陽媛，毛艷華，王佳，孫聰聰，張應(yīng)鳳，陳芯培

重慶醫(yī)科大學(xué)附屬大學(xué)城醫(yī)院 婦產(chǎn)科，重慶 401331

目前，宮腔粘連的治療仍是婦產(chǎn)科疾病的重大難題之一。近年來，有研究表明間充質(zhì)干細(xì)胞(Mesenchymal stem cell，MSC) 可成功修復(fù)受損的子宮內(nèi)膜[1]。其中人羊膜間充質(zhì)干細(xì)胞(Human amniotic mesenchymal stem cells，hAMSCs) 可從健康剖宮產(chǎn)婦廢棄胎盤最內(nèi)層的羊膜組織中分離培養(yǎng)獲得，具有來源充足、無創(chuàng)傷性、無倫理學(xué)的問題、自我增殖能力強(qiáng)、低免疫原性和多向分化潛能等優(yōu)勢[2-6]，成為更為理想的細(xì)胞移植的來源[7]，為治療宮腔粘連帶來了新的思路。然而，hAMSCs移植人體內(nèi)以后的去處以及其發(fā)揮的治療作用尚不清楚。因此，提供一個(gè)簡便有效的體內(nèi)示蹤方法，研究移植細(xì)胞在體內(nèi)存活、遷移、分布等已成為干細(xì)胞移植研究領(lǐng)域的重要環(huán)節(jié)。大量研究表明 PKH26染料標(biāo)記人臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞及骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞等的示蹤研究[8-10]。然而 PKH26標(biāo)記的 hAMSCs在大鼠宮腔粘連子宮內(nèi)膜的遷移示蹤情況的報(bào)道較少。本研究采用PKH26對hAMSCs進(jìn)行體外標(biāo)記，觀察其對細(xì)胞形態(tài)、增殖、活性、周期等生物學(xué)特征的影響，并通過尾靜脈移植于宮腔粘連大鼠體內(nèi)，觀察其在大鼠子宮內(nèi)膜組織中遷移情況，為 hAMSCs移植治療宮腔粘連的研究提供一個(gè)有效的示蹤方法，為下一步研究hAMSCs移植的作用奠定理論基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 羊膜來源

取自重慶醫(yī)科大學(xué)附屬第一醫(yī)院產(chǎn)科，獲得產(chǎn)婦同意且排除各種傳染性疾病的正常足月剖宮產(chǎn)分娩的胎盤，于無菌條件下剝離羊膜組織。本實(shí)驗(yàn)經(jīng)重慶醫(yī)科大學(xué)倫理委員會(huì)(20141230) 批準(zhǔn)，所有方法均按照有關(guān)規(guī)定執(zhí)行。

1.1.2 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物

選取SPF級健康雌性SD大鼠15只，購自重慶醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心。體質(zhì)量220–250 g，每5只一籠，常規(guī)喂養(yǎng)。

1.2 方法

1.2.1 hAMSCs的分離、培養(yǎng)、鑒定

無菌條件下剝離羊膜組織，用PBS反復(fù)沖洗除去殘留血液及絨毛膜并將其剪成約 1 mm×1 mm×1 mm組織碎塊。加入 0.05%胰蛋白酶于37 ℃水浴鍋中消化30 min，反復(fù)2次，離心棄上清液。然后加入0.1 mg/mLⅠ型膠原酶37 ℃消化1 h。200目細(xì)胞篩過濾，收集細(xì)胞濾液，離心、培養(yǎng)于含12%胎牛血清的DMEM/F12培養(yǎng)液中，在37 ℃、5% CO2的恒溫培養(yǎng)箱中孵育。2–3 d更換培養(yǎng)基一次，待細(xì)胞長至 85%–90%融合時(shí)傳代。取第3代細(xì)胞用流式細(xì)胞儀檢測細(xì)胞膜免疫表型CD29、CD34、CD90、HLA-DR的表達(dá)，并做陰性對照檢測；用免疫熒光檢測hAMSCs間充質(zhì)細(xì)胞標(biāo)志物波形蛋白和上皮細(xì)胞標(biāo)志物角蛋白的表達(dá)。

1.2.2 PKH26標(biāo)記羊膜間充質(zhì)干細(xì)胞

取第3代hAMSCs消化成單細(xì)胞懸液，用PBS清洗一遍，離心，小心棄上清液(剩余上層細(xì)胞體積不多于 25 μL)。按照 PKH26(Sigma公司) 試劑盒說明書加入1 mL稀釋液C，輕輕吹打混勻制成細(xì)胞懸液。在染色前，配置好4×10–6mol/L染色工作液，快速將細(xì)胞懸液加入到染色液中充分混勻孵育1–5 min。加入2 mL的血清終止反應(yīng)，孵育 1 min以結(jié)合多余染液。離心棄上清，用10 mL完全培養(yǎng)基重懸細(xì)胞，移至另一新的離心管中，反復(fù)清洗2遍。重懸至實(shí)驗(yàn)所需的細(xì)胞濃度。細(xì)胞涂片，熒光鏡下觀察細(xì)胞，計(jì)算熒光標(biāo)記率。將細(xì)胞常規(guī)傳代培養(yǎng)，觀察單次標(biāo)記后在體外檢測到PKH26熒光的時(shí)間，每次傳代前于熒光鏡下觀察顯色情況。

1.2.3 細(xì)胞活性和增殖的檢測

取第3代標(biāo)記和未標(biāo)記的hAMSCs，用CCK-8試劑盒檢測其活性及增殖能力，計(jì)算存活率并繪制生長曲線。按照試劑盒說明書操作每孔加入100 μL(含細(xì)胞數(shù)約為1 000個(gè)) 細(xì)胞懸液接種于96孔板中。每次取5孔檢測hAMSCs活性，重復(fù)3次；每天相同時(shí)間取3孔，共6 d檢測細(xì)胞的增殖能力。用全自動(dòng)酶標(biāo)儀檢測 450 nm處的吸光度，取均值。存活率=(標(biāo)記組OD值–空白孔OD值)/(未標(biāo)記組OD值–空白孔OD值)；以培養(yǎng)時(shí)間為橫坐標(biāo)、相應(yīng)的吸光度值為縱坐標(biāo)，繪制生長曲線。

1.2.4 細(xì)胞周期和凋亡的檢測

取第3代標(biāo)記和未標(biāo)記的hAMSCs，用流式細(xì)胞儀檢測細(xì)胞周期和凋亡率。

1.2.5 建立大鼠宮腔粘連模型

參照蔡慧華等[11]的方法建模。選用15只SD大鼠，隨機(jī)分為3組，每組5只。每日上午經(jīng)陰道涂片檢查，確認(rèn)有動(dòng)情周期?？瞻讓φ战M不予處理；實(shí)驗(yàn)組建立宮腔粘連模型，腹腔注射5%、2 mL/只的水合氯醛麻醉。嚴(yán)格遵守?zé)o菌原則，于大鼠的下腹正中部縱行切開一長約 3–4 cm的切口，分離組織進(jìn)入腹腔，暴露子宮。在距宮體交界處1 cm的左宮角橫切開一微小切口，自該切口用自制的小刮勺向?qū)m角遠(yuǎn)端搔刮左側(cè)子宮腔4圈，搔刮長度約4 cm，停止搔刮。于宮腔內(nèi)留置已備好的脂多糖棉線，同法處理右側(cè)子宮角。生理鹽水沖洗腹腔，縫合切口。留置約2 cm的棉線殘端于腹部，2 d后輕拉尾絲，取出宮內(nèi)棉線，建模后經(jīng)尾靜脈移植1 mL PKH26標(biāo)記的hAMSCs(含2×106個(gè))；實(shí)驗(yàn)對照組按實(shí)驗(yàn)組方法建模，建模后經(jīng)尾靜脈注射等體積的PBS液。

1.2.6 熒光共聚焦顯微鏡下觀察 hAMSCs在大鼠子宮內(nèi)膜中的分布

hAMSCs移植后14 d，收集大鼠子宮組織行冰凍切片，熒光共聚焦顯微鏡下觀察PKH26標(biāo)記的hAMSCs在子宮中的分布情況。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

采用SPSS19.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，數(shù)據(jù)用x±s表示，檢驗(yàn)水準(zhǔn)α=0.05，P＜0.05具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果與分析

2.1 hAMSCs形態(tài)觀察、表面標(biāo)志物特征及PKH26標(biāo)記效果

hAMSCs貼壁生長，形態(tài)呈梭形或多角形，排列緊密，胞體拉伸，單層放射狀或漩渦狀生長，傳代后細(xì)胞增殖迅速，約3–4 d可鋪滿全層(圖1)。流式細(xì)胞儀檢測 hAMSCs高表達(dá) CD29、CD90(95%以上)，幾乎不表達(dá) CD34、HLA-DR(圖 2)，類似于文獻(xiàn)報(bào)道的間充質(zhì)干細(xì)胞的表型表達(dá)[9]。免疫熒光染色顯示hAMSCs表達(dá)波形蛋白，而不表達(dá)角蛋白(圖3)，說明提取的hAMSCs純度較高。PKH26標(biāo)記陽性率100%；CCK-8檢測顯示標(biāo)記細(xì)胞的存活率高達(dá)99%。第3代hAMSCs首次PKH26染色后，經(jīng)過4次傳代，每代3–5 d，隨著細(xì)胞的傳代熒光強(qiáng)度逐漸減弱(圖4)。

2.2 hAMSCs標(biāo)記組與未標(biāo)記組的細(xì)胞增殖能力的檢測

CCK-8檢測對兩組細(xì)胞進(jìn)行細(xì)胞增殖能力的檢測，結(jié)果顯示：第3–5天細(xì)胞增殖速度較快，為對數(shù)增長期；之后細(xì)胞生長進(jìn)入平臺(tái)期。兩組差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(t=0.924 5)(圖5)。

2.3 hAMSCs標(biāo)記組與未標(biāo)記組的細(xì)胞凋亡檢測

對兩組的各類細(xì)胞比例行獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P=0.878 9)，說明PKH26標(biāo)記hAMSCs不影響細(xì)胞的凋亡(圖6)。

圖1 人羊膜間充質(zhì)干細(xì)胞在顯微鏡下的形態(tài)Fig.1 Morphology of human amniotic mesenchymal stem cells under microscope.(A) The primary cells in the third day.(B) Cells after passage.

圖2 人羊膜間充質(zhì)干細(xì)胞免疫表型測定Fig.2 The immunophenotype of human amniotic mesenchymal stem cells.(A) CD29(99.60%,positive).(B) CD90(98.69%,positive).(C) CD34(0.45%,negative).(D) HLA-DR(1.04%,negative).

2.4 hAMSCs標(biāo)記組與未標(biāo)記組細(xì)胞的周期檢測

兩組的大部分細(xì)胞處于 DNA合成前期(G1期)，少數(shù)細(xì)胞處于DNA復(fù)制期(S期)、DNA合成后期(G2) 和有絲分裂期(M期)。兩組各期的細(xì)胞比例差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P=0.980 3)，說明PKH26標(biāo)記hAMSCs不影響細(xì)胞的周期(圖7)。

2.5 hAMSCs移植后在子宮中的分布情況

熒光共聚焦顯微鏡下可見 PKH26標(biāo)記陽性的hAMSCs散在分布在大鼠子宮內(nèi)膜中，呈紅色熒光。對照組和實(shí)驗(yàn)對照組基本未見紅色熒光(圖 8)。

圖3 人羊膜間充質(zhì)干細(xì)胞波形蛋白(A)、角蛋白(B) 的表達(dá)情況Fig.3 Expression of vimentin(A) and keratin(B) in amniotic mesenchymal stem cells.

圖4 PKH26標(biāo)記的人羊膜間充質(zhì)干細(xì)胞Fig.4 Human amniotic mesenchymal stem cells labeled by PKH26.(A) P3 generation cells stained for the first time by PKH26.(B-E) Fluorescence staining of 2,3,4 and 5 passages cells.

圖5 人羊膜間充質(zhì)干細(xì)胞 PKH26標(biāo)記組和未標(biāo)記組的細(xì)胞增殖檢測Fig.5 Cell proliferation of human amniotic mesenchymal stem cells in PKH26 and unmarked groups.

圖6 人羊膜間充質(zhì)干細(xì)胞PKH26標(biāo)記組和未標(biāo)記組的細(xì)胞凋亡檢測Fig.6 Cell apoptosis detection of human amniotic mesenchymal stem cells in PKH26 and unmarked groups.

圖7 人羊膜間充質(zhì)干細(xì)胞PKH26標(biāo)記組和未標(biāo)記組的細(xì)胞周期檢測Fig.7 Cell cycle detection of human amniotic mesenchymal stem cells in PKH26 and unmarked groups.

圖8 熒光共聚焦顯微鏡下觀察 PKH26標(biāo)記的hAMSCs在大鼠子宮內(nèi)膜的分布情況Fig.8 Distribution of PKH26 labeled hAMSCs in the endometrium of rats under the fluorescence confocal microscopy.(A,B) Experimental group.(C) Experimental control group.(D) Control group.

3 討論

本課題組人員臨床研究發(fā)現(xiàn)羊膜移植可有效改善宮腔粘連患者術(shù)后再粘連、月經(jīng)等情況[12]，但其中的作用機(jī)制尚不清楚。有學(xué)者認(rèn)為宮腔粘連的形成可能與子宮內(nèi)膜基層干細(xì)胞功能受損和數(shù)量減少甚至缺失有關(guān)[13]，而子宮內(nèi)膜的再生修復(fù)需要一定數(shù)量的子宮內(nèi)膜干細(xì)胞[14]。目前已有研究證實(shí)羊膜中含有干細(xì)胞樣細(xì)胞，且整張羊膜可產(chǎn)生高達(dá)4×108個(gè)hAMSCs[15]。羊膜間充質(zhì)干細(xì)胞具有自我更新、較強(qiáng)的分化潛能，在體外可向胰島樣細(xì)胞(內(nèi)胚層)[16]、成骨細(xì)胞、脂肪細(xì)胞(中胚層)[17]、神經(jīng)細(xì)胞(外胚層)[18-19]等 3個(gè)胚層的不同類型細(xì)胞分化。多項(xiàng)研究也表明 hAMSCs是修復(fù)重建受損組織、器官功能的理想種子細(xì)胞[20]。因此，如何選用一種簡便、有效的方法標(biāo)記hAMSCs，了解其在體內(nèi)遷移及修復(fù)子宮內(nèi)膜的機(jī)制是亟待解決的問題。

PKH26是一種熒光染料，具有親脂性，可與細(xì)胞膜的脂質(zhì)雙分子層發(fā)生不可逆的結(jié)合，產(chǎn)生紅色熒光，標(biāo)記物可隨細(xì)胞分裂平均分配給子細(xì)胞。目前廣泛用于多種細(xì)胞或其他含顆粒胞膜的標(biāo)記[21-23]，對細(xì)胞無明顯毒副作用[24]，不影響細(xì)胞原有的生物學(xué)特性[25]，且可重復(fù)性好。既往實(shí)驗(yàn)表明，細(xì)胞移植后PKH26染料不會(huì)在已標(biāo)記和未標(biāo)記的細(xì)胞間傳遞，且不會(huì)從凋亡或死亡的細(xì)胞中釋放出來，可精確區(qū)分移植細(xì)胞和宿主細(xì)胞[21]。PKH26能穩(wěn)定存留于體內(nèi)6個(gè)月[26]，甚至有標(biāo)記神經(jīng)干細(xì)胞超過1年的記錄[21]，目前成為研究細(xì)胞遷移示蹤的理想工具。

因此，本研究對 hAMSCs進(jìn)行 PKH26熒光標(biāo)記。標(biāo)記后細(xì)胞形態(tài)和細(xì)胞生長狀態(tài)、細(xì)胞周期和凋亡均無明顯變化。CCK-8實(shí)驗(yàn)檢測PKH26標(biāo)記后細(xì)胞存活率＞95%，表明該染料不影響細(xì)胞的活性，無細(xì)胞毒性作用。PKH26首次標(biāo)記后，熒光強(qiáng)度隨著細(xì)胞傳代逐漸減弱，這可能與染料隨著細(xì)胞分裂平均分配到子代細(xì)胞有關(guān)[27]。標(biāo)記的細(xì)胞經(jīng)過4次傳代仍可觀察到熒光顯色，這說明標(biāo)記的hAMSCs至少在20 d內(nèi)可以被檢測出。此外，hAMSCs移植后2周在實(shí)驗(yàn)組大鼠的子宮內(nèi)膜層可觀察到紅色熒光，而在對照組和實(shí)驗(yàn)對照組未見紅色熒光。由此推測，受損的子宮可能啟動(dòng)了體內(nèi)的某些信號(hào)系統(tǒng)，當(dāng)hAMSCs移植入體內(nèi)后，經(jīng)血遷移至子宮，并停留于此。然而本實(shí)驗(yàn)只觀察了hAMSCs移植后2周的子宮組織情況，在今后的研究中，將繼續(xù)觀察hAMSCs在體內(nèi)遠(yuǎn)期的遷移、增殖分化情況，并檢測 hAMSCs對宮腔粘連的治療效果及作用機(jī)制。