程明，梁怡明，鄔林泉

(1、江西省九江學(xué)院附屬醫(yī)院肝膽外科，九江 332000；2、南昌大學(xué)第二附屬醫(yī)院肝膽外科，南昌 330000)

胰腺癌在目前已知的惡性腫瘤中，惡性程度很高，預(yù)后極差，5年生存率不到1%，其中胰腺導(dǎo)管腺癌占90%以上，是一種診斷和治療都很困難的消化道惡性腫瘤，其發(fā)病率和死亡率呈逐年上升趨勢，新世紀(jì)以來，其上升趨勢更加明顯，在我國人口死亡的十大惡性腫瘤中排第7位，每年的死亡率幾乎相當(dāng)于當(dāng)年的新發(fā)病率。由于胰腺位置深在，無典型臨床特征，早期確診率很低，易轉(zhuǎn)移，手術(shù)并發(fā)癥多，操作困難，手術(shù)死亡率高，無特效化療方案，易產(chǎn)生化療耐藥性等，基于以上特點，胰腺癌是惡性程度最高的實體腫瘤之一[1]。胰腺癌的診斷、治療是目前醫(yī)學(xué)界公認(rèn)的難題，目前胰腺癌的診斷主要依靠各種影像學(xué)檢查 （彩超、CT、磁共振等），配合血清腫瘤標(biāo)志物等實驗室檢查。但影像學(xué)檢查往往受限于設(shè)備及醫(yī)師的診斷經(jīng)驗，對于早期胰腺癌、轉(zhuǎn)移灶和血管侵犯的準(zhǔn)確診斷率較低，而且目前的腫瘤標(biāo)志物特異性不高，導(dǎo)致相當(dāng)大部分病人失去手術(shù)的最佳時機[2]。因此在改進影像學(xué)檢查設(shè)備及技術(shù)的同時，能夠給找到一種或幾種具特異性腫瘤標(biāo)志物，對提高胰腺癌的早期診斷率和判斷臨床預(yù)后有重要意義[3，4]。蛋白激酶C家族 （PKC）在多種癌癥中均有重要作用，PKC 家族包括典型蛋白激酶 cPKCs[α（α）、βI（βI），βII（βII），和 γ（γ）]、nPKCs[delta（δ），epsilon（ε），eta（η）和 theta（θ）]以及非典型蛋白激酶[zeta（ζ）和iota（ι）]，PKC 家族在腫瘤的發(fā)生、發(fā)展、轉(zhuǎn)移和凋亡過程中發(fā)揮重要作用，部分PKC高表達(dá)，部分PKC低表達(dá)。國內(nèi)外大量研究表明PKCι在非小細(xì)胞肺癌、結(jié)腸癌、卵巢癌中均有高表達(dá)，其中國外有研究表明PKCι在胰腺癌中高表達(dá)，但國內(nèi)尚未見相關(guān)報道[5]。本實驗采用免疫組織化學(xué)的方法測定PKCι在胰腺癌及癌旁組織中的表達(dá)情況，證實PKCι在胰腺癌組織中陽性表達(dá)率較高，為盡可能早期診斷胰腺癌、了解胰腺癌的發(fā)生、發(fā)展規(guī)律、判斷臨床治療預(yù)后提供依據(jù)，為提高胰腺癌的綜合治療效果提供新的方法。

1 資料與方法

1.1 標(biāo)本收集 標(biāo)本取自南昌大學(xué)第二附屬醫(yī)院2014年1月至2016年2月間30例胰腺癌組織和此30胰腺癌癌旁組織（距腫瘤均在3cm以上），經(jīng)病理檢查證實均為胰腺導(dǎo)管腺癌且臨床資料完整，男 19例，女 11例；年齡 42～68歲，平均 51.2歲。按美國癌癥聯(lián)合會AJCC分期（第8版），T1期4例、T2期 6例，T3期 20例、T4期 0例；按照病理分級，高分化21例，中、低分化9例。兩組患者術(shù)前均未接受任何手術(shù)治療及放、化療。

1.2 試劑 非典型蛋白激酶ι（PKC-iota）兔抗人單克隆抗體購于上海安妍生物技術(shù)公司。ABC試劑盒及DAB-HCL顯色試劑盒，購自武漢博德公司，染色步驟按免疫組化（三步法）進行，一抗稀釋度為 1∶100。 檸檬酸抗原修復(fù)液(0.01M，pH6.0)、磷酸鹽緩沖液(0.01M，pH7.2～7.4)、緩沖液、5%脫脂奶粉等為自行配制，組織裂解液、SDS-聚丙烯胺凝膠、NC膜購自北京賽坦因生物科技有限公司。

1.3 PKCι測定方法與結(jié)果判定

1.3.1 免疫組織化學(xué)法 兩組各30例標(biāo)本均按病理切片方法行4%多聚甲醛固定、常規(guī)石蠟包埋后切片機將標(biāo)本切4μm薄片，按常規(guī)方法行伊紅染色和免疫組織化學(xué)法染色。陽性表達(dá)以胞核中呈現(xiàn)黃色至棕色顆粒為特征，評分標(biāo)準(zhǔn)為免疫反應(yīng)分?jǐn)?shù)。染色強度標(biāo)準(zhǔn)：不著色為0分，淡黃色1分，黃色2分，棕黃色3分；陽性細(xì)胞百分比：≤5%為0分，6%～25%為 1分，26%～50%為 2分，51%-75%為3分，＞75%為4分。 免疫反應(yīng)分?jǐn)?shù)(immunoreactivescore，IRS)等于兩分值相乘，標(biāo)準(zhǔn)如下：0 陰性，1-4 弱陽性(+)，5～8 中等陽性(++)，9-12強陽性(+++)，陰性表達(dá)為陰性及弱陽性，陽性表達(dá)為中等陽性與強陽性。

1.3.2 蛋白印跡法蛋白印跡法 取胰腺癌標(biāo)本30份，癌旁組織標(biāo)本30份；各取2g加至已預(yù)冷的緩沖液中，剪碎后在0℃以下冰水中行冰水浴后再行超聲粉碎，高速離心器中保持4℃恒溫行高速離心，沉淀后取其上清液即細(xì)胞漿蛋白，將提取細(xì)胞漿蛋白后剩下的沉淀物用1ml胞膜蛋白提取液懸浮，超聲粉碎后放置并提取1h，再于高速離心器中保持4℃恒溫行高速離心1h，待沉淀后取其上清即為胞膜蛋白。將上述提取出的胞漿、胞膜蛋白進行蛋白定量，兩組提取物調(diào)定至等蛋白濃度備用。在Western-blot垂直電泳儀中行SDS-聚丙烯酰氨凝膠電泳30min，然后進行電轉(zhuǎn)印，蛋白質(zhì)經(jīng)電泳后轉(zhuǎn)移到NC膜上；分別加一抗及二抗后使用DABHCL顯色試劑盒進行DAB顯色反應(yīng)。顯色的NC膜經(jīng)UVP照相系統(tǒng)掃描成像，計算成像后曲線下面積可以得到定量凈光密度數(shù)據(jù)。

1.4 統(tǒng)計學(xué)分析 使用SPSS 19.0統(tǒng)計軟件包對所得各組實驗數(shù)據(jù)進行分析。各組間率的比較采用χ2檢驗進行統(tǒng)計學(xué)處理，定P＜0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 PKCι在胰腺癌組織和癌旁組織中的表達(dá)

2.1.1 免疫組織化學(xué)法 PKCι在胰腺導(dǎo)管腺癌組織中的表達(dá)主要定位于細(xì)胞核中（圖1），其陽性率為 80%（24/30）；癌旁組織為 20%（6/30），差異具有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）。

圖1 、圖2 胰腺癌組織(1A、1B)和癌旁組織(2C、2D)中PKCι的染色（圖中細(xì)胞核棕色為陽性）。

2.1.2 蛋白印跡法 胰腺癌組織細(xì)胞核中PKCι表達(dá)高于胰腺癌細(xì)胞膜、癌旁組織細(xì)胞核及癌旁組織細(xì)胞膜。

PKCι在胰腺癌與癌旁組織胞核、胞膜中的表達(dá)明顯不同。胰腺癌組織胞核PKCι的表達(dá)明顯高于癌旁組織胞核，其P＜0.05，差異有統(tǒng)計學(xué)意義。胰腺癌組織胞膜中PKCι則與癌旁組織胞膜、癌旁組織胞核無明顯區(qū)別，其P＞0.05，差異無統(tǒng)計學(xué)意義，說明PKCι主要存在于胰腺癌組織胞核中。

圖3 PKCι在各組織的WB圖

圖4 PKCι在胰腺癌與癌旁組織胞核、胞膜中的表達(dá)。

表1 PKCι在胰腺癌組織細(xì)胞核、胰腺癌組織細(xì)胞膜、癌旁組織細(xì)胞核、癌旁組織細(xì)胞膜的光密度值表

2.2 PKCι的表達(dá)與腫瘤分期、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移呈正相關(guān)，而與患者的年齡、性別均無明顯相關(guān)性。

表2 胰腺癌組織PKCι表達(dá)與胰腺癌臨床病理參數(shù)間的關(guān)系

3 討論

蛋白激酶PKC家族于1977年被日本科學(xué)家Nishzuka首先發(fā)現(xiàn)，PKC家族是一組結(jié)構(gòu)相近的絲/蘇氨酸蛋白激酶，其中包含有多種同工酶，動物體內(nèi)多種組織均可檢測到其活性，蛋白激酶C（PKC）同工酶在許多細(xì)胞功能中發(fā)揮重要的調(diào)控作用，包括增殖控制、腫瘤的非控制生長和人類癌細(xì)胞的存活。近年來已經(jīng)有大量前瞻性研究表明，多種人類腫瘤組織中均可見到PKC家族活性表達(dá)異常[6-9]。對PKC家族及其抑制物的研究對于揭示腫瘤的發(fā)生發(fā)展機制及提高腫瘤的防治率均有重大意義。PKC酶家族分為3組：傳統(tǒng)的鈣依賴cPKCs[α（α）、βI（βI），βII（βII），和 γ（γ）]；新發(fā)現(xiàn)的非 鈣 依 賴 nPKCs[delta（δ），epsilon（ε），eta（η）和theta（θ）]；非典型蛋白激酶[zeta（ζ）和 iota（ι）]。 然而經(jīng)過詳細(xì)的研究，到目前為止，只有一個PKC同工酶，即非典型PKC-iota(PKCι），已被證明能滿足人類致癌基因的標(biāo)準(zhǔn)[10-12]。有研究表明，PKCι的過度表達(dá)，在非小細(xì)胞肺癌（NSCLC）、卵巢癌和結(jié)腸癌的腫瘤生長中起著至關(guān)重要的作用。在肺鱗狀細(xì)胞癌與卵巢漿液性癌，PKCι表達(dá)往往是腫瘤特異性prkci基因擴增的結(jié)果。有文獻(xiàn)表明，很多癌基因 例 如 V-SiS，Verb，r-ras，PKC-α 等 都 可 激 活PKCι發(fā)揮其致癌作用，這個激活過程是個不斷增強的正反饋反應(yīng)，即各種致癌物質(zhì)可以直接或通過激活癌基因間接激活PKCι，被激活后的PKCι又可激活基因來源相同的同源癌基因，同時已活化的PKCι向正常組織細(xì)胞核內(nèi)轉(zhuǎn)移，從而將致癌基因的遺傳密碼引入細(xì)胞核內(nèi)，使致癌基因表達(dá)相應(yīng)蛋白產(chǎn)物，該已表達(dá)的產(chǎn)物又可反向激活PKCι，整個致癌過程循環(huán)往復(fù)，使癌癥基因信息以正反饋形式不斷地在體內(nèi)加強、擴大，最終導(dǎo)致正常細(xì)胞增殖不受控制，致使組織癌變[13，14]。本研究表明PKCι在胰腺癌組織中存在陽性表達(dá)，其與腫瘤分期、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移呈正相關(guān)，而與患者的年齡、性別均無明顯相關(guān)性。據(jù)相關(guān)文獻(xiàn)報道，胰腺導(dǎo)管腺癌占胰腺癌90%以上，本次實驗標(biāo)本均為導(dǎo)管腺癌，至于其他類型胰腺癌中PKCι表達(dá)情況暫無標(biāo)本進行研究。本研究為了解胰腺癌的發(fā)生、發(fā)展機制提供了新的線索。在不遠(yuǎn)的將來我們使用PKCι抑制劑如金硫代蘋果酸鹽（ATM）靶向治療胰腺癌[15-17]，從而有可能為我們治療胰腺癌找到一條新的思路，大大提高胰腺癌的治療效果。