之相一致。近年來(lái)國(guó)內(nèi)外研究相繼發(fā)現(xiàn)，HSP70-hom基因+2437 T/C位點(diǎn)基因多態(tài)性與腦梗死、冠心病及多種腫瘤發(fā)生有關(guān)［5-6，13，15］。本研究旨在探討HSP70-hom基因+2437 T/C位點(diǎn)基因多態(tài)性與CHF患者預(yù)后的關(guān)系，結(jié)果顯示，BNP、RVEDD、LVEF及基因型是CHF患者預(yù)后的獨(dú)立影響因素。

綜上所述，HSP70-hom基因+2437 T/C位點(diǎn)基因多態(tài)性與CHF患者預(yù)后有關(guān)，C/C基因型可能增加CHF患者預(yù)后不良發(fā)生風(fēng)險(xiǎn)。但本研究為單中心研究，樣本量較小，且C/C基因型患者例數(shù)較少，故研究結(jié)果存在一定偏倚，仍需進(jìn)一步研究證實(shí)。

作者貢獻(xiàn)：張偉進(jìn)行文章的構(gòu)思與設(shè)計(jì)、研究的實(shí)施與可行性分析，數(shù)據(jù)收集、整理、分析，負(fù)責(zé)撰寫(xiě)論文；宋小英進(jìn)行文章的質(zhì)量控制及審校；李蕓負(fù)責(zé)結(jié)果分析與解釋，并對(duì)文章整體負(fù)責(zé)，監(jiān)督管理。

本文無(wú)利益沖突。