汪城墻，李洪興，徐麗麗，沈煜，侯進(jìn)，鮑曉明

1 齊魯工業(yè)大學(xué) 生物工程學(xué)院 山東省微生物工程重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，山東 濟(jì)南 250353

2 山東農(nóng)業(yè)大學(xué) 生命科學(xué)學(xué)院 山東省農(nóng)業(yè)微生物重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，山東 泰安 271018

3 山東大學(xué) 生命學(xué)院 微生物技術(shù)國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，山東 濟(jì)南 250100

以地球上儲(chǔ)量最豐富的可再生資源木質(zhì)纖維素生物質(zhì)為原料，生產(chǎn)環(huán)境友好的能源及化工化學(xué)品等生物基產(chǎn)品，能有效緩解石油等化石資源的消耗，降低對(duì)化石資源的依賴，對(duì)人類可持續(xù)發(fā)展有重要的積極意義。以秸稈類及相關(guān)工業(yè)棄物等生物質(zhì)資源為原料生產(chǎn)二代燃料乙醇是生物質(zhì)利用的有效途徑之一。木質(zhì)纖維素含有大量的六碳糖(主要是葡萄糖) 及五碳糖(主要是木糖和L-阿拉伯糖)，完全水解后得到的總糖含量與淀粉質(zhì)原料接近，而充分利用這些糖分是實(shí)現(xiàn)經(jīng)濟(jì)盈利二代燃料乙醇生產(chǎn)的重要因素[1-4]。釀酒酵母Saccharomyces cerevisiae是傳統(tǒng)的乙醇發(fā)酵微生物，具有利用己糖快速生長(zhǎng)、發(fā)酵能力強(qiáng)、乙醇產(chǎn)率高、對(duì)乙醇等抑制物耐受性高及食品級(jí)安全性等優(yōu)良生產(chǎn)性能。對(duì)多種糖分的高效共發(fā)酵是精準(zhǔn)構(gòu)制適于二代燃料乙醇生產(chǎn)釀酒酵母需要解決主要的瓶頸之一。利用代謝工程和合成生物學(xué)策略，包括本課題組在內(nèi)的全球科學(xué)家對(duì)二代燃料乙醇專用釀酒酵母的精準(zhǔn)構(gòu)制已持續(xù)研究了30余年，主要通過理性改造(強(qiáng)化或弱化) 有效分子元件及非理性定向進(jìn)化等措施，目前已極大地提高了釀酒酵母木糖/葡萄糖的共發(fā)酵能力，基本達(dá)到產(chǎn)業(yè)化要求[5-17]。其中，糖轉(zhuǎn)運(yùn)環(huán)節(jié)是近年來較為關(guān)注的有效分子元件理性改造節(jié)點(diǎn)，目前糖轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白已逐漸接近二代乙醇生產(chǎn)特種釀酒酵母所希望的糖轉(zhuǎn)運(yùn)理想狀態(tài)，即不同糖分各行其道、高效專一性的轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白各行其責(zé)，最大限度解除葡萄糖在轉(zhuǎn)運(yùn)環(huán)節(jié)對(duì)五碳糖轉(zhuǎn)運(yùn)的阻遏，提高糖醇轉(zhuǎn)化率，并揭示了部分重要的轉(zhuǎn)運(yùn)調(diào)控分子機(jī)制[18]。同時(shí)相對(duì)滯后的葡萄糖、木糖和L-阿拉伯糖3種糖共發(fā)酵的釀酒酵母代謝工程研究也取得了階段性結(jié)果[19]。本文綜述了近年來木糖和L-阿拉伯糖轉(zhuǎn)運(yùn)，及三糖共發(fā)酵的研究進(jìn)展，并分析釀酒酵母木糖代謝工程研究現(xiàn)狀，為在工業(yè)領(lǐng)域的實(shí)際應(yīng)用提供參考。

1 釀酒酵母戊糖轉(zhuǎn)運(yùn)的研究進(jìn)展

根據(jù)代謝工程理念，通過引入釀酒酵母缺乏的戊糖代謝上游途徑，可以賦予釀酒酵母利用木糖或(和) L-阿拉伯糖的能力，但效率往往不高，雖然提高下游代謝流量正向關(guān)聯(lián)戊糖的代謝效率[10,19-20]，但糖轉(zhuǎn)運(yùn)環(huán)節(jié)也必定是主要的限制因素[21]。一般地，釀酒酵母代謝工程菌通過內(nèi)源性葡萄糖轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白非特異性地執(zhí)行對(duì)木糖或(和)L-阿拉伯糖的跨膜運(yùn)輸，這一過程受到葡萄糖的強(qiáng)烈抑制，局限了戊糖的轉(zhuǎn)運(yùn)效率，從而降低了糖的共利用效率[22-28]。因此，提高糖轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白對(duì)戊糖的親和力，甚至專一性轉(zhuǎn)運(yùn)戊糖而不受葡萄糖的抑制，是急需在二代燃料乙醇專用釀酒酵母中建立的特定性能。

1.1 戊糖轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白的類型及結(jié)構(gòu)基礎(chǔ)

微生物中的單糖轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白可分成三大類：易化超家族轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白(Major facilitator superfamily，MFS)、三磷酸腺苷結(jié)合盒轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白(ATP-binding cassette，ABC) 和磷酸烯醇式丙酮酸-糖磷酸轉(zhuǎn)移酶轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白(Carbohydrate phosphotransferase system，PTS)[22]。其中MFS型轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白又分為兩類，即：不消耗能量且借助糖濃度梯度的單向異化擴(kuò)散型(Facilitator/Uniporter) 被動(dòng)運(yùn)輸；不依賴糖濃度梯度、但需偶聯(lián)質(zhì)子濃度消耗ATP能量的質(zhì)子同向協(xié)同型(H+-linked symporter) 主動(dòng)運(yùn)輸[28-29]。研究表明釀酒酵母內(nèi)源非特異性轉(zhuǎn)運(yùn)戊糖的轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白均屬于不消耗能量的單向異化擴(kuò)散型[30-31]。

由于膜蛋白的結(jié)構(gòu)復(fù)雜性，其晶體結(jié)構(gòu)不易得到。截至目前，尚未解析在釀酒酵母中表達(dá)的戊糖轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白的具體晶體結(jié)構(gòu)，但通過同源建模策略，可推測(cè)其結(jié)構(gòu)[26,32-33]，為研究戊糖轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白的轉(zhuǎn)運(yùn)機(jī)制和分子動(dòng)力學(xué)提供結(jié)構(gòu)基礎(chǔ)。2012年，第一個(gè)戊糖轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白的結(jié)構(gòu)被解析，即大腸桿菌Escherichia coli中的質(zhì)子同向協(xié)同型木糖轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白XylEp。隨后解析了胞外半開放[34]、胞內(nèi)半開放和胞內(nèi)開放[35-36]的構(gòu)象。但在釀酒酵母中尚不能功能性表達(dá)[37]。2014年，人源葡萄糖單向轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白 GLUT1的晶體結(jié)構(gòu)得以解析[38]。上述晶體結(jié)構(gòu)為釀酒酵母源戊糖轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白的結(jié)構(gòu)分析提供了技術(shù)支持和參考模型。釀酒酵母中表達(dá)的戊糖轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白(圖 1)，一般由 12個(gè)跨膜區(qū)(即12個(gè) α螺旋) 圍繞構(gòu)成一個(gè)孔道，分為2個(gè)各含6個(gè)α螺旋的結(jié)構(gòu)域(N端結(jié)構(gòu)域和C端結(jié)構(gòu)域)，N和 C末端存在于細(xì)胞內(nèi)[39]，是典型的MFS轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白結(jié)構(gòu)特征。

1.2 釀酒酵母戊糖轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白的研究方法

圖1 釀酒酵母戊糖轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白結(jié)構(gòu)示意圖Fig.1 The structural diagram of pentose transporters in S.cerevisiae.

戊糖轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白轉(zhuǎn)運(yùn)能力的分析需要借助于有效可行的研究方法，常用于釀酒酵母戊糖轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白功能研究的方法有3種。其一，將轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白表達(dá)在不含戊糖初始代謝途徑的釀酒酵母菌株中，直接將菌株在H3或C14同位素標(biāo)記的戊糖中短時(shí)間孵育，測(cè)定胞內(nèi)放射性的強(qiáng)弱直接得到戊糖轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白的轉(zhuǎn)運(yùn)能力[40]，但放射性對(duì)細(xì)胞自身的損傷導(dǎo)致孵育時(shí)間不宜過長(zhǎng)，并對(duì)操作平臺(tái)設(shè)施要求較高。其二，同樣將不含戊糖初始代謝途徑的釀酒酵母菌株，分別較長(zhǎng)時(shí)間孵育在戊糖為唯一碳源的培養(yǎng)基中，收集細(xì)胞后，通過低滲等方式釋放胞內(nèi)積累的戊糖，測(cè)得的戊糖濃度即為木糖的積累量，并以此表征轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白的戊糖轉(zhuǎn)運(yùn)能力[26,29]。由于細(xì)胞內(nèi)非特異性醛糖還原酶的作用，對(duì)應(yīng)的還原產(chǎn)物戊糖醇也一并計(jì)算為胞內(nèi)的戊糖積累量。其三，在釀酒酵母中引入戊糖初始代謝途徑，并在含有戊糖的培養(yǎng)基中培養(yǎng)，測(cè)定菌株對(duì)戊糖的消耗及生長(zhǎng)，間接推斷其戊糖轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白的轉(zhuǎn)運(yùn)能力[26,37,41]。

但是上述方法都不便于戊糖轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白性能的高通量定量篩選。本課題組建立了一個(gè)基于化學(xué)發(fā)光強(qiáng)度檢測(cè)木糖運(yùn)能力的新方法。其基本原理是在釀酒酵母細(xì)胞中表達(dá)有木糖苷酶(Xylosidase)，在證明該木糖苷酶主要表達(dá)在細(xì)胞內(nèi)的前提下，利用該酶可以水解木糖類似物對(duì)硝基酚木糖苷(p-nitrophenyl-β-D-xylopyranoside，pNPX) 產(chǎn)生黃色的對(duì)硝基酚(p-nitrophenol，pNP)，且該物質(zhì)具有可以自由出入細(xì)胞的特點(diǎn)，通過檢測(cè)細(xì)胞外化學(xué)發(fā)光的強(qiáng)度變化以表征木糖轉(zhuǎn)運(yùn)能力。該方法是高通量的間接篩選木糖轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白的方法[24]。另外，通過構(gòu)建木糖濃度感應(yīng)的傳感器系統(tǒng)，也是木糖轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白的高通量篩選方法[42-43]，其基本原理是在細(xì)胞內(nèi)組成型表達(dá)異源阻遏蛋白XylR，其功能活性因與木糖結(jié)合與否而改變；同時(shí)將綠色熒光蛋白yEGFP置于受該阻遏蛋白調(diào)控的啟動(dòng)子下。胞內(nèi)木糖量不足時(shí)，XylR抑制yEGFP的表達(dá)，但隨著細(xì)胞內(nèi)木糖攝入量的增加，結(jié)合木糖的 XylR便促進(jìn)綠色熒光蛋白的表達(dá)。因此，通過木糖轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白轉(zhuǎn)入細(xì)胞的木糖越多，綠色熒光強(qiáng)度越大，通過簡(jiǎn)單的熒光檢測(cè)就可以高通量篩選木糖轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白突變子。

1.3 釀酒酵母木糖轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白的研究

1.3.1 釀酒酵母中木糖轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白功能表達(dá)研究

野生型釀酒酵母可利用自身己糖轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白非特異性地?cái)z取木糖。早期德國(guó)法蘭克福大學(xué)Boles教授利用構(gòu)建的釀酒酵母的內(nèi)源 18個(gè)己糖轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白全敲除菌株(hxt null，EBY.VW4000)[44]，通過質(zhì)粒導(dǎo)入，逐一分析了這些轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白對(duì)木糖的轉(zhuǎn)運(yùn)能力，表明內(nèi)源性轉(zhuǎn)運(yùn)木糖的蛋白主要是Hxt1p、Hxt2p、Hxt4p、Hxt5p、Hxt11p、Hxt7p和Gal2p。其中，Hxt7p和Gal2p對(duì)木糖的轉(zhuǎn)運(yùn)效率較高。但這些轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白對(duì)木糖的親和力遠(yuǎn)低于對(duì)葡萄糖的，并受到葡萄糖的強(qiáng)烈抑制，進(jìn)而限制了重組酵母對(duì)木糖的利用[25,30,37,44-48]。

將天然能利用木糖微生物的高木糖親和力轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白異源表達(dá)在釀酒酵母中也是提高其木糖攝取效率的熱門研究?jī)?nèi)容。到目前為止，源于瑞氏木霉Trichoderma reesei、間型假絲酵母Candida intermedia、新型隱球菌Cryptococcus neoformans、漢遜德巴利酵母Debaryomyces hansenii、樹干畢赤酵母Scheffersomyces stipitis、解脂耶氏酵母Yarrowia lipolytica、粗糙脈孢菌Neurospora crassa、馬克斯克魯維酵母Kluyveromyces marxianus、季也蒙畢赤酵母Pichia guilliermondii和季也蒙酵母Meyerozyma guilliermondii等真核生物及擬南芥Arabidopsis thaliana的木糖轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白已在釀酒酵母中異源表達(dá)[26,29,41,49-50]。某些轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白在一定條件下可以促進(jìn)釀酒酵母對(duì)木糖的轉(zhuǎn)運(yùn)和利用能力，例如，C.intermedia的Gxf1p、S.stipitis的Sut1p和A.thaliana的 At5g59250p、At5g17010p等在野生型釀酒酵母中表達(dá)后一定程度提高了菌株在木糖上的生長(zhǎng)能力和代謝能力[48,51-53]。而本課題組在對(duì)季也蒙酵母M.guilliermondii的研究中發(fā)現(xiàn)了兩類糖轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白：消耗能量的質(zhì)子同向協(xié)同型的轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白 Mgt05860p，胞內(nèi)木糖積累量較高，但卻不能促進(jìn)菌株在木糖上的生長(zhǎng)能力；而不消耗能量的單向異化擴(kuò)散型轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白Mgt05196p，雖然胞內(nèi)木糖積累量較低，但能較好地促進(jìn)木糖利用[26]。尚未有細(xì)菌源木糖轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白在釀酒酵母中有效表達(dá)的研究。

釀酒酵母的內(nèi)源己糖轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白全敲除菌株(hxt null，EBY.VW4000)[44]和主要己糖轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白HXT1-7p與Gal2p的缺失菌株[54]是分析具體單個(gè)木糖轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白轉(zhuǎn)運(yùn)能力的有效工具菌。通過上述1.2介紹的第 3種釀酒酵母戊糖轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白研究方法，即胞內(nèi)戊糖積累量，或引入木糖初始代謝途徑并通過生長(zhǎng)表型來分析轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白的木糖轉(zhuǎn)運(yùn)能力。例如：T.reesei的TrXlt1p和Stp1p，K.marxianus的 KmAXT1p，P.guilliermondii的 PgAXT1p，M.guilliermondii的 Mgt05196p、Mgt05293p和Mgt04891p，C.intermedia的 Gxf1p和 Gxs1p，D.hansenii的 XylHPp和 2D01474p，S.stipitis的RGT2p、Xut1p和 Xut3p等的導(dǎo)入，均能使含有木糖初始代謝途徑但己糖轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白全敲除(hxt null) 的釀酒酵母菌株利用木糖生長(zhǎng)[26,30,37,49-50]。N.crassa和S.stipitis中分別克隆得到的轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白An25p和Xyp29p[29]，以及季也蒙酵母M.guilliermondii的Mgt05860p[26]，雖然不能使菌株在木糖上生長(zhǎng)，但可以表現(xiàn)出顯著的木糖胞內(nèi)積累量特征，也證明了木糖轉(zhuǎn)運(yùn)能力。

1.3.2 釀酒酵母木糖轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白的功能位點(diǎn)分析與分子改造研究

木糖轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白的轉(zhuǎn)運(yùn)活性往往取決于某些保守序列和關(guān)鍵氨基酸位點(diǎn)，個(gè)別氨基酸的點(diǎn)突變就可以顯著影響轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白的轉(zhuǎn)運(yùn)效率和轉(zhuǎn)運(yùn)偏好性。目前已分析得到了木糖轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白的部分重要功能位點(diǎn)，并且一些木糖轉(zhuǎn)運(yùn)能力提高的正突變子也證明有利于木糖的利用[25-26,34,42,49,55-57]。

糖轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白的保守序列“G-G/F-XXX-G”和“YFFYY”對(duì)木糖轉(zhuǎn)運(yùn)起到關(guān)鍵作用。Young等[23]首次分析了木糖轉(zhuǎn)運(yùn)活性位點(diǎn)，并對(duì)在釀酒酵母中異源表達(dá)的 46個(gè)木糖轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白的序列分析后發(fā)現(xiàn)了第一跨膜區(qū)(TMS1) 上的保守序列“G-G/F-XXX-G”，通過對(duì)這一區(qū)域的氨基酸點(diǎn)突變，C.intermedia來源的突變子Gxs1V38F-L39I-F40M、S.stipitis來源的突變子Rgt2I38F-F40M和S.cerevisiae來源的突變子 Hxt7V39I-F40M-D340M均由葡萄糖木糖共轉(zhuǎn)運(yùn)轉(zhuǎn)變?yōu)樘禺愋赞D(zhuǎn)運(yùn)木糖(表1)，但仍舊受到葡萄糖的抑制。本課題組通過對(duì)源于季也蒙酵母M.guilliermondii轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白Mgt5196p的研究，發(fā)現(xiàn)了另一個(gè)存在于 TMS7上的保守序列“YFFYY”，對(duì)每一個(gè)位點(diǎn)進(jìn)行Ala失活突變后均顯著降低轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白對(duì)木糖的轉(zhuǎn)運(yùn)效率，可見此芳香族氨基酸富集區(qū)域?qū)δ咎寝D(zhuǎn)運(yùn)的活性至關(guān)重要[26]。

葡萄糖的存在會(huì)抑制木糖的利用，而在糖轉(zhuǎn)運(yùn)環(huán)節(jié)就存在這種抑制作用。篩選解除葡萄糖抑制的木糖特異性轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白突變子，對(duì)提高釀酒酵母的混糖共代謝速率意義重大。通過分子改造，目前已獲得了一些緩解或解除葡萄糖抑制的木糖特異性轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白突變子。表1顯示、C.intermedia來源的突變子 Gxs1-FIVFH497*[58]、N.crassa來源的突變子AN25-R4.18[33]以及S.cerevisiae內(nèi)源的突變子Hxt11-N366 mutants[25]，均可以有效緩解葡萄糖對(duì)轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白木糖轉(zhuǎn)運(yùn)活性的抑制，而釀酒酵母內(nèi)源轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白的點(diǎn)突變子 Gal2N376F和Hxt36N367F，以及本課題組得到的源于季也蒙酵母M.guilliermondii轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白突變子Mgt05196N360F，則是完全解除葡萄糖抑制的木糖專一性轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白突變子[26,32,55]。這些突變子不僅是單糖特異性轉(zhuǎn)運(yùn)機(jī)制研究的重要素材，也是釀酒酵母工業(yè)菌株精準(zhǔn)構(gòu)制的重要有效元件。本課題組在釀酒酵母木糖利用工業(yè)菌株中表達(dá)了源于季也蒙酵母M.guilliermondii轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白突變子Mgt05196N360F，并輔助定向馴化育種措施，使轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白帶來的木糖代謝能力提高了0.91倍[15]，進(jìn)一步提高了菌株的產(chǎn)業(yè)化性能。

表1 釀酒酵母中高活性表達(dá)的木糖特異性轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白突變子Table 1 Highly-active and specific xylose tranporter mutants in S.cerevisiae

1.4 釀酒酵母L-阿拉伯糖轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白的研究

野生型釀酒酵母可以通過內(nèi)源的己糖運(yùn)輸?shù)鞍譍al2p、Hxt9p和Hxt10p攝取L-阿拉伯糖[59]，其中，對(duì) L-阿拉伯糖轉(zhuǎn)運(yùn)活性最高的是 Gal2p。Wisselink等[60]通過敲除GAL2基因，使菌株喪失在L-阿拉伯糖上的生長(zhǎng)能力，從另一角度證明了Gal2p的轉(zhuǎn)運(yùn)功能對(duì)釀酒酵母利用 L-阿拉伯糖的積極意義。Becker等[61]和本課題組[19,28]在釀酒酵母中超表達(dá)了內(nèi)源的GAL2基因后增強(qiáng)了菌株對(duì)L-阿拉伯糖的吸收能力和代謝能力。

異源表達(dá)L-阿拉伯糖轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白可以緩解葡萄糖的阻遏，有效提高釀酒酵母代謝 L-阿拉伯糖的能力。迄今為止，人們已在多種天然L-阿拉伯糖代謝菌株當(dāng)中發(fā)現(xiàn)了多個(gè) L-阿拉伯糖轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白[31,62]，有效促進(jìn)了L-阿拉伯糖轉(zhuǎn)運(yùn)功能的研究。最早，Verho等[63]從單孢蟲道酵母Ambrosiozyma monospora中得到了2個(gè)可提高釀酒酵母L-阿拉伯糖轉(zhuǎn)運(yùn)能力的L-阿拉伯糖專一性轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白。隨后，天然可利用L-阿拉伯糖的真菌中來源的多個(gè)糖轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白，在釀酒酵母己糖轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白敲除菌株(hxt null，EBY.VW4000)[44]中均表現(xiàn)出 L-阿拉伯糖轉(zhuǎn)運(yùn)能力，它們是S.stipitis的 AraTp、A.thaliana的 Stp2p、K.marxianus的 KmAXT1p、P.guilliermondii的 PgAXT1p、Mgt05860p、Mgt05293p和 Mgt04891p、N.crassa的 LAT-1、皮狀絲孢酵母Trichosporon cutaneum的 Tct1p、T.reesei的 Stp1p和嗜熱毀絲菌Myceliophthora thermophila的 MtLAT-1[26,50,59,62]。

L-阿拉伯糖轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白的功能位點(diǎn)研究相對(duì)較少。工具菌株的缺乏是限制因素之一。本課題組構(gòu)建了可用于分析L-阿拉伯糖轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白及其功能位點(diǎn)并方便使用的工具菌株。在前期構(gòu)建的可以高效利用 L-阿拉伯糖的菌株 BSW3AP[28]的基礎(chǔ)上，敲除基因組上的L-阿拉伯糖轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白Gal2p，使菌株失去利用L-阿拉伯糖的能力，進(jìn)而通過質(zhì)粒引入糖轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白，即可基于菌株在以L-阿拉伯糖為唯一碳源上的生長(zhǎng)狀態(tài)研究轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白的功能。我們的研究結(jié)果表明，Gal2p的第一跨膜區(qū)上的保守區(qū)域“G-G/F-XXX-G”也是轉(zhuǎn)運(yùn)L-阿拉伯糖的重要區(qū)域，突變子Gal2p(F85S) 可以顯著提高L-阿拉伯糖和木糖轉(zhuǎn)運(yùn)效率，并可以緩解葡萄糖轉(zhuǎn)運(yùn)抑制[64]。

2 釀酒酵母戊糖及混合糖代謝工程的研究

2.1 釀酒酵母的木糖代謝工程的研究

木質(zhì)纖維素的全糖乙醇高效共轉(zhuǎn)化是提高以木質(zhì)纖維素生物質(zhì)為原料二代燃料乙醇生產(chǎn)經(jīng)濟(jì)性的一個(gè)必要措施。雖然對(duì)傳統(tǒng)乙醇生產(chǎn)菌釀酒酵母S.cerevisiae而言，需要解決葡萄糖、木糖和L-阿拉伯糖共利用的問題，但目前主要研究進(jìn)展集中在葡萄糖/木糖的乙醇共發(fā)酵上。30多年來，釀酒酵母的木糖代謝工程研究歷程可歸納成 4個(gè)環(huán)節(jié)：①高效異源木糖利用途徑的建立。釀酒酵母主要是缺乏轉(zhuǎn)化木糖為木酮糖的上游代謝途徑而不能代謝木糖。由木糖還原酶(Xylose reductase，XR) 與木糖醇脫氫酶(Xylitol dehydrogenase，XDH) 構(gòu)成XR-XDH途徑，是較早在釀酒酵母中建立的木糖代謝途徑，但因?yàn)檫@對(duì)還原/氧化酶所依賴的輔酶因子偏好性不同，容易造成細(xì)胞內(nèi)氧化還原不平衡，造成大量木糖醇等中間產(chǎn)物的積累，難以提高糖醇轉(zhuǎn)化率。雖然開展了大量輔酶工程的研究，但這一缺陷始終沒能有效克服[9-10,65-67]。而無需輔酶且一步完成木糖到木酮糖轉(zhuǎn)化的短程木糖異構(gòu)酶XI(Xylose isomerase) 途徑，普遍認(rèn)為是搭建釀酒酵母木糖代謝途徑的首選策略，但能在釀酒酵母中高活性表達(dá)的木糖異構(gòu)酶基因的篩選卻經(jīng)歷了十分艱苦的過程，直到 2003年才報(bào)道了第一例[6]，隨后，包括本課題組在內(nèi)又陸續(xù)報(bào)道了幾例[68-71]。雖然上述建立了初始木糖代謝途徑的重組菌株可以利用木糖，但效率不高。②內(nèi)源性代謝節(jié)點(diǎn)的理性改造。木糖轉(zhuǎn)化為木酮糖，再經(jīng)過磷酸戊糖途徑(Pentose phosphatepathway，PPP) 進(jìn)入乙醇發(fā)酵主代謝途徑。本環(huán)節(jié)主要包括理性強(qiáng)化內(nèi)源下游途徑，弱化旁支途徑及能源消耗節(jié)點(diǎn)等[10,17,69-70,72]。近年來，理性改造的關(guān)注點(diǎn)偏移到糖轉(zhuǎn)運(yùn)環(huán)節(jié)，釀酒酵母中葡萄糖對(duì)木糖的轉(zhuǎn)運(yùn)有明顯的阻遏作用，適于二代燃料乙醇生產(chǎn)釀酒酵母糖轉(zhuǎn)運(yùn)的理想狀態(tài)是木糖/葡萄糖各行其道、高效專一性轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白各行其責(zé)，本文已對(duì)相關(guān)研究進(jìn)展進(jìn)行了總結(jié)。③進(jìn)化工程的非理性改造。由于木糖代謝及木質(zhì)纖維素預(yù)處理過程產(chǎn)生的抑制物的復(fù)雜性，及人們對(duì)相關(guān)生物學(xué)過程理論認(rèn)識(shí)依然不足，因而，菌株在木糖或脅迫條件下進(jìn)行長(zhǎng)期適應(yīng)性進(jìn)化并篩選，是進(jìn)一步提高木糖代謝能力及抑制物耐受力普遍使用的有效措施，且不乏有成功的例子[10-11,13,15,73]。④木糖/葡萄糖共代謝魯棒性釀酒酵母工業(yè)菌株的構(gòu)建。釀酒酵母單倍體營(yíng)養(yǎng)缺陷型菌株易于得到研究結(jié)果，但不適于粗放條件的產(chǎn)業(yè)化生產(chǎn)過程，因此，需要將上述研究結(jié)果引入到魯棒性較強(qiáng)的釀酒酵母工業(yè)菌株底盤細(xì)胞中，目前所得到的重組菌發(fā)酵木質(zhì)纖維素水解液，糖醇轉(zhuǎn)化率在0.40-0.48 g/g(Total sugar) 之間[13-15,74]。其中本課題組通過綜合評(píng)估選擇出魯棒性強(qiáng)且本底木糖代謝能力較高的二倍體野生型釀酒酵母菌株為底盤細(xì)胞，并基于兩個(gè)獨(dú)特的重要元件——能在釀酒酵母中高效表達(dá)的木糖異構(gòu)酶 Ru-XI(編碼基因Ru-xylA源于牛瘤胃宏基因組，ZL 201110042170.2，US 8,586,336 B2，EP 2679686) 及不受葡萄糖阻遏的木糖專一性轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白 Mgt05196pN360F，對(duì)底盤細(xì)胞進(jìn)行一系列理性及非理性改造，最終得到一株高效同步共發(fā)酵木糖/葡萄糖釀酒酵母工程菌株LF1。其對(duì)混合糖發(fā)酵時(shí)，約16 h即可耗盡培養(yǎng)基中全部葡萄糖和 94.5%木糖，乙醇得率達(dá)到理論得率的93%以上。更可喜的是該菌株表現(xiàn)出很好的木糖/葡萄糖同步共發(fā)酵的能力，在葡萄糖耗盡(約12 h) 時(shí)，木糖的消耗為77.6%。在兩種木質(zhì)纖維素預(yù)處理水解液(稀酸預(yù)處理的玉米秸稈水解液 SECS和亞硫酸鹽預(yù)處理的小麥秸稈造紙殘?jiān)黃PPR) 中也具有優(yōu)良的發(fā)酵能力。為降低生產(chǎn)成本，以尿素為氮源寡營(yíng)養(yǎng)的條件下，在SPPR中，18 h內(nèi)菌株即可耗盡全部木糖，在SECS中，約40 h消耗90%以上的木糖，乙醇得率均達(dá)到理論乙醇得率的80%以上[15,75]。

2.2 釀酒酵母L-阿拉伯糖代謝工程的研究

相對(duì)于木糖代謝工程，釀酒酵母L-阿拉伯糖途徑精準(zhǔn)構(gòu)制的研究相對(duì)滯后。同樣地，天然釀酒酵母沒有L-阿拉伯糖的初始代謝途徑，需要將其他微生物中存在的L-阿拉伯糖初始代謝途徑引入釀酒酵母中，以在釀酒酵母中建立L-阿拉伯糖代謝途徑。

L-阿拉伯糖通過 5-磷酸木酮糖中間產(chǎn)物進(jìn)入主代謝，微生物中完成這一過程的主要途徑有兩條[76]。真菌中是需要5個(gè)酶的復(fù)雜途徑[77]，即L-阿拉伯糖還原酶(Arabinose reductase，AR)、L-阿拉伯糖醇-4-脫氫酶(L-arabinitol 4-dehydrogenase，LAD)、L-木酮糖還原酶(L-xylulose reductase，LXR)、木糖醇脫氫酶(D-xylitol dehydrogenase，XDH) 和木酮糖激酶(Xylulokinase，XK)，其中包括4個(gè)氧化還原反應(yīng)，容易造成氧化還原不平衡[77-78]。而細(xì)菌中L-阿拉伯糖初始代謝途徑是通過3個(gè)酶完成，即L-阿拉伯糖異構(gòu)酶(L-arabinose isomerase，AI)、L-核酮糖激酶(L-ribulokinase，RK) 和 L-核酮糖-5-磷酸-4-差向異構(gòu)酶(L-ribulose-5-P-4-epimerase，RPE)。其中 AI的活性是在釀酒酵母中建立L-阿拉伯糖代謝途徑的關(guān)鍵節(jié)點(diǎn)[61]。為此，本課題組[28]進(jìn)一步通過提高L-阿拉伯糖異構(gòu)酶AI基因的拷貝數(shù)、強(qiáng)化磷酸戊糖途徑、超表達(dá)內(nèi)源性對(duì)L-阿拉伯糖親和力較高的轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白 Gal2p，并結(jié)合 L-阿拉伯糖為唯一碳源的適應(yīng)性進(jìn)化等策略，顯著提高了釀酒酵母菌株L-阿拉伯糖的代謝能力，L-阿拉伯糖最大比消耗速率達(dá)到 0.61 g/(h?g DCW)(Dry cell weight)。

2.3 釀酒酵母三糖共代謝菌株的構(gòu)建

充分利用木質(zhì)纖維素原料，需要在釀酒酵母中構(gòu)建葡萄糖、木糖和L-阿拉伯糖共發(fā)酵菌株，以拓展釀酒酵母底物利用范圍，實(shí)現(xiàn)木質(zhì)纖維素原料的全糖轉(zhuǎn)化。但目前關(guān)于三糖共發(fā)酵釀酒酵母工程菌株構(gòu)建的報(bào)道并不多，而多半是在實(shí)驗(yàn)室菌株中完成，且糖醇轉(zhuǎn)化效率較低。

由于真菌的L-阿拉伯糖初始代謝途徑中包括了木糖的 XR-XDH初始代謝途徑，Bettiga等[77]在釀酒酵母中引入該途徑，使其可以利用三糖，但對(duì)木糖和L-阿拉伯糖的利用率很低。葡萄糖耗盡后，菌株對(duì)木糖和L-阿拉伯糖的比消耗速率分別為 0.08 g/(h·g DCW) 和 0.02 g/(h·g DCW)，乙醇得率達(dá)到0.35 g/(g Pentose)，僅為理論值的68%。相反，Bera等[79]是在含有木糖 XR-XDH代謝途徑的釀酒酵母菌株中，又表達(dá)了L-阿拉伯糖醇-4-脫氫酶(LAD) 和 L-木酮糖還原酶(ALK)，也得到了共利用三糖的菌株。Karhumaa等[80]和Sanchez等[81]將細(xì)菌 L-阿拉伯糖初始代謝途徑和木糖XR-XDH初始代謝途徑同時(shí)引入釀酒酵母，菌株也可以利用三糖，但木糖還原酶(XR) 減少了L-阿拉伯糖向乙醇代謝的流向，而增加副產(chǎn)物L(fēng)-阿拉伯糖醇的產(chǎn)生。為了緩解細(xì)菌L-阿拉伯糖初始代謝途徑受XR的影響，Wisselink等[82]將細(xì)菌L-阿拉伯糖初始代謝途徑和木糖異構(gòu)酶(Xylose isomerase，XI) 共表達(dá)，舍棄容易產(chǎn)生副產(chǎn)物的氧化還原途徑(XR-XDH途徑)，得到共利用葡萄糖、木糖和L-阿拉伯糖的重組菌株[76,82]，共糖發(fā)酵乙醇產(chǎn)率達(dá)到0.43g/g(Total sugar)，達(dá)到理論值的84%，且沒有副產(chǎn)物木糖醇和阿拉伯糖醇的積累。進(jìn)一步采用適應(yīng)性進(jìn)化策略選育，使重組菌株對(duì)30 g/L葡萄糖、15 g/L木糖和15 g/L L-阿拉伯糖的共發(fā)酵時(shí)間從60 h降為35 h，但乙醇得率沒有變化。本課題組將細(xì)菌的阿拉伯糖初始代謝途徑和木糖的XR-XDH與XI代謝途徑共表達(dá)，獲得了三糖代謝菌株BSW4XA3，木糖和L-阿拉伯糖的消耗速率相近，實(shí)現(xiàn)戊糖同步利用，而且葡萄糖的代謝效率不受影響[19]，大大推進(jìn)了釀酒酵母三糖共代謝工程的研究進(jìn)程。

3 討論與展望

構(gòu)建高效發(fā)酵木質(zhì)纖維素全糖組分的釀酒酵母二倍體工程菌株，是纖維素乙醇規(guī)?；a(chǎn)與應(yīng)用的前提條件之一。釀酒酵母的葡萄糖利用能力很強(qiáng)，且工程菌也能利用木糖和L-阿拉伯糖，但戊糖代謝能力依然有待進(jìn)一步提高。轉(zhuǎn)運(yùn)環(huán)節(jié)是木糖和L-阿拉伯糖進(jìn)入釀酒酵母細(xì)胞進(jìn)行代謝的第一步，也是限制兩種戊糖代謝水平的瓶頸問題之一，這一過程尤其受到葡萄糖的強(qiáng)烈抑制。構(gòu)建高效利用戊糖的重組釀酒酵母菌株，需要篩選得到對(duì)兩種戊糖轉(zhuǎn)運(yùn)能力和親和力更高的轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白。迄今為止，在釀酒酵母中已報(bào)道了一些內(nèi)源和異源功能性表達(dá)的戊糖轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白，并對(duì)戊糖轉(zhuǎn)運(yùn)的分子轉(zhuǎn)運(yùn)機(jī)制進(jìn)行了初步的分析，取得了一定進(jìn)展；但由于戊糖轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白的多樣性和復(fù)雜性，以及研究技術(shù)等問題的限制，整體研究工作尚需要進(jìn)一步深入。目前，雖已獲得了幾個(gè)解除葡萄糖抑制的木糖專一性轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白，但在野生型釀酒酵母中，葡萄糖的利用效率仍舊高于木糖，兩者的協(xié)同共利用效率尚需進(jìn)一步提高。質(zhì)子同向型轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白對(duì)戊糖的轉(zhuǎn)運(yùn)偏好性較高，是提高戊糖轉(zhuǎn)運(yùn)效率的又一有效手段，但表達(dá)活性普遍較弱，尤其是細(xì)菌源的戊糖高偏好性轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白尚未在釀酒酵母中活性表達(dá)?，F(xiàn)在雖有細(xì)菌源木糖轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白結(jié)構(gòu)的解析，但釀酒酵母中表達(dá)的戊糖轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白的真實(shí)晶體結(jié)構(gòu)尚不清楚，如何成功解析酵母菌戊糖轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白的晶體結(jié)構(gòu)是擺在我們面前的一大難題。通過一些有效的研究策略，獲得更高活性的木糖和L-阿拉伯糖專一性轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白突變子，實(shí)現(xiàn)葡萄糖和兩種戊糖協(xié)同代謝，是提高釀酒酵母纖維素乙醇生成效率、推動(dòng)規(guī)?；a(chǎn)進(jìn)程的重要前提。

釀酒酵母二代燃料乙醇的規(guī)?；l(fā)酵，需要完成葡萄糖和木糖的高效糖醇轉(zhuǎn)化。除了轉(zhuǎn)運(yùn)環(huán)節(jié)，目前也已進(jìn)行了大量胞內(nèi)木糖代謝途徑和表達(dá)調(diào)控研究，大大提高了高效共轉(zhuǎn)化木糖/葡萄糖能力。后續(xù)需要進(jìn)一步通過代謝工程和合成生物學(xué)策略提高葡萄糖存在下的木糖代謝效率，以及提高菌株對(duì)上游工藝過程產(chǎn)生抑制物的耐受性，提升應(yīng)用價(jià)值。隨著研究的不斷深入，木糖和L-阿拉伯糖轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白和代謝工程研究將在推動(dòng)適于木質(zhì)纖維素乙醇生產(chǎn)釀酒酵母工業(yè)菌株的選育和應(yīng)用領(lǐng)域發(fā)揮重要作用。