唐文誠，李 敏，羅芳芳，易輝燕，唐 莉，楊 麗

（四川省綿陽市第三人民醫(yī)院·四川省精神衛(wèi)生中心，四川 綿陽 621000）

隨著核能在工業(yè)、農(nóng)業(yè)、軍事、醫(yī)學(xué)等方面應(yīng)用的快速發(fā)展，人們?cè)馐茌椛鋼p傷的可能性也隨之增加。多種植物和中藥制劑具有一定的防輻射作用［1-7］。天然藥物具有來源廣、毒性低的特點(diǎn)［8］，以來源于中草藥的藥物作為輻射防護(hù)劑，前景廣闊，是研究熱點(diǎn)［9-10］。川芎Ligusticum chuanxiongHort．是傘形科藁本屬多年生草本植物，以根莖入藥，味辛、性溫，具有活血行氣、祛風(fēng)止痛等功效［11］，主產(chǎn)于四川。其主要藥效成分包括阿魏酸、洋川芎內(nèi)酯A、藁本內(nèi)酯和生物堿等［12］。本試驗(yàn)中采用川芎提取物進(jìn)行抗輻射氧化應(yīng)激研究，以進(jìn)一步探討川芎提取物在抗輻射損傷方面的作用和可能的機(jī)制。

1 材料與方法

1．1 動(dòng)物、儀器與材料

動(dòng)物：昆明種小白鼠，雄性，體質(zhì)量（20 ±2）g，清潔級(jí)，四川大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供，生產(chǎn)許可證號(hào)為SCXK（川）2013-026，飼養(yǎng)環(huán)境為晝夜比1∶1循環(huán)飼養(yǎng)，保持室內(nèi)相對(duì)濕度（65±20）%，溫度（25 ±2）℃，適應(yīng)性喂養(yǎng)7 d。所有實(shí)驗(yàn)均經(jīng)醫(yī)院實(shí)驗(yàn)動(dòng)物倫理委員會(huì)審核，均遵守實(shí)驗(yàn)動(dòng)物照料和使用原則。

儀器與設(shè)備：60Co γ輻照源（中國工程物理研究院鈷源輻照技術(shù)有限公司）；Thremo ST16 ST16R型高速冷凍離心機(jī)（美國Thremo公司）；Sysmex XS-1000i全自動(dòng)血液分析儀（日本希森美康株式會(huì)社）；Eppendorf Biomaster4830型移液器（德國Eppendorf公司）；SZ-93 型自動(dòng)雙重純水蒸餾器（上海亞榮生化儀器廠）。

試藥：川芎提取物（由西南科技大學(xué)生命科學(xué)與工程學(xué)院藥物制劑教研室提供）；注射用氨磷?。ù筮B美羅大藥廠，國藥準(zhǔn)字 H20010403，規(guī)格為每支 0．4 g）；丙二醛（MDA）、超氧化物歧化酶（SOD）、谷胱甘肽（GSH，除蛋白）、考馬斯亮藍(lán)蛋白測(cè)定試劑盒均購于南京建成生物工程研究所；其余試劑均為分析純。

1．2 方法

輻照條件：常規(guī)飼養(yǎng)7 d后，除正常組小白鼠外其余各組以60Co γ射線一次性全身照射，劑量為5．0 Gy。

分組及給藥方法［13-15］：設(shè)正常組 （A 組）、模型組（B 組）、氨磷汀組［C 組，100 mg／（kg·d）］和不同劑量［100，200，400 mg／（kg·d）］川芎提取物組（D1組，D2組，D3組），各40只，輻射照射前連續(xù)5d灌胃給藥，每天1次（A組及B組給予等體積蒸餾水），每次0．5 mL。

外周血檢測(cè)：分別取照射后第3，7天的各組小鼠，每組10只，眼眶取血，測(cè)定外周血白細(xì)胞（WBC）數(shù)與淋巴細(xì)胞（L）數(shù)。

肝組織中蛋白質(zhì)含量測(cè)定：取照射24，48，72，168 h后各組活體小鼠的肝臟，用2～8℃生理鹽水漂洗，濾紙吸干，稱定質(zhì)量，剪碎后放入勻漿器中，加入生理鹽水（比例為1∶9）制備成勻漿，離心10 min，取上清液備用。依照試劑盒說明書測(cè)定。

氧化應(yīng)激指標(biāo)測(cè)定：取各組小鼠肝組織勻漿液，依照試劑盒說明書分別測(cè)定MDA，SOD，GSH。

1．3 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

采用SPSS 13．0統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件。數(shù)據(jù)均以表示，行單因素方差分析。P＜0．05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

結(jié)果見表1至表5。

3 討論

輻射可直接導(dǎo)致細(xì)胞DNA鏈斷裂，從而導(dǎo)致基因突變、染色體畸變甚至機(jī)體死亡。輻射還可作用于水分子，產(chǎn)生自由基，自由基通過損傷DNA改變細(xì)胞結(jié)構(gòu)，最終導(dǎo)致細(xì)胞死亡［16］。如今人們常與不同形式的輻射如電離輻射、紫外線等接觸，機(jī)體受輻射損傷的概率增加，如何減少輻射損傷及加強(qiáng)醫(yī)學(xué)防護(hù)正逐漸受到重視。

白細(xì)胞和淋巴細(xì)胞作為參與機(jī)體免疫調(diào)節(jié)和免疫應(yīng)答的免疫細(xì)胞，對(duì)輻射敏感性高，表現(xiàn)為輻射后數(shù)量下降，而這一特點(diǎn)已成為評(píng)估輻射損傷的生物劑量指標(biāo)［17-18］。本研究結(jié)果顯示，小鼠受60Co γ射線輻射72 h和168 h后，外周血白細(xì)胞和淋巴細(xì)胞的數(shù)量均顯著降低，與已有研究結(jié)果一致。

表1 各組小鼠免疫細(xì)胞數(shù)量變化比較（±s，×109，n＝10）

表1 各組小鼠免疫細(xì)胞數(shù)量變化比較（±s，×109，n＝10）

注：與 A 組比較，＃P ＜ 0．05，＃＃P ＜ 0．01；與 B 組比較，*P ＜0．05，**P ＜ 0．01。下表同。

組別 劑量［mg／（kg·d）］照射72 h 照射168 h L L A組B組- -C組D1組D2組D3組100 100 200 400 WBC 6．42 ± 1．08 1．13 ± 0．64＃＃0．58 ±0．27 1．66 ±0．16 1．68 ± 0．37 1．32 ±0．32 5．12 ±0．76 0．36 ± 0．47＃＃*0．52 ±0．25＃＃0．49 ±0．31＃＃*0．64 ± 0．32＃＃*0．99 ±0．32＃＃*WBC 6．11 ± 1．03 0．98 ± 0．42＃＃2．21 ± 0．35＃＃*2．08 ± 0．54＃＃3．12 ± 0．37＃＃*3．22 ± 0．41＃＃*5．01 ± 0．60 1．46 ± 0．72＃＃*2．73 ±1．17＃＃*2．58 ±0．44＃＃*2．93 ± 1．06＃＃*2．88 ±1．18＃＃*

表2 各組小鼠肝組織蛋白質(zhì)含量比較（±s，g／L，n ＝10）

表2 各組小鼠肝組織蛋白質(zhì)含量比較（±s，g／L，n ＝10）

組別 劑量［mg／（kg·d）］ 照射24 h 照射48 h 照射72 h 照射168 h A組B組- -C組D1組D2組D3組100 100 200 400 7．49 ±0．76 7．37 ± 0．74 7．46 ±0．82 7．23 ±0．66 8．06 ± 0．75 8．03 ±0．63 7．50 ±0．78 7．18 ± 0．84 7．32 ±0．68 6．84 ±0．75 7．45 ± 0．87 7．34 ±0．54 7．52 ±0．97 1．95 ± 1．64＃＃3．05 ±0．85＃＃2．63 ±0．78＃＃*3．28 ± 0．67＃＃*3．31 ±0．61＃＃*7．94 ± 0．82 2．01 ± 1．23＃＃3．63 ± 0．71＃＃*2．88 ± 0．56＃＃*3．85 ± 0．43＃＃*3．82 ± 0．38＃＃*

目前已知可作為抗輻射損傷的藥物作用靶點(diǎn)包括增強(qiáng)DNA修復(fù)、減少自由基的形成、保護(hù)劑SOD等［9］。川芎可減少中波紫外線（UVB）對(duì)HaCaT細(xì)胞的損傷，作用機(jī)制可能與影響p53和PCNA基因mRNA和蛋白表達(dá)有關(guān)［19］。川芎不但可減輕UVB對(duì)皮膚的損傷，還可抑制炎性因子 IL-10，IL-12，TNF-α 的分泌［20］。此外，李玉亮［21］還發(fā)現(xiàn)，川芎提取物可顯著清除化學(xué)發(fā)光體系產(chǎn)生的·OH和O2-·，具有較強(qiáng)的抗氧化作用。本研究結(jié)果顯示，小鼠受60Co γ射線輻射72 h和168 h后，低、中、高劑量川芎提取物對(duì)輻射所致小鼠外周血白細(xì)胞數(shù)量、淋巴細(xì)胞數(shù)量降低均有一定阻遏作用，提示川芎提取物對(duì)60Co γ射線輻射損傷有一定防護(hù)作用。

低劑量60Co γ射線使小鼠的氧化應(yīng)激水平升高，其中以肝臟最明顯［21］。本研究結(jié)果顯示，其他組小鼠輻射24 h和48 h后，肝組織的總蛋白質(zhì)含量與正常組小鼠無顯著差異，不同劑量的川芎提取物對(duì)肝組織蛋白含量也無影響。這可能是由于經(jīng)短時(shí)間輻射后，小鼠的造血和免疫功能得以快速重建，可一定程度抵御輻射損傷［22］。輻射72 h和168 h后，小鼠肝組織的總蛋白質(zhì)含量顯著降低，不同劑量的川芎提取物均可緩解肝組織總蛋白質(zhì)含量的降低。提示川芎提取物對(duì)長時(shí)間輻射引起的肝組織蛋白質(zhì)含量降低有更明顯的保護(hù)作用。

表3 各組小鼠肝組織MDA含量比較（±s，nmol／mg，n ＝ 10）

表3 各組小鼠肝組織MDA含量比較（±s，nmol／mg，n ＝ 10）

組別 劑量［mg／（kg·d）］ 照射24 h 照射48 h 照射72 h 照射168 h A組B組- -C組D1組D2組D3組100 100 200 400 0．56±0．23 0．65±0．25＃＃0．58±0．12＃＃*0．54±0．13＃＃*0．61±0．27＃＃*0．56±0．16＃＃*0．67±0．18 0．88±0．16＃＃0．62±0．21＃＃*0．78 ±0．11＃＃**0．68±0．24＃＃**0．75±0．26＃＃**1．02 ±0．35 1．56 ±0．34＃1．01 ±0．14＃*1．27 ±0．16＃*1．04 ±0．20＃*1．06 ±0．15＃*1．07±0．36 1．78±0．28＃1．03±0．21＃＃*1．19±0．25＃1．09±0．22＃*0．98±0．21＃*

表4 各組小鼠肝組織SOD活性比較（±s，U ／mg，n ＝10）

表4 各組小鼠肝組織SOD活性比較（±s，U ／mg，n ＝10）

組別 劑量［mg／（kg·d）］ 照射24 h 照射48 h 照射72 h 照射168 h A組B組- -C組D1組D2組D3組100 100 200 400 80．25±5．76 40．12±3．54＃＃42．25±3．14 40．46±3．07 44．51±2．62＃*45．12±2．53＃*75．35±5．34 35．32±4．23＃＃37．30±3．54*34．28±3．12*43．09±3．46＃*44．51±2．54＃*72．77±6．56 28．50±3．24＃＃36．76±3．07*32．20±3．22*38．46±3．50＃*40．02±3．86＃*77．44±6．82 32．86±2．79＃＃50．88±4．68 43．63±4．99 49．27±2．79＃**52．46±2．76＃**

表5 各組小鼠肝組織GSH活性比較（X ±s，mg／g，n＝10）

在電離輻射條件下，機(jī)體抗氧化機(jī)制被破壞，可致MDA含量增加［23］。MDA細(xì)胞內(nèi)脂質(zhì)過氧化物的降解產(chǎn)物，可直接反映機(jī)體脂質(zhì)過氧化水平及細(xì)胞受自由基攻擊的程度［24］。SOD可清除過量的自由基，提高機(jī)體細(xì)胞免疫能力。輻射可促使機(jī)體產(chǎn)生超氧陰離子自由基，機(jī)體SOD平衡被打破，從而造成機(jī)體組織細(xì)胞過氧化損傷［25］。而能消除氧自由基的GSH在細(xì)胞自我保護(hù)系統(tǒng)及DNA合成中同樣發(fā)揮著重要作用。升高GSH含量來修復(fù)氧化損傷已是減輕輻射損傷方案的一個(gè)組成部分［26］。本研究結(jié)果顯示，小鼠經(jīng)60Co γ 輻射 24，48，72，168 h后，肝組織的MDA含量明顯增高，SOD和GSH活性均明顯降低，且不同劑量的川芎提取物對(duì)上述指標(biāo)的降低均有一定逆轉(zhuǎn)作用。

以上研究結(jié)果表明，川芎提取物對(duì)輻射引起的氧化應(yīng)激損傷有保護(hù)作用，且與輻射時(shí)間的長短無關(guān)。同時(shí)，氧化應(yīng)激反應(yīng)對(duì)輻射比較敏感，短時(shí)間輻射即可增強(qiáng)小鼠機(jī)體的氧化反應(yīng)。

綜上所述，川芎提取物對(duì)60Co γ射線輻射損傷的小鼠具有一定保護(hù)作用，其作用機(jī)制可能與川芎提取物的抗氧化及增強(qiáng)免疫作用有關(guān)。此研究結(jié)果可為進(jìn)一步開展抗輻射損傷的藥物研究提供參考。