殷仁聯(lián)

【摘要】目的：研究鱷魚血干粉給藥后，對(duì)荷瘤小鼠抑瘤作用以及對(duì)小鼠免疫功能的影響作用。方法：采用雌性小鼠，每組10只， 隨機(jī)分為空白對(duì)照組、鱷魚血干粉高劑量組（240mg/kg）、中劑量組（120mg/kg）和低劑量組（60mg/kg）?？瞻讓?duì)照組給與雙蒸水，各組均連續(xù)灌胃給藥15d，每天1次，末次給藥后，分別進(jìn)行對(duì)小鼠Lewis肺癌、小鼠肉瘤S180、宮頸癌U14、ConA 誘導(dǎo)的小鼠脾淋巴細(xì)胞轉(zhuǎn)化和小鼠NK 細(xì)胞活性實(shí)驗(yàn)。結(jié)果：鱷魚血干粉對(duì)模型動(dòng)物腫瘤生長(zhǎng)具有明顯的抑制作用，并可提高小鼠脾淋巴細(xì)胞轉(zhuǎn)化能力和 NK 細(xì)胞活性。結(jié)論：鱷魚血干粉可抑制荷瘤小鼠腫瘤生長(zhǎng)的作用，并可增強(qiáng)小鼠的免疫功能。

【關(guān)鍵詞】鱷魚血干粉；腫瘤；免疫增強(qiáng)

【中圖分類號(hào)】R455

【文獻(xiàn)標(biāo)志碼】B

【文章編號(hào)】1005-0019（2018）09-038-01

鱷魚肉、血和其他產(chǎn)品，已經(jīng)被廣泛消費(fèi)，不僅因?yàn)樗臓I(yíng)養(yǎng)成分，還在于它的藥用價(jià)值。在很多亞洲文化傳統(tǒng)中發(fā)現(xiàn)了食用鱷魚血來(lái)改善人類健康的實(shí)踐.最近鱷魚血的抗菌活性得到了系統(tǒng)的研究，其中鱷魚血抗腫瘤和提高免疫力效用受到更多的關(guān)注，有研究表明它對(duì)食管癌、結(jié)腸癌、乳腺癌等表現(xiàn)出良好的抗癌活性，這一作用有可能是通過(guò)提高機(jī)體免疫力而達(dá)到的。本研究圍繞這一發(fā)現(xiàn)進(jìn)行基礎(chǔ)性研究，同時(shí)開展對(duì)動(dòng)物免疫功能的探討，尋找其可能的對(duì)機(jī)體修復(fù)和抑瘤的作用路徑。

一、材料和方法

1樣品和動(dòng)物：鱷魚血干粉購(gòu)自三杰鱷魚潭農(nóng)業(yè)開發(fā)有限公司，取檢驗(yàn)檢疫合格的鱷魚血，加熱成血塊，減壓真空干燥后粉碎；選用上海西普爾-必凱實(shí)驗(yàn)動(dòng)物有限公司繁殖的SPF級(jí)CI/F1代雌性小鼠，體重為18-22g，實(shí)驗(yàn)動(dòng)物生產(chǎn)許可證號(hào)為SCXK（滬）2013-0016。

2劑量選擇及分組：共小鼠Lewis肺癌、小鼠肉瘤S180、宮頸癌U14、小鼠免疫功能四批試驗(yàn)，每試驗(yàn)均分為四組，每組10只小鼠，分別為鱷魚血干粉高、中、低劑量組以及空白組、陽(yáng)性藥組，其中試驗(yàn)藥品組劑量設(shè)置為240、120、60mg/kg（分別相當(dāng)于人體推薦用量的 20、10、5倍），上述劑量折合人用血粉為每日144、072、036g。分別給予相應(yīng)劑量組動(dòng)物灌胃，空白對(duì)照組予以等體積的蒸餾水，每天灌胃一次，連續(xù)灌胃 15天。

3主要儀器與試劑：T1000型電子天平、JA2003型電子天平、SG-603生物安全柜、二氧化碳培養(yǎng)箱、顯微鏡等。RPMI1640 培養(yǎng)液、小牛血清、SA 緩沖液、生理鹽水等。

4試驗(yàn)方法：

41對(duì)小鼠Lewis肺癌的影響實(shí)驗(yàn)取小鼠右腋皮下接種Lewis肺癌瘤細(xì)胞懸液（瘤組織塊：生理鹽水為1：3）無(wú)菌勻漿02ml/只，接種后按體重隨機(jī)分組，接種24小時(shí)后給藥，除水對(duì)照組同體積的蒸餾水灌胃之外，其余各組灌胃04ml/只藥液，每日一次，連續(xù)14天，于未次給藥后次日，各組小鼠稱重后處死，解剖并剝離瘤體，稱重。

42對(duì)小鼠肉瘤S180的影響實(shí)驗(yàn)取小鼠右腋皮下接種肉瘤S180瘤細(xì)胞懸液（瘤組織塊：生理鹽水為1：3）無(wú)菌勻漿02ml/只，接種后按體重隨機(jī)分組，接種24小時(shí)后給藥，除水對(duì)照組同體積的蒸餾水灌胃之外，其余各組灌胃04ml/只藥液，每日一次，連續(xù)14天，于未次給藥后次日，各組小鼠稱重后處死，解剖并剝離瘤體，稱重。

43對(duì)小鼠宮頸癌U14的影響實(shí)驗(yàn)取小鼠右腋皮下接種宮頸癌U14瘤細(xì)胞懸液（瘤組織塊：生理鹽水為1：3）無(wú)菌勻漿02ml/只，接種后按體重隨機(jī)分組，接種24小時(shí)后給藥，除水對(duì)照組同體積的蒸餾水灌胃之外，其余各組灌胃04ml/只藥液，每日一次，連續(xù)14天，于未次給藥后次日，各組小鼠稱重后處死，解剖并剝離瘤體，稱重。

44ConA誘導(dǎo)小鼠脾淋巴細(xì)胞轉(zhuǎn)化試驗(yàn)——MTT法各劑量組動(dòng)物連續(xù)灌胃15天后，頸椎脫臼法處死動(dòng)物，無(wú)菌取脾，放入1640培養(yǎng)液的平皿內(nèi)剪碎過(guò)篩制成懸液，移入離心管放入1640培養(yǎng)液的平皿內(nèi)剪碎過(guò)篩制成懸液，移入離心管用1640液洗并離心（1000rpm/分，10分，4℃）三次，棄上清加入2ml含10%小牛血清1640液，取懸液稀釋計(jì)數(shù)，調(diào)成2×106/ml濃度，加入24孔培養(yǎng)板2ml/孔，平行分3孔，一孔為空白對(duì)照，一孔加con-A100μl/孔（終濃度5μg/ml），一孔加LPS100μl（終濃養(yǎng)72小時(shí)。在培養(yǎng)結(jié)束前4h，離心（2000rpm/分，10分，4℃），每孔棄去培養(yǎng)液16ml，加入16ml含10%小牛血清1640液，同時(shí)加入MTT（5μg/ml）100μl/孔，繼續(xù)培養(yǎng)4小時(shí)。培養(yǎng)結(jié)束后，離心（2000rpm/分，10分，4℃），棄上清，每孔加入2ml二甲基亞砜，混勻，使紫色結(jié)晶完全溶解，721分光光度計(jì)（波長(zhǎng)570nm）比色，記錄結(jié)果。

淋巴細(xì)胞增殖能力=加ConA的光密度值-不加ConA的光密度值

45NK細(xì)胞活性測(cè)定——乳酸脫氫酶測(cè)定法各劑量組動(dòng)物連續(xù)灌胃15天后，頸椎脫臼處死小鼠，無(wú)菌取脾，置于盛有適量無(wú)菌Hanks液的小平皿中，研磨脾臟，制成單細(xì)胞懸液，經(jīng)200目篩網(wǎng)過(guò)濾，用Hanks液洗2次，每次離心10min（1000r/min），棄上清將細(xì)胞漿彈起，加入05mL滅菌水20秒，裂解紅細(xì)胞后再加入05mL 2倍Hanks液及8mL Hanks液，離心10min（1000r/min），用含10%小牛血清RPMI1640完全培養(yǎng)液重懸，1%冰乙酸稀釋后計(jì)數(shù)，臺(tái)酚蘭染色計(jì)數(shù)活細(xì)胞數(shù)（均在95%以上），用RPMI1640完全培養(yǎng)液調(diào)整細(xì)胞濃度為2×107個(gè)/mL。

試驗(yàn)前24h將靶細(xì)胞（YAC-1細(xì)胞）傳代培養(yǎng)，應(yīng)用前以Hanks液洗3次，用RPMI1640完全培養(yǎng)液調(diào)整細(xì)胞濃度為4×105個(gè)/mL。取YAC-1細(xì)胞和脾細(xì)胞各100μL（效靶比50：1）加入U(xiǎn)型96孔培養(yǎng)板中，YAC-1細(xì)胞自然釋放孔加YAC-1細(xì)胞和培養(yǎng)液各100μL，YAC-1細(xì)胞最大釋放孔加YAC-1細(xì)胞和25%Triton各100μL，上述各項(xiàng)均設(shè)三個(gè)平行孔，于37℃、5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)4h，然后將96孔培養(yǎng)板以1500r/min離心5min，每孔吸取上清液100μL置平底96孔培養(yǎng)板中，同時(shí)加入LDH基質(zhì)液100μL，反應(yīng)10min，每孔加入1mol/L的HCl 30μL，在酶標(biāo)儀490nm處測(cè)定光密度值。

NK細(xì)胞活性（%）=反應(yīng)孔OD值-自然釋放孔OD值

最大釋放孔OD值-自然釋放孔OD值×100

5實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)：應(yīng)用 SPSS 統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行方差分析統(tǒng)計(jì)處理。

二、結(jié)果

1鱷魚血干粉對(duì)小鼠Lewis肺癌的影響

表1可見(jiàn)，鱷魚血干粉在240-60mg/kg劑量下小鼠灌胃給藥對(duì)小鼠Lewis肺癌生長(zhǎng)具有明顯的抑制作用。

2鱷魚血干粉對(duì)小鼠肉瘤S180的影響

表2可見(jiàn)，鱷魚血干粉在240-60mg/kg劑量下小鼠灌胃給藥對(duì)小鼠肉瘤S180生長(zhǎng)具有明顯的抑制作用。

3鱷魚血干粉對(duì)小鼠宮頸癌U14的影響

4鱷魚血干粉對(duì) ConA 誘導(dǎo)的小鼠脾淋巴細(xì)胞轉(zhuǎn)化能力的影響

表4可見(jiàn)，鱷魚血干粉在240-60mg/kg劑量下對(duì)小鼠脾淋巴細(xì)胞中加ConA孔與不加ConA孔吸光度高于對(duì)照組，差值有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

5鱷魚血干粉對(duì)小鼠的 NK 細(xì)胞活性的影響

表5可見(jiàn)，鱷魚血干粉在240-60mg/kg劑量下對(duì)小鼠NK細(xì)胞活性高于對(duì)照組，差值有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

三、討論

目前，隨著鱷魚的人工養(yǎng)殖越來(lái)越廣，鱷魚除了食用等價(jià)值外，其保健、藥用價(jià)值也正在被廣泛利用。現(xiàn)代科學(xué)研究，鱷魚肉、骨、血液及內(nèi)臟富含蛋白質(zhì)和人體所需的氨基酸、脂肪、碳水化合物、免疫球蛋白、維生素以及多種稀有生物元素，營(yíng)養(yǎng)豐富，味道鮮美，能降低膽固醇，培補(bǔ)氣血，強(qiáng)身健體，提高人體免疫力。鱷魚血主要成分為蛋白質(zhì)、脂肪酸、氨基酸、免疫球蛋白等成分，從目前的研究、食用情況看這幾類成分都是人體所需的營(yíng)養(yǎng)成分，沒(méi)有任何毒性成分，可以看出鱷魚血干粉是一種高蛋白、低脂肪的營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)。英國(guó)和澳大利亞的科學(xué)家經(jīng)研究均發(fā)現(xiàn)鱷魚血中含有多種有效物質(zhì)，其免疫系統(tǒng)能殺死愛(ài)滋病病毒，以及對(duì)青霉素具有抗體的病毒。近年來(lái)我國(guó)也有多個(gè)鱷魚血提高免疫力的實(shí)驗(yàn)報(bào)道，如血液提取物測(cè)可在小鼠體內(nèi)抗御海豚鏈球菌感染，體外對(duì)埃希氏大腸桿菌、金黃色葡萄球菌等10種細(xì)菌均有一定的抑菌效果。通過(guò)本實(shí)驗(yàn)，發(fā)現(xiàn)鱷魚血粉對(duì)動(dòng)物移植的瘤株有一定的抑制作用，并可增強(qiáng)小鼠的免疫功能，提高小鼠脾淋巴細(xì)胞轉(zhuǎn)化能力和 NK細(xì)胞活性。以上的研究結(jié)果將有利于鱷魚血產(chǎn)品的進(jìn)一步開發(fā)和應(yīng)用。

參考文獻(xiàn)

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