劉立兵，石蕊寒，項(xiàng)佳林，孫曉霞，付 琦，王金鳳，周 巍，王素華，郭春海，王建昌,*

（1.石家莊海關(guān)，河北 石家莊 050051；2.河北省檢驗(yàn)檢疫科學(xué)技術(shù)研究院，河北 石家莊 050051；3.河北省食品檢驗(yàn)研究院，河北 石家莊 050200；4.溫州海關(guān)，浙江 溫州 325000）

肉及肉制品摻假事件已是屢見不鮮，也是國內(nèi)外關(guān)注的食品安全熱點(diǎn)問題之一。肉類摻假嚴(yán)重干擾肉類的市場流通，侵害消費(fèi)者權(quán)益、健康甚至宗教信仰[1-3]。歐盟定量成分聲明（Quantitative Ingredient Declaration，QUID）、美國食品藥品監(jiān)督管理局（Food and Drug Administration，F(xiàn)DA）以及我國食品安全法中關(guān)于肉制品成分標(biāo)識相關(guān)內(nèi)容均有明確規(guī)定[4-6]，然而在巨大經(jīng)濟(jì)利益的驅(qū)使下，不少不法分子仍然鋌而走險(xiǎn)，制假售假[7]。

目前，關(guān)于肉源性成分的檢驗(yàn)方法包括近紅外光譜檢測法、色譜分析法、酶聯(lián)免疫分析法和聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（polymerase chain reaction，PCR）檢測方法，其中PCR檢測法由于具有操作簡便快捷、準(zhǔn)確度高、技術(shù)成熟且成本相對低廉等優(yōu)點(diǎn)在國內(nèi)外得到了廣泛應(yīng)用[6,8-9]。肉源性成分PCR檢測法主要分為長度多態(tài)性DNA分析（PCR-restriction fragment length polymorphism，PCRRFLP）、隨機(jī)擴(kuò)增多態(tài)性DNA分析（PCR-random amplified polymorphic DNA，PCR-RAPD）、DNA測序及實(shí)時熒光PCR等[10-12]。我國已將實(shí)時熒光PCR檢測法作為肉源性成分鑒定的標(biāo)準(zhǔn)方法，關(guān)于牛、羊、豬、兔、馬、驢、鹿等動物肉類檢測的國家標(biāo)準(zhǔn)相繼出臺，出入境檢驗(yàn)檢疫系統(tǒng)也出臺了一系列關(guān)于禽類、畜類以及魚類動物的PCR行業(yè)檢測標(biāo)準(zhǔn)，但是相關(guān)標(biāo)準(zhǔn)中的方法均是對于DNA的定性檢測[13-14]。

實(shí)時熒光PCR技術(shù)可以實(shí)現(xiàn)對于摻假肉成分的定量分析，但需要建立標(biāo)準(zhǔn)曲線，根據(jù)樣本擴(kuò)增的循環(huán)閾（cyclic threshold，Ct）值粗略計(jì)算DNA含量，操作程序較為復(fù)雜，并且實(shí)時檢測采集熒光信號在很大程度上會受到PCR擴(kuò)增效率的影響，從而導(dǎo)致檢測值與真實(shí)值存在較大差別，因此在檢測靈敏度和準(zhǔn)確度方面均有所欠缺。相對于實(shí)時熒光PCR，近年來興起的微滴式數(shù)字PCR（droplet digital PCR，ddPCR）方法通過將PCR體系微滴化，對于每一個微滴進(jìn)行有無熒光信號的終點(diǎn)檢測，受PCR擴(kuò)增效率影響較小[15]。此外，ddPCR不需要建立標(biāo)準(zhǔn)曲線，根據(jù)泊松分布能夠精確得出目的基因的起始拷貝數(shù)，實(shí)現(xiàn)DNA的絕對定量分析。ddPCR被應(yīng)用于微生物[16]、轉(zhuǎn)基因[17]、物種鑒定[18]和醫(yī)學(xué)[19]等各個領(lǐng)域，在肉類摻假檢測中也被廣泛應(yīng)用。王珊[20]、Ren Junan[21]等的研究表明，在肉種成分真?zhèn)舞b定上，ddPCR相較于實(shí)時熒光PCR更加科學(xué)、準(zhǔn)確。目前，應(yīng)用ddPCR對肉源性成分進(jìn)行定量檢測主要有2 種方法，一種是建立標(biāo)準(zhǔn)曲線法，另一種是確定固定比值法。蔡一村[14]、苗麗[22-23]等采用建立標(biāo)準(zhǔn)曲線法，通過進(jìn)行肉制品質(zhì)量與核酸含量以及核酸含量與基因拷貝數(shù)兩步轉(zhuǎn)換，將樣本基因拷貝數(shù)換算為肉制品質(zhì)量，有良好的準(zhǔn)確性。任君安等[24]通過計(jì)算單位質(zhì)量羊肉和豬肉中RPA1基因拷貝數(shù)之比這一固定值，無需兩步轉(zhuǎn)換即可通過樣本基因拷貝數(shù)之比計(jì)算相對質(zhì)量占比，操作簡化、快捷，并且具有更好的定量準(zhǔn)確性。面對如今越來越多的對于摻假肉或肉制品中各種肉類真實(shí)含量的檢測需求，ddPCR的實(shí)際應(yīng)用價(jià)值備受關(guān)注。

相對于豬肉，牛肉的蛋白質(zhì)含量較高，脂肪含量較低，其氨基酸組成相較于其他常見食用肉類更接近人體需求，由于市場供需的影響，其價(jià)格也遠(yuǎn)高于雞肉、鴨肉、豬肉及其他畜禽肉，因此牛肉中摻雜雞肉[25]、鴨肉[26]、豬肉[27-28]及其他畜禽肉[29]的現(xiàn)象尤為常見。本研究參照GB/T 25165—2010《明膠中牛、羊、豬源性成分的定性檢測方法 實(shí)時熒光PCR法》[30]合成豬單拷貝核基因PRNP以及牛單拷貝核基因GH引物探針，通過ddPCR方法檢測單位質(zhì)量2 種肉樣的基因拷貝數(shù)，并驗(yàn)證二者比值為一固定值，通過該固定比值來確定2 種肉樣的摻雜質(zhì)量之比，實(shí)現(xiàn)牛肉中摻雜豬肉成分的準(zhǔn)確定量檢測，為相關(guān)部門的監(jiān)測管理提供技術(shù)支持。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

牛肉、豬肉、山羊肉、綿羊肉、雞肉、鴨肉、鵝肉、馬肉、兔肉及狗肉樣品均保存于實(shí)驗(yàn)室，牛肉腸、牛肉卷、牛肉干和牛肉粒樣品均購于超市。

DNA提取試劑盒（Wizard Magnetic DNA Purification System for Food） 美國Promega公司；引物和探針生工生物工程（上海）股份有限公司；擴(kuò)增預(yù)混液（ddPCRTMSupermix for Probes（no dUTP））、微滴生成油、微滴生成卡、膠蓋及熱封膜 美國Bio-Rad公司；96 孔PCR反應(yīng)板 德國Eppendorf公司。

1.2 儀器與設(shè)備

MM400混合型球磨儀 德國萊馳公司；NanoDrop 2000C超微量分光光度計(jì) 美國Thermo Scientif i c公司；T-Gradient梯度PCR儀 德國Biometra公司；Bio-Rad QX200 ddPCR微滴生成儀、Droplet Reader和PX1熱封儀美國Bio-Rad公司；SQ2119N料理機(jī) 慈溪市西貝樂電器有限公司。

1.3 方法

1.3.1 樣品處理

將肉樣于料理機(jī)中制成肉泥，在65 ℃烘箱中放置16 h烘干，然后置于球磨儀中研磨成粉末，過60 目篩后于4 ℃密封保存，操作過程避免污染。

以精確度為0.1 mg的電子天平稱量豬肉粉和牛肉粉樣本，制備豬肉質(zhì)量分?jǐn)?shù)分別為1%、5%、10%、20%、40%、50%、60%、80%、90%、95%和99%的混合肉樣，每份樣本總質(zhì)量為50 mg。另分別稱取50 mg牛肉、豬肉、山羊肉、綿羊肉、雞肉、鴨肉、鵝肉、馬肉、兔肉、狗肉粉末樣品以及市售牛肉卷、牛肉干、牛肉腸和牛肉粒粉末樣品。

1.3.2 DNA提取和濃度測定

參照Wizard Magnetic DNA Purification System for Food試劑盒操作說明，進(jìn)行肉粉樣品的DNA提取，提取的DNA樣本用超微量分光光度計(jì)測定DNA質(zhì)量濃度，將各個樣品稀釋至DNA質(zhì)量濃度10～100 ng/μL，備用。

1.3.3 引物及探針合成

參照GB/T 25165—2010[30]，合成針對豬PRNP基因及牛GH基因的特異性引物和探針。引物及探針序列如表1所示。

表 1 豬PRNP及牛GH基因PCR檢測用引物和探針Table 1 Primer and probe sequences targeting swine PRNP and bovine GH genes

1.3.4 ddPCR檢測體系的建立

ddPCR反應(yīng)體系如表2所示。20 μL反應(yīng)體系充分混勻后短暫離心，加入到DG8 Cartridge的8 個樣品孔內(nèi)；在每個油孔中加入70 μL微滴生成油，然后蓋上膠墊置于微滴生成儀中生成油包水微滴；將生成的微滴全部轉(zhuǎn)移至96 孔PCR反應(yīng)板中，封膜后進(jìn)行擴(kuò)增，反應(yīng)條件為：95 ℃、 8 min，94 ℃、30 s，60 ℃、1 min，40 個循環(huán)；98 ℃、10 min；4 ℃保存，最后通過微滴讀取儀進(jìn)行讀數(shù)。

表 2 ddPCR擴(kuò)增體系Table 2 Amplif i cation system for ddPCR

1.3.5 引物、探針特異性及靈敏性檢測

采用ddPCR方法，分別用牛GH基因和豬PRNP基因引物探針對牛肉、豬肉、山羊肉等10 種常見食用肉類的DNA進(jìn)行擴(kuò)增，檢測2 種引物探針的特異性。

將提取的豬和牛的DNA做2 倍或10 倍梯度稀釋，使其質(zhì)量濃度在50～0.625 ng/μL范圍內(nèi)，通過ddPCR方法分別對各質(zhì)量濃度牛源和豬源DNA樣本中牛GH基因和豬PRNP基因的拷貝數(shù)進(jìn)行檢測，確定2 種引物探針的檢測靈敏性。

1.3.6 Kp/Kb的計(jì)算

牛G H基因及豬P R N P基因均為單拷貝核基因，因此，理論上單位質(zhì)量豬肉PRNP基因拷貝數(shù)（Kp，Kp=，Qp為豬PRNP基因拷貝數(shù)，Mp為豬肉質(zhì)量）和單位質(zhì)量牛肉GH基因拷貝數(shù)（Kb，Kb=，Qb為牛GH基因拷貝數(shù)，Mb為牛肉質(zhì)量）應(yīng)為一個常數(shù)[23]，二者比值（Kp/Kb，）應(yīng)為一個固定值。根據(jù)這一固定值，可以將通過ddPCR測得的2 種基因拷貝數(shù)Qp和Qb轉(zhuǎn)化為2 種肉類的相對質(zhì)量分?jǐn)?shù)（）。為計(jì)算并確定這一固定值，將豬肉質(zhì)量分?jǐn)?shù)分別為5%、10%、20%、40%、60%、80%、90%的混合肉樣以磁珠法提取DNA，通過ddPCR方法分別檢測豬PRNP基因和牛GH基因拷貝數(shù)，并計(jì)算Kp/Kb。

1.3.7 Kp/Kb的準(zhǔn)確性、重復(fù)性及檢測限確定

稱取5 份豬肉質(zhì)量分?jǐn)?shù)為50%的豬肉、牛肉混合肉樣，提取DNA，通過ddPCR方法檢測豬PRNP基因和牛GH基因的拷貝數(shù)，并根據(jù)1.3.6節(jié)中確定的Kp/Kb比值計(jì)算混合肉樣中豬肉的質(zhì)量分?jǐn)?shù)，對于豬肉質(zhì)量分?jǐn)?shù)的實(shí)際值和檢測值進(jìn)行比較分析。

另取3～6 份豬肉質(zhì)量分?jǐn)?shù)分別為1%、5%、10%、20%、50%、60%、80%、90%、95%、99%的豬肉、牛肉混合樣品，根據(jù)1.3.6節(jié)中確定的Kp/Kb比值計(jì)算豬肉的質(zhì)量分?jǐn)?shù)，并計(jì)算各樣品的絕對誤差、相對誤差、變異系數(shù)（coeff i cient of variation，CV）及回收率[24]，對方法的檢測限進(jìn)行確定。

1.3.8 市售牛肉制品中豬成分的檢測

通過本方法對市售牛肉卷、牛肉干、牛肉腸和牛肉粒等20 份牛肉制品中豬源及牛源性成分進(jìn)行定量檢測，并計(jì)算其中豬源性成分的比例。將市售的3 份牛肉卷、3 份牛肉干、8 份牛肉腸和6 份牛肉粒分別按購買時間進(jìn)行數(shù)字編號。

2 結(jié)果與分析

2.1 牛GH基因及豬PRNP基因引物探針特異性

圖 1 ddPCR方法驗(yàn)證牛GH基因引物探針的特異性Fig. 1 Specif i city of primers and probe targeting bovine GH gene by ddPCR

圖 2 ddPCR方法驗(yàn)證豬PRNP基因引物探針的特異性Fig. 2 Specif i city of primers and probe targeting swine PRNP gene by ddPCR

由圖1～2可知：牛GH基因引物探針對于牛肉樣本顯示出特異性擴(kuò)增，對于豬肉、鴨肉、雞肉及山羊肉等其他9 種肉樣均沒有擴(kuò)增；豬PRNP基因引物探針對于豬肉樣本有特異性擴(kuò)增，對于包括牛肉在內(nèi)的其他9 種肉類樣本均沒有擴(kuò)增，表明2 種引物探針的特異性良好。

2.2 牛GH基因及豬PRNP基因引物探針靈敏性

圖 3 ddPCR方法檢測牛GH基因引物探針的靈敏性Fig. 3 Sensitivity of primers and probe targeting bovine GH gene by ddPCR

圖 4 ddPCR方法檢測豬PRNP基因引物探針的靈敏性Fig. 4 Sensitivity of primers and probe targeting swine PRNP gene by ddPCR

由圖3～4可知，ddPCR方法對牛和豬DNA的檢出限為0.625 ng/μL，陽性拷貝數(shù)分別為（8.4±1.1） copies/μL和（6.7±0.7） copies/μL，CV分別為10.43%和11.36%，均小于25%，表明以該方法檢測牛GH基因及豬PRNP基因具有良好的靈敏性。

2.3 Kp/Kb的計(jì)算及驗(yàn)證

表 3 不同混合肉樣的Kp/Kb測定結(jié)果Table 3 Kp/Kb values of different mixed meat samples

對豬肉質(zhì)量分?jǐn)?shù)分別為5%、10%、20%、40%、60%、80%、90%的豬肉、牛肉混合樣品中豬PRNP基因拷貝數(shù)（Qp）及牛GH基因拷貝數(shù)（Qb）進(jìn)行測定，并計(jì)算Kp/Kb。由表3可知，混合肉樣中Kp/Kb平均值為1.66，檢測的CV為3.46%。

表 4 豬肉質(zhì)量分?jǐn)?shù)為50%的混合肉樣準(zhǔn)確度和精密度測定結(jié)果Table 4 Accuracy and precision in detection of mixed meat samples with 50% pork

制備5 份豬肉質(zhì)量分?jǐn)?shù)為50%的豬肉、牛肉混合肉樣，采用ddPCR方法分別檢測Qp和Qb，以Kp/Kb=1.66作為固定值計(jì)算混合肉樣中豬肉質(zhì)量分?jǐn)?shù)。由表4可知，5 份混合肉樣中豬肉的回收率在99.16%～100.14%之間，豬肉質(zhì)量分?jǐn)?shù)在49.58%～50.07%之間，平均值為49.92%，CV為0.40%。上述結(jié)果表明，應(yīng)用計(jì)算所得Kp/Kb測定豬肉質(zhì)量分?jǐn)?shù)相同的混合肉樣具有很好的準(zhǔn)確度和精密度，可以應(yīng)用該比值進(jìn)行豬肉、牛肉混合肉樣中豬肉質(zhì)量分?jǐn)?shù)的計(jì)算。

2.4 ddPCR方法的檢測限

表 5 以Kp/Kb=1.66計(jì)算不同混合肉樣中豬肉的質(zhì)量分?jǐn)?shù)Table 5 Calculation of pork proportion in blended meat samples by Kp/Kb ratio (1.66)

提取豬肉質(zhì)量分?jǐn)?shù)分別為1%、5%、10%、20%、50%、60%、80%、90%、95%及99%的豬肉、牛肉混合肉樣的DNA，分別測定Qp和Qb，以Kp/Kb=1.66計(jì)算豬肉質(zhì)量分?jǐn)?shù)。由表5可知，當(dāng)豬肉質(zhì)量分?jǐn)?shù)在5%～99%范圍內(nèi)時，根據(jù)本研究確定的Kp/Kb（1.66）計(jì)算混合肉樣中豬肉質(zhì)量分?jǐn)?shù)的絕對誤差≤1.28%，相對誤差≤2.84%，CV＜6.50%，回收率在99.09%～102.80%之間，測量值接近于實(shí)際值。因此，該方法檢測牛肉中摻雜豬肉的最低檢測限為5%，最高檢測限達(dá)99%。

2.5 市售牛肉制品的檢測

以本研究建立的檢測方法對20 份市售牛肉腸、牛肉卷、牛肉干和牛肉粒中的豬肉成分進(jìn)行定量檢測。結(jié)果表明，所有樣品中均檢出牛源性成分，牛肉卷和牛肉干樣品中未檢出豬源性成分，牛肉腸和牛肉粒中檢出豬源性成分。

表 6 市售牛肉制品中豬源性成分的含量檢測結(jié)果Table 6 Quantitative detection of pork in commercial beef products by ddPCR

由表6可知，牛肉腸和牛肉粒中檢出的豬源性成分含量在29.19%～98.15%之間，其中6號牛肉腸中豬源性成分的相對含量低于本方法最低檢測限5%。

3 討 論

隨著食品工業(yè)的發(fā)展，肉類制假摻假層出不窮。各國已有相關(guān)法規(guī)來約束生產(chǎn)者和經(jīng)營者的行為，然而要對肉源性成分是故意添加或無意沾染進(jìn)行準(zhǔn)確判斷以及對肉制品標(biāo)簽中相應(yīng)成分的含量進(jìn)行鑒定核查，必須要建立科學(xué)、快捷的檢測方法，來滿足這些精準(zhǔn)定量檢測需求，并保障相關(guān)法規(guī)的有效執(zhí)行。

靈敏度的檢測是衡量檢測方法的重要指標(biāo)之一。本研究采用ddPCR技術(shù)對GB/T 25165—2010[30]中檢測牛源性成分的GH基因和豬源性成分的PRNP基因進(jìn)行檢測，將模板進(jìn)行不同程度稀釋后檢測基因拷貝數(shù)，分析標(biāo)準(zhǔn)差和CV。結(jié)果表明，在模板質(zhì)量濃度低至0.625 ng/μL時，該方法依然具有良好的檢測靈敏度及準(zhǔn)確性。并且，不同于線粒體多拷貝基因，GH基因與PRNP基因均為核基因，其拷貝數(shù)與肌細(xì)胞數(shù)量成一定比例，可以很好地反映樣本質(zhì)量，確保了本研究中將基因拷貝數(shù)之比轉(zhuǎn)化為肉源性成分相對質(zhì)量分?jǐn)?shù)的可行性。

回收率和CV是檢測準(zhǔn)確度和精密度的重要評價(jià)指標(biāo)，參照國際食品法典委員會標(biāo)準(zhǔn)CAC/GL 74—2010《檢測、鑒定和量化食品中特定基因序列和蛋白質(zhì)的執(zhí)行標(biāo)準(zhǔn)和方法確認(rèn)準(zhǔn)則》[31]，回收率應(yīng)在70%～120%之間，CV應(yīng)不大于25%。本研究采用固定比值法，確定了單位質(zhì)量牛肉中GH基因和豬肉中PRNP基因拷貝數(shù)之比這一固定值，通過該值計(jì)算牛肉和豬肉的相對質(zhì)量分?jǐn)?shù)，當(dāng)豬肉質(zhì)量分?jǐn)?shù)在5%～99%范圍內(nèi)時，回收率在99.09%～102.80%之間，CV均不大于6.50%，表明本方法具有良好的檢測準(zhǔn)確度和精密度，可以較好地應(yīng)用于實(shí)際檢測中。對市售樣品進(jìn)行檢測時，在配料成分標(biāo)明含有豬肉的牛肉腸類商品中檢出豬源性成分。其中，6號牛肉腸樣品中豬肉的相對質(zhì)量分?jǐn)?shù)為0.12%，低于本方法的檢測下限5%，推斷可能是無意沾染導(dǎo)致，或者該商品中添加了微量豬源性調(diào)味品。在市售牛肉卷和牛肉干中均未檢出豬源性成分。根據(jù)GB/T 20712—2006《火腿腸》[32]，用單一肉類原料，如牛肉，制成的產(chǎn)品應(yīng)命名為“牛肉腸”。本研究中，檢出含有一定量豬肉成分的牛肉腸類商品，其標(biāo)簽為“牛肉風(fēng)味腸”或“牛肉早餐腸”，其中摻入的豬肉相對含量在30%左右，均符合國家有關(guān)標(biāo)準(zhǔn)規(guī)定。但是，3號牛肉粒樣品中檢出的豬肉相對質(zhì)量分?jǐn)?shù)達(dá)98.15%，表明生產(chǎn)中可能存在使用豬肉制作牛肉粒的情況。

采用固定比值法檢測肉源性成分的質(zhì)量分?jǐn)?shù)操作簡便且定量分析準(zhǔn)確性高，在對2 種肉類混合樣本進(jìn)行相對含量檢測時具有一定優(yōu)勢，并且市售商品中摻假肉及肉制品多為2 種肉類的摻雜混合，因此固定比值法具有重要的實(shí)際應(yīng)用意義。然而，該方法僅適用于2 種肉類混合的樣本，并且只能確定樣本中2 種肉源性成分的相對含量。一些市售肉制品中常含有3 種肉類成分，要檢測摻有3 種及3 種以上肉類樣本中各種肉源性成分的絕對含量，采用建立肉類制品質(zhì)量與核酸含量以及核酸含量與基因拷貝數(shù)2 個標(biāo)準(zhǔn)曲線的方法來進(jìn)行進(jìn)一步測算則更為實(shí)用。但是由于DNA提取效率在一定程度上會受到環(huán)境的影響，并且對操作要求較高，因此采用標(biāo)準(zhǔn)曲線法來確定肉品質(zhì)量與核酸含量之間的線性關(guān)系的重復(fù)性和再現(xiàn)性欠佳。探索一種更為科學(xué)、快捷、精準(zhǔn)且實(shí)用的多重?cái)?shù)字PCR分析方法，實(shí)現(xiàn)對摻假肉及肉制品中多種常見肉源性成分的定量檢測，可能是未來研究的主要方向之一。

4 結(jié) 論

本研究以單位質(zhì)量牛肉的生長激素基因和豬肉朊蛋白基因拷貝數(shù)之比為一固定值，建立牛肉中豬源性成分檢測的ddPCR方法，該方法具有良好的準(zhǔn)確性和重復(fù)性，檢測限可達(dá)0.625 ng/μL，牛肉中摻雜豬肉的質(zhì)量分?jǐn)?shù)在5%～99%范圍內(nèi)時，檢測結(jié)果的絕對誤差小于1.28%，CV小于6.5%，豬肉成分的回收率在99.09%～102.80%之間。本研究所建立的ddPCR方法可以較好地應(yīng)用于牛肉制品中摻雜豬肉成分的定量檢測，為有關(guān)部門打擊摻假等違規(guī)行為提供技術(shù)支撐，促進(jìn)動物源性食品行業(yè)的健康發(fā)展。