趙茉楠，韓 齊*，俞龍浩，張翼飛，蔣 奕

（黑龍江八一農(nóng)墾大學(xué)食品學(xué)院，黑龍江 大慶 163319）

發(fā)酵作為一種便捷的食品加工及貯藏方式具有改善食品風(fēng)味、提高營養(yǎng)品質(zhì)、增強(qiáng)感官特性及延長食品保質(zhì)期等優(yōu)點(diǎn)。近年來，隨著發(fā)酵肉制品消費(fèi)量的不斷增長，肉制品用功能性發(fā)酵劑的開發(fā)已經(jīng)成為當(dāng)前的研究熱點(diǎn)。乳酸菌是發(fā)酵肉制品中的優(yōu)勢(shì)菌群，在發(fā)酵過程中可以作為發(fā)酵菌株與糖類發(fā)生化學(xué)反應(yīng)，產(chǎn)生乳酸和乙酸等物質(zhì)，并使蛋白質(zhì)發(fā)生降解，產(chǎn)生豐富的氨基酸，使產(chǎn)品具有獨(dú)特的風(fēng)味、顏色和質(zhì)地[1-3]。同時(shí)，乳酸菌可以降低發(fā)酵過程中產(chǎn)生的有害化學(xué)物質(zhì)（如亞硝酸鹽、生物胺等）的含量。段艷[4]的研究也表明，乳酸菌發(fā)酵產(chǎn)生的酸性環(huán)境有利于亞硝酸鹽的分解，對(duì)亞硝酸鹽含量的降低有促進(jìn)作用，有助于減少亞硝酸鹽的殘留量。乳酸菌對(duì)腐敗菌和致病菌的生長繁殖也具有抑制作用，從而提高產(chǎn)品的安全性和穩(wěn)定性，延長產(chǎn)品貨架期[5]。

乳酸菌作為公認(rèn)的安全（generally recognized as safe，GRAS）生物，已成為醫(yī)藥和食品生產(chǎn)中使用最廣泛的益生菌[6-8]，具有抗氧化、免疫調(diào)節(jié)、減輕炎癥性腸?。╥nflammatory bowel disease，IBD）癥狀、治療過敏和某些病毒腹瀉以及防止幽門螺桿菌的定殖等功能[9-11]。自然環(huán)境[12]、哺乳動(dòng)物的腸道[13]和發(fā)酵食品（發(fā)酵肉制品、發(fā)酵乳和奶酪）[14-15]都是乳酸菌的良好來源，但是從肉制品中分離的乳酸菌更加適用于發(fā)酵肉制品的生產(chǎn)，其發(fā)酵性能和風(fēng)味也要優(yōu)于其他來源的菌株。趙俊仁[16]、Iboulet-Bisson[17]等已經(jīng)從發(fā)酵香腸中分離出乳酸菌，并對(duì)其進(jìn)行了鑒定。然而，從中國傳統(tǒng)發(fā)酵香腸中分離乳酸菌的研究報(bào)道較少。本研究對(duì)前期從天然發(fā)酵風(fēng)干腸中分離出的6 株乳酸菌的發(fā)酵性能進(jìn)行測(cè)定，從NaCl耐受能力、NaNO2耐受能力、產(chǎn)酸速率和生長情況方面進(jìn)行評(píng)價(jià)，探究它們作為肉制品發(fā)酵劑的潛力，為發(fā)酵肉制品的生產(chǎn)提供新的發(fā)酵菌株和技術(shù)支持。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

菌種：植物乳桿菌（Lactobacillus plantarum）、彎曲乳桿菌（Lactobacillus curvatus）、清酒乳桿菌（Lactobacillus sake）、發(fā)酵乳桿菌（Lactobacillus fermentum）、戊糖片球菌（Pediococcus pentosaceus）和短乳桿菌（Lactobacillus brevis）均分離自自然發(fā)酵風(fēng)干腸，由東北農(nóng)業(yè)大學(xué)肉制品實(shí)驗(yàn)室分離及保藏。

MRS肉湯培養(yǎng)基 廣東環(huán)愷微生物科技有限公司；蛋白胨水培養(yǎng)基、Kovacs氏靛基質(zhì)試劑盒 青島高科技工業(yè)園海博生物技術(shù)有限公司；藥敏紙片（諾氟沙星、氧氟沙星、環(huán)丙沙星、紅霉素、阿莫西林、氨芐西林和鏈霉素） 杭州濱和微生物試劑有限公司；NaCl、NaNO2等均為國產(chǎn)分析純。

1.2 儀器與設(shè)備

Specord 210 plus紫外-可見分光光度計(jì) 德國耶拿分析儀器有限公司；Seven Multi pH S40綜合測(cè)試儀 瑞士梅特勒-托利多儀器有限公司；LDZX-50 KBS立式壓力蒸汽滅菌器 上海電安醫(yī)療器械廠；SW-CJ-1 FD超凈工作臺(tái) 蘇州安泰空氣技術(shù)有限公司；SHP-250生化培養(yǎng)箱 上海森信實(shí)驗(yàn)儀器有限公司；BCD-439wkk1FYM電冰箱 海信容聲（廣東）冰箱有限公司；VORTEX-5漩渦混合器 海門市其林貝爾儀器有限公司。

1.3 方法

1.3.1 菌株生長曲線及pH值測(cè)定

將活化后的6 株乳酸菌以3%接種量分別接種于無菌MRS肉湯培養(yǎng)基中，37 ℃條件下培養(yǎng)24 h，每隔4 h取發(fā)酵液，測(cè)定其600 nm波長處的吸光度（A）及pH值。以空白MRS液體培養(yǎng)基作為對(duì)照，繪制菌株生長曲線及pH值變化曲線。

1.3.2 菌株NaCl耐受能力測(cè)定

將活化后的6 株乳酸菌以3%接種量分別接種于NaCl質(zhì)量濃度為0、2、4、6 g/100 mL的無菌MRS肉湯培養(yǎng)基中，37 ℃條件下培養(yǎng)24 h后取發(fā)酵液，測(cè)定其600 nm波長處的吸光度，按照公式（1）計(jì)算存活率。

式中：A1為NaCl質(zhì)量濃度為2、4、6 g/100 mL時(shí)的吸光度；A0為NaCl質(zhì)量濃度為0 g/100 mL時(shí)的吸光度。

1.3.3 菌株NaNO2耐受能力測(cè)定

將活化后的6 株乳酸菌以3%接種量分別接種于NaNO2質(zhì)量濃度為0、0.005、0.010、0.015 g/100 mL的無菌MRS肉湯培養(yǎng)基中，37 ℃條件下培養(yǎng)24 h后取發(fā)酵液，測(cè)定其600 nm波長處的吸光度。按照公式（2）計(jì)算存活率。

式中：A1為NaNO2質(zhì)量濃度為0.005、0.010、0.015 g/100 mL時(shí)的吸光度；A0為NaNO2質(zhì)量濃度為0 g/100 mL時(shí)的吸光度。

1.3.4 吲哚實(shí)驗(yàn)

無菌條件下，將活化后的6 株乳酸菌以3%的接菌量分別接種于蛋白胨水培養(yǎng)基中，37 ℃條件下培養(yǎng)72 h，加入吲哚試劑8～10 滴，同時(shí)用大腸桿菌（Escherichia coli）做空白實(shí)驗(yàn)，觀察實(shí)驗(yàn)結(jié)果。

1.3.5 菌株對(duì)抗生素的敏感性實(shí)驗(yàn)

采用平板藥敏紙片擴(kuò)散法對(duì)乳酸菌的抗生素敏感性表型進(jìn)行評(píng)價(jià)，分別檢測(cè)對(duì)諾氟沙星、氧氟沙星、環(huán)丙沙星、紅霉素、阿莫西林、氨芐西林和鏈霉素的敏感性。將不同藥敏紙片放置于涂布乳酸菌的固體平板上，以無菌水紙片作為對(duì)照。將培養(yǎng)皿置于37 ℃條件下培養(yǎng)24 h，測(cè)量藥敏紙片周圍光圈的大小。

1.4 數(shù)據(jù)處理

所有實(shí)驗(yàn)均重復(fù)測(cè)定3 次，每個(gè)處理組做3 個(gè)平行，數(shù)據(jù)表示為平均值±標(biāo)準(zhǔn)差。采用Statistix 8.1軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)分析，差異顯著性分析（P＜0.05）采用Tukey HSD程序進(jìn)行；采用Sigmaplot 12.5作圖軟件繪圖。

2 結(jié)果與分析

2.1 乳酸菌的生長情況

用作肉制品發(fā)酵劑的乳酸菌要求具有較強(qiáng)的生長繁殖能力，乳酸菌在快速生長繁殖過程中產(chǎn)生的乳酸和細(xì)菌素等可以降低發(fā)酵肉制品的pH值和亞硝酸鹽含量，減緩甚至阻止N-亞硝胺的形成，并抑制發(fā)酵香腸中腐敗菌的生長[18]。

圖 1 乳酸菌的生長曲線Fig. 1 Growth curves of lactic acid bacteria

由圖1可知，6 株乳酸菌的生長曲線總體趨勢(shì)相似。在0～8 h以內(nèi)菌株迅速生長繁殖，菌體濃度顯著增加（P＜0.05），戊糖片球菌和短乳桿菌8 h后生長趨于平緩，進(jìn)入穩(wěn)定生長期，植物乳桿菌、彎曲乳桿菌、清酒乳桿菌和發(fā)酵乳桿菌在8 h后生長均呈現(xiàn)小幅度上升，12 h后生長趨于平緩。植物乳桿菌、彎曲乳桿菌、清酒乳桿菌和發(fā)酵乳桿菌的菌體濃度略高于戊糖片球菌和短乳桿菌，說明植物乳桿菌、彎曲乳桿菌、清酒乳桿菌和發(fā)酵乳桿菌的生長情況較好。李利等[19]研究得出，L. plantarum SN1在生長2 h后進(jìn)入對(duì)數(shù)期，16 h后達(dá)到穩(wěn)定期，與本研究結(jié)果基本一致。

2.2 乳酸菌的產(chǎn)酸能力

pH值是監(jiān)測(cè)肉類發(fā)酵程度的重要參數(shù)[20]。乳酸菌可以在發(fā)酵過程中產(chǎn)生大量的有機(jī)酸（主要是乳酸）和其他代謝物，這是導(dǎo)致發(fā)酵產(chǎn)品pH值降低的主要原因。酸性環(huán)境不僅對(duì)乳酸菌的抑菌活性起到重要的作用，對(duì)亞硝胺的積累也有顯著影響，氨基酸脫羧酶陰性啟動(dòng)子培養(yǎng)物會(huì)使pH值快速下降，羧化酶陽性細(xì)菌的生長受限，導(dǎo)致發(fā)酵香腸中亞硝胺的積累量降低[21]。

圖 2 乳酸菌生長過程中的pH值變化Fig. 2 Changes in pH value during growth of lactic acid bacteria

由圖2可知，6 株乳酸菌培養(yǎng)24 h期間的pH值變化趨勢(shì)相似。0～8 h，乳酸菌發(fā)酵液pH值顯著下降（P＜0.05），由6.0下降至4.2左右，這是由于在此期間菌株處于對(duì)數(shù)生長期，代謝旺盛，生長繁殖較快，分解糖類物質(zhì)產(chǎn)生大量乳酸，使pH值迅速降低。其中，戊糖片球菌和短乳桿菌發(fā)酵液的pH值下降最快。12 h后各菌株的產(chǎn)酸速率趨于平緩，發(fā)酵液的pH值為3.9左右。從產(chǎn)酸角度來看，清酒乳桿菌和發(fā)酵乳桿菌的pH值呈現(xiàn)下降趨勢(shì)且下降程度最大，產(chǎn)酸性能最好。Gao Yurong等[22]的研究也表明，乳酸菌產(chǎn)生的代謝產(chǎn)物的抑菌作用在pH值小于5.5時(shí)更有效。Lee等[23]從泡菜中分離出的彎曲乳桿菌、植物乳桿菌和清酒乳桿菌在發(fā)酵香腸的生產(chǎn)過程中表現(xiàn)出相對(duì)良好的應(yīng)用潛力，具有較好的生長能力和產(chǎn)酸能力，與本研究結(jié)果一致。乳酸菌具有較強(qiáng)的產(chǎn)酸能力有助于保證發(fā)酵肉制品的安全性。

2.3 乳酸菌的NaCl耐受能力

NaCl是發(fā)酵肉制品中必不可少的添加物，在發(fā)酵肉制品中添加一定量的NaCl可賦予產(chǎn)品良好的感官和質(zhì)構(gòu)品質(zhì)，并具有防腐保鮮的作用[24-26]。發(fā)酵肉制品生產(chǎn)中NaCl的添加量通常為2.5～3.0 g/100 mL，但隨著發(fā)酵的進(jìn)行，產(chǎn)品水分活度降低，NaCl含量會(huì)有不同程度的升高，因此，作為肉制品發(fā)酵劑使用的乳酸菌需要耐受一定濃度的食鹽[27]，本研究使用的NaCl質(zhì)量濃度最大為6 g/100 mL。

表 1 乳酸菌在不同質(zhì)量濃度NaCl下的存活率Table 1 Survival rates of lactic acid bacteria at different concentrations of NaCl%

由表1可知：隨著培養(yǎng)基中NaCl質(zhì)量濃度的增加，6 株乳酸菌的存活率均顯著下降（P＜0.05）；當(dāng)NaCl的質(zhì)量濃度為2 g/100 mL時(shí)，植物乳桿菌和彎曲乳桿菌的存活率最高，可達(dá)99.77%左右，其他菌株的存活率也均在95%以上；當(dāng)NaCl的質(zhì)量濃度為4 g/100 mL時(shí)，植物乳桿菌和彎曲乳桿菌的存活率仍顯著高于其他菌株，可達(dá)97%左右，其他菌株的存活率均在87%以上，表明NaCl的質(zhì)量濃度為4 g/100 mL時(shí)已經(jīng)顯著影響乳酸菌的生長（P＜0.05）；當(dāng)NaCl的質(zhì)量濃度達(dá)到6 g/100 mL時(shí)，植物乳桿菌和彎曲乳桿菌的存活率仍可達(dá)86%以上，清酒乳桿菌和發(fā)酵乳桿菌的存活率最低，約為60%左右，表明此時(shí)各菌株的生長受到較大程度的抑制，但仍能生長。因此，植物乳桿菌和彎曲乳桿菌具有較高的NaCl耐受能力，其他乳酸菌的生長雖然受到不同質(zhì)量濃度NaCl的抑制，但也可以保持一定程度的生長。Drosinos等[28]從一種希臘發(fā)酵香腸中分離出107 株植物乳桿菌、21 株彎曲乳桿菌和12 株清酒乳桿菌，并對(duì)其進(jìn)行耐鹽性實(shí)驗(yàn)，發(fā)現(xiàn)清酒乳桿菌、植物乳桿菌和彎曲乳桿菌能夠耐受8 g/100 mL的食鹽，與本研究結(jié)果基本一致。

2.4 乳酸菌的亞硝酸鹽耐受能力

亞硝酸鈉作為肉類加工過程中重要成分，可與肌紅蛋白反應(yīng)形成亞硝基肌紅蛋白，是肉制品形成特征粉紅色的原因，亞硝酸鈉還具有抑制有害微生物、延緩脂質(zhì)氧化和形成肉類特殊風(fēng)味的重要作用[29]。乳酸菌具有硝酸鹽和亞硝酸鹽還原酶活性的能力是篩選用于發(fā)酵香腸生產(chǎn)發(fā)酵劑的選擇標(biāo)準(zhǔn)之一[30]。GB 2760—2014《食品安全國家標(biāo)準(zhǔn) 食品添加劑使用標(biāo)準(zhǔn)》規(guī)定，亞硝酸鹽在肉制品的最大使用量為0.015 g/100 mL，因此，作為肉制品發(fā)酵劑的乳酸菌必須能夠耐受一定質(zhì)量濃度的亞硝酸鹽，否則亞硝酸鹽的加入會(huì)抑制發(fā)酵微生物的生長繁殖，影響正常發(fā)酵。

表 2 乳酸菌在不同質(zhì)量濃度NaNO2下的存活率Table 2 Survival rates of lactic acid bacteria at different concentrations of NaNO2%

由表2可知，隨著NaNO2質(zhì)量濃度的增加，6 株乳酸菌的生長均受到顯著抑制（P＜0.05），并且菌株之間也具有顯著差異（P＜0.05）。當(dāng)NaNO2質(zhì)量濃度為0.005 g/100 mL時(shí)，各菌株耐受能力均較強(qiáng)，植物乳桿菌和彎曲乳桿菌的存活率高達(dá)99%以上，其他菌株均在97%左右；當(dāng)NaNO2質(zhì)量濃度為0.010 g/100 mL時(shí)，植物乳桿菌和彎曲乳桿菌的存活率仍在98%以上，相比其他菌株仍具有較高的耐受性，除了彎曲乳桿菌和清酒乳桿菌的存活率隨著NaNO2質(zhì)量濃度的增加未發(fā)生顯著變化外，其他菌株均顯著下降（P＜0.05）；當(dāng)NaNO2質(zhì)量濃度為0.015 g/100 mL時(shí)，不同質(zhì)量濃度的亞硝酸鹽對(duì)各菌株的影響與質(zhì)量濃度0.010 g/100 mL相比顯著降低（P＜0.05），清酒乳桿菌和發(fā)酵乳桿菌的存活率在95%左右。以上結(jié)果表明，6 株乳酸菌在不同質(zhì)量濃度亞硝酸鹽條件下的生長能力顯著下降，但仍能生長，表明分離的乳酸菌具有良好的亞硝酸鹽耐受性，可作為肉制品發(fā)酵劑使用。

2.5 吲哚實(shí)驗(yàn)結(jié)果

向培養(yǎng)好的菌液中滴加指示劑后，E.coli空白組的蛋白胨水培養(yǎng)基上部出現(xiàn)紅色圓環(huán)，6 株乳酸菌菌株（L. plantarum、L. curvatus、L. sake、L. fermentum、P. pentosaceus、L. brevis）的吲哚實(shí)驗(yàn)結(jié)果均呈陰性，蛋白胨水培養(yǎng)基上部出現(xiàn)黃色圓環(huán)，說明未產(chǎn)生吲哚類物質(zhì)。吲哚實(shí)驗(yàn)可以檢測(cè)菌株是否能分解蛋白質(zhì)中的色氨酸。色氨酸為人體必需氨基酸，參與人體蛋白質(zhì)合成、調(diào)節(jié)免疫功能和促進(jìn)消化。色氨酸代謝過程發(fā)生障礙會(huì)引起肝功能衰退、惡性腫瘤等疾病。吲哚實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，6 株乳酸菌菌株不會(huì)分解色氨酸產(chǎn)生吲哚。

2.6 藥敏實(shí)驗(yàn)結(jié)果

表 3 乳酸菌對(duì)6 種抗菌藥的敏感性Table 3 Sensitivity of lactic acid bacteria to six antimicrobial agents

由表3可知：6 株乳酸菌對(duì)氧氟沙星、諾氟沙星、阿莫西林（青霉素類藥物）、紅霉素（大環(huán)內(nèi)酯類藥物）和氨芐西林均敏感；除短乳桿菌對(duì)環(huán)丙沙星中度敏感外，其余菌株均為敏感；植物乳桿菌和戊糖片球菌對(duì)鏈霉素（氨基糖苷類藥物）有抗性，清酒乳桿菌、發(fā)酵乳桿菌和短乳桿菌對(duì)鏈霉素中度敏感，其余菌株對(duì)鏈霉素均敏感。

3 結(jié) 論

本研究對(duì)分離自自然發(fā)酵風(fēng)干腸的6 株乳酸菌的產(chǎn)酸能力、生長曲線、對(duì)NaCl及NaNO2的耐受能力進(jìn)行評(píng)價(jià)，結(jié)果表明：植物乳桿菌、彎曲乳桿菌、清酒乳桿菌和發(fā)酵乳桿菌的生長情況更好，清酒乳桿菌和發(fā)酵乳桿菌的pH值在發(fā)酵過程中下降最快且程度最大，產(chǎn)酸性能最好；植物乳桿菌和彎曲乳桿菌具有較強(qiáng)的NaCl耐受能力，清酒乳桿菌和發(fā)酵乳桿菌具有較強(qiáng)的NaNO2耐受能力；同時(shí)通過體外安全性實(shí)驗(yàn)中的吲哚實(shí)驗(yàn)和耐藥性檢測(cè)，初步證明了6 株乳酸菌的安全性，它們均可以作為潛在的肉制品發(fā)酵劑應(yīng)用于發(fā)酵肉制品的生產(chǎn)中。