徐阿奇，周櫻子，朱秋勁*

（貴州省農(nóng)畜產(chǎn)品貯藏與加工重點實驗室，貴州大學(xué)釀酒與食品工程學(xué)院，貴州 貴陽 550025）

牛肉營養(yǎng)價值較高，富含許多礦物質(zhì)及B族維生素，蛋白質(zhì)含量通常在20%以上，氨基酸組成接近人體，更容易被吸收[1-3]。隨著生活水平的提高，牛肉的消費量也逐年增大。牛肉醬作為一種調(diào)味品深受消費者的喜愛，品種也不斷推陳出新[4-6]，但在貯藏過程中出現(xiàn)的脂肪氧化酸敗、蛋白質(zhì)分解及微生物大量繁殖會引起牛肉醬的腐敗變質(zhì)[7]。在生產(chǎn)過程中通常加入防腐劑，以延長食品的貨架期。防腐劑是一類能夠抑制微生物活動、防止食品腐敗變質(zhì)、延長食品貨架期的食品添加劑[8]。由于消費者希望食品更健康、更天然，在食品中使用天然來源的添加劑變得越來越流行[9-10]。

山胡椒，樟科木姜子屬，又名木姜子、山蒼子或山雞椒。在我國主要分布在貴州、廣東、廣西、福建、江西、江蘇、浙江、湖南、云南和四川等省[11]。山胡椒油具有獨特的檸檬香氣和生物活性。山胡椒對金黃色葡萄球菌、大腸桿菌和霉菌等有較強(qiáng)的抑菌作用[12]。Liu Taiti等[13]的研究表明，無論在食品體系外還是體系內(nèi)，山胡椒油均對副溶血性弧菌和植物乳桿菌等具有抗菌活性。楊欽滟[14]、鐘艷梅[15]等分別用山胡椒油處理肉脯和冷鮮豬肉，結(jié)果表明，在一定貯藏條件下，山雞椒油在肉品貯藏過程中具有很好的防腐保鮮作用。山胡椒具有治療心血管疾病[16-17]、關(guān)節(jié)炎、抗HIV及鎮(zhèn)咳祛痰等作用[18-19]。本研究將山胡椒油加入到牛肉醬中，代替化學(xué)防腐劑，以提升牛肉醬的風(fēng)味、營養(yǎng)價值及安全性，延長其貨架期，從而吸引更多的消費者。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

牛肉、豆瓣醬、小米辣、香菇、花生、洋蔥等食材與調(diào)料 貴陽花溪星力超市；純山胡椒油 伍福記。

三氯乙酸、硫代巴比妥酸 國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司；乙二胺四乙酸二鈉、Solarbio平板計數(shù)瓊脂培養(yǎng)基上海博微生物科技有限公司；氯化鈉、碳酸鉀、阿拉伯膠、甘油 天津致遠(yuǎn)化學(xué)試劑有限公司；硼酸 天津市永大化學(xué)試劑有限公司；鹽酸、三氯甲烷 重慶川東化工（集團(tuán)）有限公司；乙醇 天津市富宇精細(xì)化工有限公司；甲基紅指示劑、亞甲基藍(lán)指示劑 成都金山化學(xué)試劑有限公司；以上試劑均為分析純。

1.2 儀器與設(shè)備

CP214電子分析天平 美國奧豪斯儀器有限公司；LRH-150恒溫培養(yǎng)箱 上海一恒科技有限公司；H22-X3電磁爐 九陽股份有限公司；QSJ-B02R1絞肉機(jī) 廣東小熊電器有限公司；testo-205 pH計 德圖儀表（深圳）有限公司；YA28X-4T/10立式蒸汽滅菌鍋、TG16-WS離心機(jī) 上海盧湘儀儀器有限公司；HH-3D數(shù)顯恒溫水浴鍋 江蘇科析儀器有限公司。

1.3 方法

1.3.1 牛肉醬制作工藝流程

1.3.2 牛肉醬制作操作要點

1.3.2.1 原料制備

牛肉?。哼x取新鮮牛里脊肉，清洗后去除筋膜，切成4 mm左右見方的肉丁，加入生粉、胡椒粉和老抽，攪拌均勻，備用。

香菇：選取體圓齊整、菌傘肥厚、蓋面平滑下卷的香菇，清洗、去除根部，瀝干后切成4 mm左右見方的小丁，備用。

小米辣：選取新鮮、表皮飽滿、色澤鮮艷的小米辣，清洗去根，切成4 mm左右片狀，備用。

洋蔥：選取新鮮洋蔥，剝皮去根，切成4 mm左右片狀，備用。

花生：選取表面光滑、豆粒飽滿的優(yōu)質(zhì)花生，放入保鮮袋中敲打揉搓去皮后切成小丁，備用。

大蒜：去皮，拍碎，切成蒜末，備用。

生姜：清洗去皮，切片，備用。豆瓣醬：按牛肉質(zhì)量的20%稱取豆瓣醬，放置備用。番茄醬：按牛肉質(zhì)量的12%稱取番茄醬，放置備用。

1.3.2.2 炒制

加入適量食用油于鍋中，待油溫至8成時，加入姜片、蒜末、小米辣炒出香味，然后加入豆瓣醬翻炒出醬香，再加入預(yù)先攪拌好的牛肉糜繼續(xù)翻炒4 min左右，加入香菇、洋蔥和水，煮沸8 min左右，加入少許白糖和番茄醬，小火收汁，加入花生，翻炒出鍋。炒制過程中要注意火候的控制與加入的水量，火候過大或加水量太少容易產(chǎn)生焦糊味，影響產(chǎn)品風(fēng)味；加水量過多，不易收汁，導(dǎo)致加工時間過長，影響產(chǎn)品口感。

1.3.2.3 裝瓶、添加山胡椒油

將炒制好的牛肉醬趁熱裝入已滅菌的玻璃罐中，約8 分滿，便于添加山胡椒油后進(jìn)行攪拌；添加山胡椒油，攪拌均勻后立即擰緊瓶蓋。

1.3.3 指標(biāo)測定

1.3.3.1 硫代巴比妥酸（thiobarbituric acid，TBA）值

參照馬儷珍等[20]的方法。取10 g樣品研磨，加入50 mL 7.5%三氟乙酸溶液（含0.1% EDTA），振搖30 min，雙層濾紙過濾2 次；取5 mL上清液，加入5 mL TBA溶液（0.02 mol/L），于沸水浴中保溫40 min，冷卻；1 600 r/min條件下離心5 min，加入5 mL三氯甲烷，搖勻，靜置分層；取上清液，分別于532、600 nm波長處測定吸光度。TBA值按照公式（1）計算。

1.3.3.2 pH值

采用便攜式pH計（testo 205）測定。每個樣品選取3 個位置進(jìn)行測定，取平均值。

1.3.3.3 揮發(fā)性鹽基氮（total volatile base nitrogen，TVB-N）含量

參照GB 5009.228—2016《食品安全國家標(biāo)準(zhǔn) 食品中揮發(fā)性鹽基氮的測定》中的微量擴(kuò)散法測定。

1.3.3.4 菌落總數(shù)

參照GB 4789.2—2016《食品安全國家標(biāo)準(zhǔn) 食品微生物學(xué)檢驗 菌落總數(shù)測定》測定。

1.3.4 山胡椒油添加量的確定

通過感官評定和抗氧化效果（測定TBA值）兩方面來確定牛肉醬中山胡椒油的添加量。

1.3.4.1 感官評定

制作牛肉醬并添加山胡椒油，山胡椒油的添加量分別為0.5、1.0、1.5、2.0、2.5、3.0 μL/g。選20 名具有感官評定相關(guān)背景知識的人員根據(jù)表1進(jìn)行感官評定。

表 1 添加山胡椒油牛肉醬風(fēng)味的感官評定標(biāo)準(zhǔn)Table 1 Criteria for fl avor evaluation of beef sauce with Litsea cubeba oil

1.3.4.2 添加山胡椒油牛肉醬的TBA值測定

將添加山胡椒油制作的牛肉醬貯藏在20 ℃條件下，每3 d測定1 次TBA值。

1.3.5 貨架期預(yù)測模型的建立

1.3.5.1 一級動力學(xué)方程

食品的品質(zhì)變化通常符合零級和一級反應(yīng)，一級反應(yīng)動力學(xué)模型應(yīng)用比較普遍[21]，如公式（2）所示。

式中：A為山胡椒油牛肉醬在貯藏t d時的品質(zhì)指標(biāo)；A0為山胡椒油牛肉醬的初始品質(zhì)指標(biāo)；kb為山胡椒油牛肉醬的品質(zhì)變化速率（常數(shù)）；t為山胡椒油牛肉醬的貯藏時間/d。

1.3.5.2 Arrhenius方程

熱力學(xué)溫度T和反應(yīng)變化速率常數(shù)k之間的關(guān)系可以通過Arrhenius方程反映[22-24]，如公式（3）所示。

式中：k0為頻率因子；Ea為活化能/（J/mol）；R為氣體常數(shù)（8.314 4 J/（mol·K））；T為絕對溫度/K。

1.3.5.3 不同溫度條件下山胡椒油牛肉醬貯藏實驗

按照山胡椒油最佳添加量配比制作山胡椒油牛肉醬，分別貯藏在18、28、38 ℃條件下，定期測定各溫度條件下山胡椒油牛肉醬的TBA值，并選10 名具有感官評定相關(guān)背景知識的人員根據(jù)表2進(jìn)行感官評定。

表 2 山胡椒油牛肉醬的感官評定標(biāo)準(zhǔn)Table 2 Criteria for sensory evaluation of beef sauce with Litsea cubeba oil

1.4 數(shù)據(jù)處理

數(shù)據(jù)統(tǒng)計分析及繪圖均采用Origin 9.6軟件。

2 結(jié)果與分析

2.1 山胡椒油最佳添加量的確定

2.1.1 不同山胡椒油添加量牛肉醬的感官評定結(jié)果

圖 1 不同山胡椒油添加量牛肉醬的感官評分Fig. 1 Sensory evaluation scores of beef sauce with different concentrations of Litsea cubeba oil

由圖1可知，隨著山胡椒油添加量的增加，山胡椒油牛肉醬的感官評分先上升后下降。山胡椒油添加量在1.0～1.5 μL/g范圍內(nèi)的感官評分較高，且與未添加山胡椒油組相比差異顯著（P＜0.05），此時牛肉醬整體風(fēng)味較佳，既具有山胡椒獨特的清香，又不會掩蓋牛肉自身的香氣。

2.1.2 不同山胡椒油添加量牛肉醬的TBA值測定結(jié)果

圖 2 不同山胡椒油添加量牛肉醬的TBA值變化Fig. 2 Changes in TBA value of beef sauce with different concentrations of Litsea cubeba oil

由圖2可知：當(dāng)山胡椒油的添加量為0.5 μL/g時，測得的山胡椒油牛肉醬的TBA值與空白組差異不顯著（P＞0.05）；山胡椒油的添加量為1.0 μL/g時，牛肉醬的TBA值始終低于對照組，第4天起，添加1.0 μL/g山胡椒油組牛肉醬的TBA值顯著低于空白組（P＜0.05），這是由于山胡椒油具有良好的抗氧化效果[25]；當(dāng)山胡椒油添加量較大時，牛肉醬的TBA值反而會增大，這可能是由于山胡椒在抗氧化過程中自身也被氧化，形成的自由基和強(qiáng)氧化性的氧化物逐漸積累所致。雖然在第7天和第10天測定了對照組的TBA值，但是在第7天時，對照組的牛肉醬已經(jīng)出現(xiàn)酸敗，而實驗組均正常。當(dāng)測定至第10天時，對照組牛肉醬產(chǎn)生霉菌，山胡椒油添加量為2.0～3.0 μL/g的牛肉醬發(fā)生酸敗。因此，綜合感官評定及TBA值的測定結(jié)果，牛肉醬中山胡椒油的最適宜添加量為1.0 μL/g。

2.2 貯藏期間山胡椒油牛肉醬的理化指標(biāo)變化

2.2.1 pH值變化

圖 3 山胡椒油牛肉醬貯藏期間的pH值變化Fig. 3 Changes in pH value of beef sauce with Litsea cubeba oil during storage

由圖3可知，貯藏期間空白組牛肉醬（即未添加山胡椒油）的pH值先上升后下降，實驗組牛肉醬（添加山胡椒油）的pH值略有上升但變化不大，且貯藏至第7天時，空白組牛肉醬的pH值極顯著高于實驗組（P＜0.01）。這是由于在貯藏期間，空白組牛肉醬由于酶和微生物的作用導(dǎo)致蛋白質(zhì)分解產(chǎn)生氨及胺等堿性物質(zhì)[26-28]，pH值上升，貯藏一段時間后，脂肪酸敗嚴(yán)重，產(chǎn)生大量酸性物質(zhì)，導(dǎo)致pH值下降；而實驗組牛肉醬在檢測期間品質(zhì)未發(fā)生明顯變化，因此pH值變化不明顯。

2.2.2 TVB-N含量變化

圖 4 山胡椒油牛肉醬貯藏期間的TVB-N含量變化Fig. 4 Changes in TVB-N content of beef sauce with Litsea cubeba oil during storage

由圖4可知，在貯藏期間，空白組與實驗組牛肉醬的TVB-N含量均呈現(xiàn)持續(xù)上升的趨勢，且空白組始終大于實驗組，且高出36%以上。

圖 5 山胡椒油牛肉醬貯藏期間TVB-N含量的增長幅度Fig. 5 Percentage increase in TVB-N content of beef sauce with Litsea cubeba oil during storage

由圖5可知，空白組牛肉醬TVB-N含量的增長幅度遠(yuǎn)大于實驗組。貯藏第4天時，空白組牛肉醬的TVB-N含量增幅約為實驗組的7 倍，差異極顯著（P＜0.01）。由于貯藏過程中蛋白質(zhì)逐漸被分解為氨及胺類等堿性物質(zhì)[26]，空白組牛肉醬的TVB-N含量升高顯著，實驗組牛肉醬在此期間品質(zhì)未發(fā)生明顯變化，故TVB-N含量遠(yuǎn)低于空白組，這與pH值測定結(jié)果一致。

2.2.3 菌落總數(shù)變化

圖 6 山胡椒油牛肉醬貯藏期間的菌落總數(shù)變化Fig. 6 Changes in TBC of beef sauce with Litsea cubeba oil during storage

牛肉醬的起始菌落總數(shù)為零。由圖6可知，在貯藏過程中，菌落總數(shù)呈指數(shù)上升趨勢，且空白組始終大于實驗組。當(dāng)貯藏至第9天時，空白組牛肉醬的菌落總數(shù)已超過GB 2726—2016《食品安全國家標(biāo)準(zhǔn) 熟肉制品》限值（105CFU/g），而實驗組的菌落總數(shù)在貯藏第12天時仍低于GB 2726—2016限值。

2.3 山胡椒油牛肉醬的貨架期預(yù)測模型建立

2.3.1 不同貯藏溫度下山胡椒油牛肉醬的感官品質(zhì)變化由圖7可知，隨著貯藏溫度和貯藏時間的增加，山胡椒油牛肉醬的品質(zhì)逐漸下降，溫度越高，山胡椒油牛肉醬變質(zhì)越快。在18 ℃條件下，貯藏37 d時山胡椒油牛肉醬有油脂析出，酸敗明顯，有霉菌產(chǎn)生；在28 ℃條件下，由于溫度較高，加速了脂肪的氧化，山胡椒油牛肉醬在貯藏12 d時即達(dá)到感官不可接受水平；在38 ℃條件下，山胡椒油牛肉醬僅能貯藏3 d。

圖 7 不同貯藏溫度下山胡椒油牛肉醬的感官評分Fig. 7 Sensory evaluation scores of beef sauce with Litsea cubeba oil at different storage temperatures

圖 8 不同貯藏溫度下山胡椒油牛肉醬的TBA值變化Fig. 8 Changes in TBA values of beef sauce with Litsea cubeba oil at different storage temperatures

2.3.2 不同貯藏溫度下山胡椒油牛肉醬的TBA值變化由圖8可知，隨著貯藏時間的增加，山胡椒油牛肉醬的TBA值呈現(xiàn)持續(xù)上升的趨勢，貯藏溫度越高，TBA值的增長速率越快。溫度越高，脂肪氧化速率越快，因此溫度越高，TBA值越大[29]。

2.3.3 貨架期預(yù)測模型的建立

表 3 不同貯藏溫度下山胡椒油牛肉醬的TBA值變化回歸方程Table 3 Regression equations describing TBA changes of beef sauce with Litsea cubeba oil at different storage temperatures

由表3可知，在18、28、38 ℃條件下，TBA的反應(yīng)速率常數(shù)（k）分別為0.003 64、0.007 96和0.016 75。以不同溫度下k的對數(shù)（lnk）對貯藏溫度的倒數(shù)（1/T）作圖。

由圖9可知，線性方程為y=－6.954 5x＋18.239 0（R2=0.9 9 9 7）。由此，得T B A變化的活化能Ea=5.78×104J/mol，頻率因子k0=8.34×107。因此，不同貯藏溫度下山胡椒油牛肉醬的TBA值變化速率常數(shù)（k）與貯藏溫度（T）之間的Arrhenius方程為k=8.34×107×exp（－5.78×104/RT）。

因此，當(dāng)山胡椒油牛肉醬的貯藏溫度確定時，由上述Arrhenius方程即可求出該溫度下的TBA變化速率常數(shù)，并根據(jù)山胡椒油牛肉醬TBA的初始值及該溫度下貯藏一段時間后山胡椒油牛肉醬的TBA值，結(jié)合公式（2）得到該溫度下山胡椒油牛肉醬的貯藏時間。當(dāng)TBA值＞0.5 mg/kg時，脂肪開始氧化，TBA值＞3.0 mg/kg時，可判定肉制品已腐敗變質(zhì)[26]。本研究中，當(dāng)TBA值為0.28 mg/100 g時，樣品即達(dá)到感官不可接受水平，因此，將山胡椒油牛肉醬到達(dá)感官終點時的TBA作為貨架期終點，這樣更有利于保證產(chǎn)品的品質(zhì)。

圖 9 山胡椒油牛肉醬在不同貯藏溫度下TBA值的Arrhenius曲線Fig. 9 Arrhenius curves for TBA values of beef sauce with Litsea cubeba oil at different storage temperatures

2.3.4 貨架期預(yù)測模型的驗證

將山胡椒油牛肉醬分別放置于20、25、38 ℃條件下貯藏，根據(jù)山胡椒油牛肉醬貨架期模型預(yù)測其貨架期，并與實測值進(jìn)行比較。

表 4 不同貯藏溫度下山胡椒油牛肉醬貨架期的預(yù)測值與實測值比較Table 4 Comparison of predicted and measured values of shelf life of beef sauce with Litsea cubeba oil at different temperatures

由表4可知，20、25、38 ℃條件下山胡椒油牛肉醬的貨架期預(yù)測值分別為38.0、20.9、3.5 d，實測值分別為32.0、18.0、3.0 d，相對誤差分別為18.75%、16.11%和16.67%，表明該模型能較好地預(yù)測山胡椒油牛肉醬的貨架期。在20、25、38 ℃條件下，空白組牛肉醬的貨架期為11、6、1 d。在20 ℃和25 ℃條件下，山胡椒油牛肉醬的貨架期極顯著長于空白組（P＜0.01）。

3 結(jié) 論

通過對不同山胡椒油添加量的牛肉醬進(jìn)行感官評定及貯藏過程中TBA值的測定，確定出山胡椒油的最適宜添加量為1.0 μL/g。在貯藏期間，山胡椒油牛肉醬的pH值先上升后下降，且始終低于空白組；TVB-N含量及菌落總數(shù)呈現(xiàn)持續(xù)上升趨勢，但遠(yuǎn)小于空白組。說明在牛肉醬中添加山胡椒油具有良好的防腐保鮮作用。測定山胡椒油牛肉醬在不同貯藏溫度下的TBA值，結(jié)合一級動力學(xué)方程及Arrhenius方程建立貨架期預(yù)測模型，通過計算得到TBA變化的活化能Ea=5.78×104J/mol，頻率因子k0=8.34×107，因此TBA變化速率常數(shù)（k）與貯藏溫度（T）之間的Arrhenius方程為k=8.34×107×exp（－5.78×104/RT）。根據(jù)建立的預(yù)測模型預(yù)測20、25、38 ℃條件下貯藏山胡椒油牛肉醬的貨架期分別為38.0、20.9、3.5 d，與實測值較一致。添加山胡椒油后能顯著延長牛肉醬貨架期。

本研究采用日常餐飲的加工烹飪方式，為更貼近餐飲業(yè)實際并防止高溫高壓處理后牛肉過于軟爛，在罐裝后并未采取高溫高壓的滅菌方式來處理牛肉醬。工業(yè)生產(chǎn)時，若能結(jié)合適當(dāng)?shù)臏缇に?，并在密閉空間中實現(xiàn)山胡椒油的添加，在保證山胡椒油牛肉醬最佳營養(yǎng)風(fēng)味及口感的基礎(chǔ)上，又能對其進(jìn)行滅菌處理，產(chǎn)品貨架期會有一定程度的延長。