陳玉婷，汪蘇平，程文翰，曾小平，鄭華明，吳江渝

武漢工程大學(xué)材料科學(xué)與工程學(xué)院，湖北 武漢 430205

鐵離子（Fe3+）是生物體中含量最多的過渡金屬元素，在生物體的生命過程中起著至關(guān)重要的作用［1］，有極其重要的生理意義，在肌肉收縮、神經(jīng)傳導(dǎo)、酶催化、脫氧核糖核酸（deoxyribonucleic acid，DNA）和核糖核酸（ribonucleic acid，RNA）的合成［2］、細(xì)胞內(nèi)滲透壓調(diào)節(jié)以及酸堿平衡維持等方面，均有鐵元素的參與。一旦生物體內(nèi)鐵元素缺乏，就會(huì)發(fā)生各種各樣生理系統(tǒng)紊亂，引起疾病［3-7］。而人體內(nèi)的Fe3+含量一旦過高，心臟、肝臟、胰腺等器官將發(fā)生功能紊亂［8-9］。而且人們賴以生存的自然環(huán)境中鐵元素也無處不在，固態(tài)主要以氧化鐵的形式存在，液態(tài)中以Fe3+的形式存在。致使對Fe3+的檢測需求逐步上升，因此開發(fā)性能優(yōu)異的Fe3+檢測工具是很有必要的，以便實(shí)時(shí)、在線動(dòng)態(tài)檢測生物體或環(huán)境中Fe3+的含量和分布。在生物體諸多的生理活動(dòng)中，常用檢測Fe3+的方法主要有原子吸收法［10-11］、電感耦合等離子體發(fā)射光譜法［12］、分光光度法［13］、電感耦合等離子體質(zhì)譜法［14］、電化學(xué)法［15］及熒光分析法［16］等，但這些方法普遍存在流程復(fù)雜、檢測設(shè)備貴重、檢測成本高等缺點(diǎn)。而熒光探針由于其高選擇性、高靈敏度和低成本在化學(xué)傳感器研究領(lǐng)域越來越受到關(guān)注，并且利用羅丹明B（Rhodamine B，RhB）合成的探針分子在近些年受到極大重視［17-23］。

本文以RhB和水合肼為原料合成RhB酰肼（Rhodamine B hydrazide，RhB-NH2），再與苯甲醛一步反應(yīng)制得一種新型羅丹明探針化合物RhB-P。RhB-P在V（乙腈）∶V（水）=1∶1的混合溶液中，對Fe3+有較高的選擇性識別能力，并且靈敏度高、響應(yīng)快。

1 實(shí)驗(yàn)部分

1.1 主要試劑

RhB（國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司，化學(xué)純），水合肼（國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司，分析純），苯甲醛和鹽酸（國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司，化學(xué)純），氫氧化鈉、冰醋酸、乙醇和乙腈（國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司，分析純），二次蒸餾水。

1.2 合成方法

以乙醇做溶劑，將RhB和水合肼反應(yīng)后制得RhB-NH2，再與過量的苯甲醛反應(yīng)，合成RhB-P。合成路線如圖1所示。

圖1 RhB-P探針的合成路線圖Fig.1 Synthesis route of RhB-P probe

1.2.1 RhB酰肼的合成 采用文獻(xiàn)［24］合成方法，準(zhǔn)確稱取1.0 g（2.07 mmol）的 RhB，將其溶解于40 mL乙醇中，磁力攪拌緩慢升溫至回流。加入過量的水合肼（1 mL），5 h后直至粉紅色消失。將冷卻的反應(yīng)混合物倒入蒸餾水中并用乙酸乙酯萃取，有機(jī)層用無水硫酸鈉干燥，過濾并蒸發(fā)溶劑。產(chǎn)物在V（甲醇）∶V（丙酮）=1∶4的溶液中重結(jié)晶，為白色固體，產(chǎn)率為83.72%。

1.2.2 RhB-P探針的合成 將457 mg（1 mmol）RhB-NH2溶于10 mL無水乙醇中，緩慢升溫至回流，加入0.5 mL苯甲醛，滴加3滴冰醋酸作催化劑，4 h后停止反應(yīng)。待反應(yīng)體系冷卻至室溫，將白色沉淀用無水乙醇洗滌3次，室溫下真空干燥，得白色固體粉末，產(chǎn)率為63.79%。

1.3 結(jié)構(gòu)表征

在傅里葉變換紅外光譜（Fourier transform infrared spectoscopy，F(xiàn)T-IR）儀（美國 Perkin Elmer公司，Spectrum Two型）上用KBr壓片測定紅外光譜，設(shè)定掃描范圍為4 000 cm-1～500 cm-1，以此檢測RhB-NH2和RhB-P的特征峰。

采用核磁共振波譜（nuclear magnetic reso?nance spectroscopy，NMR）儀（美國 Agilent公司，Agilent 400 MR型），以氘仿作溶劑，對RhB-NH2作結(jié)構(gòu)分析；以DMSO-d6為溶劑，對探針RhB-P的結(jié)構(gòu)做分析，前后對比進(jìn)一步確定反應(yīng)進(jìn)程。

1.4 性能測試

1.4.1 探針分子RhB-P對Fe3+的選擇性 采用紫外可見分光光度（UV-visible spectrophotometer，UV-Vis）計(jì)（美國Perkin Elmer公司，Agilent 400MR型），檢測探針RhB-P分別與不同金屬陽離子混合后的紫外吸收強(qiáng)度。以V（乙腈）∶V（水）=1∶1的混合溶液為溶劑，配制不同種類的金屬陽離子（BaCl2，CaCl2，CuCl2，F(xiàn)eCl3，HgCl2，KCl，F(xiàn)eCl2，NaCl，MgCl2）溶液，用于金屬陽離子與熒光探針分子RhB-P絡(luò)合紫外-可見光吸收的強(qiáng)度測定，確定探針RhB-P的選擇性識別能力。采用熒光光譜（fluorescence spectrophotometers）儀（美國 SLM公司，F(xiàn)L0910M014型），設(shè)置掃描范圍為560 nm～680 nm，激發(fā)波長為560 nm，激發(fā)光狹縫和發(fā)射光狹縫分別為2.5 nm和5 nm。稱取一定量的FeCl3和一種金屬鹽，共同溶于溶劑中得到濃度為40 μmol/L的混合溶液，稱取一定量的探針RhB-P，配制成40 μmol/L的混合溶液。分別取3 mL上述兩種溶液等體積混合，其最終濃度均為20 μmol/L?；旌暇鶆颍覝叵蚂o置30 min后測試熒光強(qiáng)度，檢測熒光強(qiáng)度是否會(huì)受其它共存金屬離子的干擾。

1.4.2 探針分子RhB-P對Fe3+的檢測性能 配制1 mmol/L 的 FeCl3溶 液 ，稀 釋 得 到 1 μmol/L～70 μmol/L的FeCl3溶液體系。分別取3 mL的FeCl3溶液與3 mL濃度為20 μmol/L的RhB-P探針溶液均勻混合后，室溫下靜置30 min。檢測不同濃度Fe3+與探針RhB-P絡(luò)合后熒光強(qiáng)度的變化趨勢。

1.4.3 RhB-P探針分子與Fe3+的絡(luò)合機(jī)理 通過等摩爾連續(xù)變化法測定探針RhB-P與Fe3+的絡(luò)合比。固定RhB-P與Fe3+在溶液體系中的總濃度為40 μmol/L，改變探針 RhB-P與 Fe3+的組成比例，測定熒光強(qiáng)度的變化。

2 結(jié)果與討論

2.1 熒光探針的表征

2.1.1 探針分子的FT-IR表征 RhB-NH2和探針RhB-P的FT-IR譜圖如圖2所示。2 970 cm-1和2 987 cm-1處為C-H伸縮振動(dòng)峰，1 724 cm-1處出現(xiàn)的很強(qiáng)的峰為C=O伸縮振動(dòng)吸收峰，新出現(xiàn)的1 587 cm-1處的吸收峰為C=N的伸縮振動(dòng)吸收峰，818 cm-1和755 cm-1處為苯環(huán)上C-H彎曲振動(dòng)吸收峰。說明胺和活性羰基縮合而成亞胺鍵，苯甲醛與RhB-NH2反應(yīng)完全。

圖2 RhB-NH2和RhB-P的FT-IR譜圖Fig.2 FT-IR spectra of RhB-NH2and RhB-P

2.1.2 探針分子的1H-NMR表征 對RhB-NH2進(jìn)行1H-NMR表征，核磁圖譜如圖3（a）所示。對于該化合物，所用核磁溶劑為氘仿，其測試數(shù)據(jù)如下：1H-NMR（CDCl3）δ：7.77（q，1H，Ar-H），7.48（m，2H，Ar-H），7.00（q，1H，Ar-H），6.37（d，2H，Xan?thenen-H），6.34（q，4H，Xanthenen-H），3.65（s，2H，NH2），3.30（q，8H，NCH2CH3），1.12（t，12H，NCH2CH3）。9種氫原子的個(gè)數(shù)比為 1∶2∶1∶2∶2∶2∶2∶8∶12，其對應(yīng)的吸收峰的積分面積比為 1.00∶2.02∶1.03∶1.83∶1.90∶1.99∶2.02∶7.95∶11.97，這 與氫原子的個(gè)數(shù)比吻合，證明所得產(chǎn)物為RhB-NH2。

為進(jìn)一步證實(shí)探針RhB-P的分子結(jié)構(gòu)，對探針RhB-P的結(jié)構(gòu)進(jìn)行1H-NMR表征，核磁圖譜如圖3（b）所示。對于該化合物，所用核磁溶劑為DMSO-d6，其測試數(shù)據(jù)如下，1H-NMR（DMSO-d6）δ：8.90（s，1H，N=C-H），7.88（d，1H，Ar-H），7.58（m，2H，Ar-H），7.41（m，2H，Ar-H），7.33（m，3H，Ar-H），7.09（d，1H，Ar-H），6.43（d，2H，Xan?thene-H），6.39（d，2H，Xanthene-H），6.33（d，2H，Xanthene-H），3.31（q，8H，NCH2CH3），1.05（t，12H，NCH2CH3）。11種氫原子的個(gè)數(shù)比為 1∶1∶2∶2∶3∶1∶2∶2∶2∶8∶12，其對應(yīng)的吸收峰的積分面積比 為 1.00∶0.98∶1.98∶2.03∶3.04∶1.04∶2.00∶1.99∶2.01∶8.04∶11.98，這與氫原子的個(gè)數(shù)比相符，證明所得產(chǎn)物為目標(biāo)化合物。

圖3 1H-NMR譜：（a）RhB-NH2，（b）探針分子RhB-PFig.3 1H-NMR spectra：（a）RhB-NH2，（b）fluorescent probe RhB-P

2.2 RhB-P探針分子對Fe3+的檢測

2.2.1 UV-Vis檢測 為了確定探針RhB-P對不同金屬陽離子的選擇性識別能力，選擇Na+，K+，Mg2+，Ba2+，Ca2+，Cu2+，Hg2+，F(xiàn)e2+，F(xiàn)e3+為識別對象，其鹽溶液與RhB-P的溶液混合后檢測其吸光度，結(jié)果如圖4所示。實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，F(xiàn)e3+的組別在560 nm有明顯的吸收峰，溶液的顏色也由無色變?yōu)槿庋劭勺R別的枚紅色，這是由于Fe3+誘導(dǎo)電子發(fā)生轉(zhuǎn)移導(dǎo)致螺環(huán)結(jié)構(gòu)打開；而其它組別中，溶液基本保持無色狀態(tài)，此時(shí)RhB-P探針主要以螺環(huán)形式存在。所有測試條件下金屬離子的濃度均為20 μmol/L。

圖4 探針RhB-P對不同金屬離子UV-Vis譜Fig.4 UV-Vis absorption spectra of RhB-P for several metal ions

2.2.2 熒光檢測 為進(jìn)一步確認(rèn)RhB-P探針對Fe3+的響應(yīng)特性，將 Na+，K+，Mg2+，Ba2+，Ca2+，Cu2+，Hg2+，F(xiàn)e2+，F(xiàn)e3+的金屬鹽溶液分別與 RhB-P 的溶液混合后進(jìn)行熒光測試，結(jié)果如圖5（a）所示。實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，未加Fe3+的組別，經(jīng)檢測在586 nm的波長處未顯示明顯熒光增強(qiáng)，而加入Fe3+的組別，在586 nm處有明顯的熒光強(qiáng)度出現(xiàn)。所有離子的濃度均為20 μmol/L。為考察探針分子的抗干擾性能，在其他離子共存的情況下，測定混合體系的災(zāi)光強(qiáng)度，實(shí)驗(yàn)結(jié)果如圖5（b）所示。探針RhB-P作為檢測Fe3+的熒光化學(xué)傳感器具有良好的抗干擾能力，在檢測過程中其他金屬離子不會(huì)對檢測結(jié)果帶來明顯的干擾。不同濃度的Fe3+對探針RhB-P的熒光光譜的影響如圖5（c）所示，結(jié)果表明，隨著Fe3+濃度的升高，溶液的熒光強(qiáng)度逐漸增大。在586 nm處，F(xiàn)e3+濃度與熒光強(qiáng)度的關(guān)系如圖 5（d）所示，F(xiàn)e3+濃度在 0.1 μmol/L～20 μmol/L 范圍內(nèi)與RhB-P探針的熒光強(qiáng)度呈良好的線性關(guān)系，表明RhB-P探針分子可以定量檢測此范圍內(nèi)Fe3+的濃度。根據(jù)檢出限公式：LOD=3 δ/S（LOD為檢出限，δ為空白樣數(shù)據(jù)標(biāo)準(zhǔn)偏差，S為標(biāo)準(zhǔn)曲線斜率），計(jì)算得該探針的檢出限為0.058 μmol/L。

圖5 （a）不同金屬離子條件下探針RhB-P的熒光光譜圖，（b）不同金屬離子與Fe3+共存條件下探針RhB-P的熒光強(qiáng)度變化圖，（c）不同F(xiàn)e3+濃度條件下探針RhB-P的熒光光譜圖，（d）Fe3+濃度與探針RhB-P的熒光強(qiáng)度的線性關(guān)系圖Fig.5 （a）Fluorescence spectra of probe RhB-P with different metal ions，（b）fluorescence response of RhB-P prode to various metal ions with Fe3+，（c）fluorescence spectra of RhB-P upon various concentration of Fe3+，and（d）linear relationship between fluorescence intensity of RhB-P probe and Fe3+concentration

2.3 RhB-P探針與Fe3+的絡(luò)合方式

為了進(jìn)一步確定Fe3+與RhB-P探針之間的絡(luò)合比，采用等物質(zhì)的量連續(xù)變化法，使探針RhB-P與 Fe3+的總濃度保持 40 μmol/L，隨著 Fe3+摩爾分?jǐn)?shù)的不斷改變，體系的熒光強(qiáng)度隨之變化，如圖6（a）所示。當(dāng)Fe3+的摩爾分?jǐn)?shù)為0.5時(shí)，探針RhB-P與Fe3+在586 nm處呈現(xiàn)熒光強(qiáng)度最大值，表明探針化合物與Fe3+的絡(luò)合比是1∶1，推測其絡(luò)合方式可能如圖6（b）所示。

圖6 （a）探針RhB-P與Fe3+的Job's Plot曲線，（b）探針RhB-P和Fe3+的配位反應(yīng)機(jī)理Fig.6 （a）Job's plot of fluorescent RhB-P probe and Fe3+，（b）coordination reaction mechanism of RhB-P probe with Fe3+

3 結(jié) 語

本文以RhB、水合肼和苯甲醛為原料，經(jīng)兩步反應(yīng)得到一種新型熒光探針分子RhB-P，其對Fe3+能進(jìn)行選擇性識別，且靈敏度高。可裸眼觀察其顏色變化，并在UV-Vis光譜中于560 nm處有明顯的吸收峰；在熒光光譜中586 nm處，隨著Fe3+濃度增大有明顯的熒光增強(qiáng)。Fe3+濃度在0.1 μmol/L～20 μmol/L范圍內(nèi)與探針RhB-P的熒光強(qiáng)度呈良好的線性關(guān)系，其在V（乙腈）∶V（水）=1∶1的溶液中檢出限為0.058 μmol/L。該探針分子有望用于河水、土壤樣品中Fe3+濃度的測定，并有望在水質(zhì)檢測、食品安全等方面取得應(yīng)用。