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(1.金華職業(yè)技術(shù)學(xué)院，浙江 金華 321000；2.金華市農(nóng)業(yè)科學(xué)研究院，浙江 金華 321000)

0 引言

細(xì)胞培養(yǎng)是現(xiàn)代生物學(xué)研究中應(yīng)用最為廣泛的技術(shù)，成纖維細(xì)胞具有易于培養(yǎng)，增殖快，形態(tài)和遺傳性能穩(wěn)定，可長(zhǎng)期、完整、大量地保存生物體遺傳信息的特點(diǎn)[1]。目前，成纖維細(xì)胞被廣泛用于生產(chǎn)體細(xì)胞克隆豬、轉(zhuǎn)基因豬以及制作豬誘導(dǎo)多功能性干細(xì)胞。成纖維細(xì)胞的體外培養(yǎng)多應(yīng)用異體血清，除了非同源外，在異體血清應(yīng)用的同時(shí),也造成了自體血清的浪費(fèi)。試驗(yàn)以金華豬耳緣組織成纖維細(xì)胞為研究對(duì)象，探討用不同濃度仔豬血清培養(yǎng)成纖維細(xì)胞，觀察金華豬耳緣組織成纖維細(xì)胞在3種不同仔豬血清濃度培養(yǎng)基中的生長(zhǎng)情況，為仔豬血清在細(xì)胞培養(yǎng)中的應(yīng)用提供一定的實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料

1～3月齡金華豬仔豬耳緣組織

1.2 主要試劑和儀器

DMEM(Hyclone)，25 mL細(xì)胞培養(yǎng)瓶(Fisher)，血球細(xì)胞計(jì)數(shù)器(上海申工)，仔豬血清(自備)，青霉素、鏈霉素混合液(Hyclone)，0.25%胰蛋白酶溶液(Hyclone)， PBS液(Hyclone),CKX41倒置顯微鏡(OLYMPAS)，311型二氧化碳培箱(Thermo)，酶標(biāo)儀(伯樂(lè))。

1.3 實(shí)驗(yàn)方法

1.3.1 材料

選1～3月齡的金華豬仔豬，在豬耳緣處選擇血管較少部位刮毛，無(wú)菌剪取一小部分組織，將組織塊放入含250IU/mL雙抗的PBS中，帶回實(shí)驗(yàn)室。

1.3.2 處理

在超凈臺(tái)中將豬耳組織塊用75%酒精浸泡30～60 s，切取耳緣組織塊約0.5 cm×0.5 cm大小，把皮膚上的毛再次刮干凈放入無(wú)菌培養(yǎng)皿，再用雙抗PBS溶液洗滌3～5次。用眼科剪刀反復(fù)剪切，剪成1 mm3大小的小塊，用雙抗PBS洗滌3次，最后1次棄去上清液，沉淀的組織備用。

1.3.3 原代培養(yǎng)

采用組織塊貼壁培養(yǎng)法，將組織塊貼于25 mL細(xì)胞培養(yǎng)瓶中，每小塊間距約 0.3 cm，每瓶接種25～30塊。翻轉(zhuǎn)培養(yǎng)瓶，使有組織塊的一面向上,然后在細(xì)胞培養(yǎng)瓶?jī)?nèi)分別加含5%、10%、15%仔豬血清的細(xì)胞培養(yǎng)液。將有組織塊的一面向上放入培養(yǎng)箱，靜置4 h后，輕輕將培養(yǎng)瓶翻轉(zhuǎn)過(guò)來(lái)，使培養(yǎng)液浸沒(méi)組織塊，然后放入CO2培養(yǎng)箱，5% CO2、37℃、飽和濕度下靜置培養(yǎng)2 d后置于倒置顯微鏡下觀察組織塊遷移率同時(shí)更換培養(yǎng)液[2]。

1.3.4 傳代培養(yǎng)

當(dāng)培養(yǎng)細(xì)胞匯合達(dá)80%～90%時(shí)，進(jìn)行細(xì)胞傳代。吸除培養(yǎng)瓶中的培養(yǎng)液，用PBS清洗2次后，再加入含0.25%胰蛋白酶的D-Hanks液，37℃溫度下消化培養(yǎng)瓶中的細(xì)胞，在顯微鏡下看到大部分成纖維細(xì)胞脫壁，立即加入完全培養(yǎng)液終止消化，吹打細(xì)胞，使之分散。以1 000 r/min，離心5 min，棄上清， 再加入5 mL培養(yǎng)液吹打重懸細(xì)胞，再次以1 000 r/min ，離心5 min，棄上清液，以 2 mL培養(yǎng)液吹打重懸浮細(xì)胞，使用血球計(jì)數(shù)板用0.4%臺(tái)盼藍(lán)染液進(jìn)行活細(xì)胞計(jì)數(shù)，使細(xì)胞密度為 2×105個(gè)/mL，隨后，接入新的培養(yǎng)瓶中，置于CO2培養(yǎng)箱中繼續(xù)培養(yǎng)。

1.4 MTT法檢測(cè)

用含不同濃度仔豬血清培養(yǎng)基配成單細(xì)胞懸液，在96孔板上每孔加入100 μL，細(xì)胞濃度為1×104/mL，每組7孔，培養(yǎng)2 d后，每孔加入MTT溶液(5g/L)20 μL，繼續(xù)培養(yǎng)4 h，輕輕吸棄上清液。每孔加入150 μL二甲基亞砜(DMSO)，振蕩10 min，使結(jié)晶物充分溶解。選擇波長(zhǎng)490nm，用酶標(biāo)儀測(cè)定各孔光吸收值(A值)[3]。

1.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)以均值±標(biāo)準(zhǔn)誤表示，用Graphpad prism5 統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行單因素方差分析，不同組別數(shù)據(jù)間比較采用t檢驗(yàn)。

2 結(jié)果

2.1 不同仔豬血清濃度培養(yǎng)情況觀察

金華豬耳緣組織塊培養(yǎng)用仔豬血清濃度為10%與15%時(shí)，培養(yǎng)3～4 d倒置顯微鏡下可見(jiàn)單個(gè)細(xì)胞沿組織塊周?chē)坞x出來(lái)(圖1)，生長(zhǎng)狀態(tài)好，培養(yǎng)8 d大量細(xì)胞從組織塊遷移出來(lái)(圖2)，培養(yǎng)12 d可以長(zhǎng)滿培養(yǎng)瓶底(圖3)。仔豬血清濃度為5%時(shí)，培養(yǎng)到10 d后才見(jiàn)少量細(xì)胞沿組織塊周?chē)莱?，?xì)胞生長(zhǎng)緩慢，21 d左右才鋪滿培養(yǎng)瓶底。細(xì)胞傳代2～3次后，即可得到純化的成纖維細(xì)胞(圖4)，細(xì)胞呈梭形、三角形等，為典型的成纖維形態(tài)，胞質(zhì)近中央處有橢圓形胞核，成群細(xì)胞呈現(xiàn)束狀、漩渦狀等走勢(shì)。

圖1 仔豬血清濃度為10%培養(yǎng)3 d組織塊有少量細(xì)胞游離出來(lái)(100×)

圖2 仔豬血清濃度為10%培養(yǎng)8 d組織塊有大量細(xì)胞遷移出來(lái)(100×)

圖3 仔豬血清濃度為10%培養(yǎng)12 d組織塊細(xì)胞長(zhǎng)滿培養(yǎng)瓶底(200×)

圖4 仔豬血清濃度為10%傳代培養(yǎng)的第3代成纖維細(xì)胞(200×)

2.2 MTT檢測(cè)結(jié)果

金華豬耳緣組織成纖維細(xì)胞在含10%、15%仔豬血清的培養(yǎng)基中，細(xì)胞生長(zhǎng)均旺盛，活力較強(qiáng)，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)；在含5%仔豬血清的培養(yǎng)基中，細(xì)胞生長(zhǎng)緩慢，細(xì)胞活力明顯低于10%與15%仔豬血清培養(yǎng)基中的細(xì)胞，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。(如圖5所示)

圖5 不同仔豬血清濃度對(duì)成纖維細(xì)胞活性增殖影響

3 討論

動(dòng)物原代細(xì)胞培養(yǎng)主要分為2種方法，組織塊塊貼壁培養(yǎng)法和酶消化法[4]。本試驗(yàn)采用組織塊貼壁方法培養(yǎng)豬耳緣組織成纖維細(xì)胞。該方法簡(jiǎn)單，容易獲得成纖維細(xì)胞，但是純度不高，有上皮細(xì)胞的存在，根據(jù)不同類(lèi)型細(xì)胞對(duì)胰酶的敏感度不同進(jìn)行純化，培養(yǎng)2～3代后方可獲得較純的成纖維細(xì)胞。

培養(yǎng)基是體外細(xì)胞培養(yǎng)賴以生存和增殖的基礎(chǔ),由于血清中含有多種人工合成營(yíng)養(yǎng)液中所缺少的物質(zhì)，如生長(zhǎng)激素和生長(zhǎng)調(diào)節(jié)因子等，生長(zhǎng)激素能調(diào)節(jié)細(xì)胞的多種生命活動(dòng)，生長(zhǎng)因子能刺激細(xì)胞生長(zhǎng)、增殖分化[5]。細(xì)胞培養(yǎng)常用的是胎牛血清，為避免異源血清帶來(lái)的危險(xiǎn)損害和血源性傳播性疾病，故將仔豬血清應(yīng)用于豬耳緣組織成纖維細(xì)胞的培養(yǎng)。本試驗(yàn)采用Hyclone公司生產(chǎn)的DMEM培養(yǎng)液，分別加入含仔豬血清量為5%、10%、15%的培養(yǎng)基進(jìn)行原代培養(yǎng)，探討不同濃度的仔豬血清對(duì)金華豬耳組織成纖維細(xì)胞體外培養(yǎng)的影響。結(jié)果表明，仔豬血清濃度在10%、15%時(shí)即可滿足成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)的營(yíng)養(yǎng)需要，10%、15% 的仔豬血清濃度對(duì)細(xì)胞影響的差異并不顯著，所以采用含10%的仔豬血清濃度培養(yǎng)基培養(yǎng)金華豬耳緣組織成纖維細(xì)胞，即可滿足細(xì)胞生長(zhǎng)的需要，又可節(jié)省血清用量。仔豬血清濃度為5%時(shí)，血清不能滿足細(xì)胞生長(zhǎng)需要，細(xì)胞生長(zhǎng)速度較慢，細(xì)胞活力明顯低于10%與15%仔豬血清培養(yǎng)基中的細(xì)胞。綜上所述，仔豬血清濃度對(duì)金華豬耳緣組織成纖維細(xì)胞培養(yǎng)影響比較明顯，仔豬血清濃度為10%、15%時(shí)，二者對(duì)細(xì)胞培養(yǎng)狀況的影響差異不顯著(P>0.05)，二者與仔豬血清濃度為5%比較時(shí)差異顯著(P<0.05)，提示不同仔豬血清濃度的培養(yǎng)體系在對(duì)體外培養(yǎng)金華豬耳緣組織成纖維細(xì)胞有著特殊的影響。這與課題組早期實(shí)驗(yàn)采用不同胎牛血清濃度對(duì)金華豬耳組織成纖維細(xì)胞體外生長(zhǎng)的影響，屠平光等[6]結(jié)論一致，說(shuō)明金華豬耳組織成纖維細(xì)胞培養(yǎng)不管用異體血清還是自體血清，最適培養(yǎng)血清濃度均為10%。

本試驗(yàn)研究表明，用含10%濃度仔豬血清的DMEM培養(yǎng)基，培養(yǎng)金華豬耳組織成纖維細(xì)胞，可以滿足細(xì)胞生長(zhǎng)活性和增殖能力的要求，為仔豬血清在成纖維細(xì)胞培養(yǎng)中的應(yīng)用提供一定的實(shí)驗(yàn)依據(jù)。