王繹尊

摘 要：MicroRNA（miRNA）是一類內(nèi)生的、長(zhǎng)度約20～24個(gè)核苷酸的小RNA，目前動(dòng)植物的miRNA研究已經(jīng)開(kāi)展多年，幾個(gè)miRNAs也可以調(diào)節(jié)同一個(gè)基因，機(jī)體可以通過(guò)幾個(gè)miRNAs的組合來(lái)精細(xì)調(diào)控某個(gè)基因的表達(dá)，進(jìn)而產(chǎn)生某些特定的性狀。據(jù)推測(cè)，miRNA調(diào)節(jié)著人類三分之一的基因。本文針對(duì)目前國(guó)內(nèi)外對(duì)于miRNA的研究手段及研究過(guò)程中所遇到的問(wèn)題進(jìn)行論述，展望未來(lái)miRNA的發(fā)展。

關(guān)鍵詞：miRNA；northen blot；熒光定量PCR；miRNA芯片

研究目的：一小部分miRNA被發(fā)現(xiàn)有著調(diào)節(jié)細(xì)胞生長(zhǎng)，組織分化的作用，因而與生命過(guò)程中發(fā)育，疾病有關(guān)。例如，miR-273和ly56，編碼的miRNA的研究在醫(yī)學(xué)上是一個(gè)極受關(guān)注的領(lǐng)域。

一、研究背景

DNA、RNA和蛋白質(zhì)是生命科學(xué)研究的三大主體，DNA、RNA和蛋白質(zhì)之間的關(guān)系是經(jīng)典和現(xiàn)代化法則的核心內(nèi)容；通常情況下，RNA是DNA和蛋白質(zhì)之間的“過(guò)渡”。近年來(lái)的研究表明，RNA在生命進(jìn)程中扮演的角色遠(yuǎn)比我們?cè)缒暝O(shè)想的更為重要。

二、主要研究手段

northen blot（諾瑟雜交）：Northen blot（諾瑟雜交）是一種通過(guò)檢測(cè)RNA的表達(dá)水平來(lái)檢測(cè)基因表達(dá)的方法，通過(guò)northern blot的方法可以檢測(cè)到細(xì)胞在生長(zhǎng)發(fā)育特定階段或者脅迫或病理環(huán)境下特定基因表達(dá)情況。Northen blot首先通過(guò)電泳的方法將不同的RNA分子依據(jù)其分子量大小加以區(qū)分，然后通過(guò)與特定基因互補(bǔ)配對(duì)的探針雜交來(lái)檢測(cè)目的片段。

熒光定量PCR（Polymerase Chain Reaction聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)）：熒光定量PCR（ realtime fluorescence quantitative PCR，RTFQ PCR）是1996 年由美國(guó)Applied Biosystems公司推出的一種新定量試驗(yàn)技術(shù)，它是通過(guò)熒光染料或熒光標(biāo)記的特異性的探針，對(duì)PCR產(chǎn)物進(jìn)行標(biāo)記跟蹤，實(shí)時(shí)在線監(jiān)控反應(yīng)過(guò)程，結(jié)合相應(yīng)的軟件可以對(duì)產(chǎn)物進(jìn)行分析，計(jì)算待測(cè)樣品模板的初始濃度，而熒光定量PCR對(duì)檢測(cè)miRNA主要有兩種比較常見(jiàn)的手段：①TaqMan熒光探針?lè)ǎ涸摲椒ㄔ谔禺愋蕴结樀膬啥朔謩e標(biāo)記一個(gè)報(bào)告熒光基團(tuán)和一個(gè)淬滅熒光基團(tuán)。當(dāng)探針完整時(shí)，熒光基團(tuán)發(fā)光被淬滅基團(tuán)吸收；在PCR擴(kuò)增過(guò)程中，探針被降解，熒光基團(tuán)與淬滅基團(tuán)分離，發(fā)出可被檢測(cè)到的熒光，以此來(lái)監(jiān)測(cè)整個(gè)PCR過(guò)程；②SYBR熒光染料法：該方法利用了SYBRGreen熒光染料非特異性與雙鏈DNA結(jié)合并發(fā)光的特性檢測(cè)PCR的全部進(jìn)程，從而判定初始RNA的量。

三、研究手段對(duì)比

Norhten blot相對(duì)熒光定量PCR會(huì)比較精確，但是相對(duì)操作難度較大，由于需要采用瓊脂糖凝膠電泳，隨后將其原位轉(zhuǎn)移至固相支持物上，再用放射性（或非放射性）標(biāo)記的12DNA或RNA探針，依據(jù)其同源性進(jìn)行雜交，最后進(jìn)行放射自顯影，實(shí)驗(yàn)步驟繁雜，而且由于存在轉(zhuǎn)移和雜交過(guò)程，可能會(huì)對(duì)實(shí)驗(yàn)結(jié)果存在影響。

四、研究方向

多種miRNA的功能和miRNA的可調(diào)控性。

五、目前的研究進(jìn)度

目前大多數(shù)miRNA的功能仍然是個(gè)謎，人們發(fā)現(xiàn)了小部分但較富有價(jià)值的miRNA的功能，如1L-21 miRNA（限制一種最常見(jiàn)形式的艾滋病毒的復(fù)制），Mirc19（在衰老過(guò)程中調(diào)控造血干細(xì)胞的維持和生存），并且一些miRNA具有多種功能，有些miRNA甚至具有功能選擇性，發(fā)表在大學(xué)的研究團(tuán)隊(duì)對(duì)人類和小鼠基因組中的初級(jí)miRNA的轉(zhuǎn)錄本進(jìn)行了全面注釋。DROSHA酶在miRNA的加工中負(fù)責(zé)剪切pri-miRNA。研究人員用一個(gè)顯性負(fù)突變的DROSHA穩(wěn)定了人類和小鼠細(xì)胞中的pti-miRNA。隨后他們對(duì)細(xì)胞核RNA進(jìn)行了深度測(cè)序，并通過(guò)計(jì)算工具StringTie來(lái)組裝轉(zhuǎn)錄本。研究通過(guò)這種方式，注釋了69%的人類miRNA和75%的白鼠miRNA。過(guò)去人們普遍認(rèn)為，簇集在一起的miRNA是共轉(zhuǎn)錄的。但研究人員發(fā)現(xiàn)，一些miRNA簇其實(shí)具有選擇性啟動(dòng)子，這令研究人員十分吃驚。研究進(jìn)度幾乎可以認(rèn)為直接取決于目前的技術(shù)水平，而由上文的研究手段可以看出，目前對(duì)miRNA的研究只停留在探測(cè)階段，甚至對(duì)miRNA的探測(cè)技術(shù)也并不完善，northen blot與熒光定量PCR這兩種技術(shù)對(duì)miRNA的探測(cè)仍然有很大的缺陷和誤差，已被發(fā)現(xiàn)的miRNA的功能種類相對(duì)于整個(gè)miRNA體系可謂是滄海一栗，而且每個(gè)miRNA的功能都很強(qiáng)大，不可能直接將miRNA應(yīng)用到醫(yī)學(xué)中，因此miRNA的研究仍然有很大空間。

六、目前已發(fā)現(xiàn)的部分miRNA及其作用

調(diào)控疾病的發(fā)生與發(fā)展。疾病、相關(guān)miRNAs 、流感 miR-21，miR-223 、丙型肝炎miR-122，miR-155 、艾滋病 miR-28，miR-125b，miR-223，miR-382、二型miR-144，miR-150，miR-182，miR-103，miR-107、系統(tǒng)性紅斑狼瘡 miR-146a。

七、未來(lái)觀望

目前一部分miRNA的功能的認(rèn)知缺乏是由于現(xiàn)代的技術(shù)限制，northern blot為檢測(cè)miRNA的主要手段，缺點(diǎn)為敏感度低（許多mblot為檢測(cè)miRNA的主要手段，缺點(diǎn)為敏感度低（許多miRNA都可能檢測(cè)不到），耗時(shí)長(zhǎng)，RNA的用量較大。另一種方法為熒光定量PCR，相對(duì)northern blot的半定量技術(shù)，熒光定量PCR為精確定量，但耗材較貴，也只能探究mblot的半定量技術(shù)，熒光定量PCR為精確定量，但耗材較貴，也只能探究miRNA的量。而最可能與最首要的便是改變對(duì)miRNA的研究技術(shù)，目前除了northen blot和熒光定量PCR這兩種主要技術(shù)外，還存在一種技術(shù)叫做Agilent miRNA芯片（Agilent miRNA芯片是miRNA芯片中的一種，也存在其他miRNA芯片，因?yàn)锳gilent miRNA芯片缺點(diǎn)更少，故以該技術(shù)為例），相對(duì)與northen blot與熒光定量PCR而言，Agilent miRNA芯片具有以下優(yōu)點(diǎn)：①特殊的探針設(shè)計(jì)，保證只識(shí)別成熟miRNA；②高靈敏度，可識(shí)別一個(gè)堿基差異，檢測(cè)下限<0.1amol；③寬的動(dòng)態(tài)檢測(cè)范圍：檢測(cè)豐度跨5～6個(gè)logs，有利于檢測(cè)到更寬豐度范圍的miRNA；④高重復(fù)探針，每個(gè)miRNA重復(fù)約20次，數(shù)據(jù)更精準(zhǔn)；⑤樣品需求量低，只需要100mg總miRNA；⑥不需要分離miRNA，避免丟失及引起誤差。

八、結(jié)論

miRNA芯片技術(shù)是針對(duì)miRNA研發(fā)的，相對(duì)northen blot與熒光定量PCR對(duì)miRNA的檢測(cè)也更加專業(yè)與深入，未來(lái)的miRNA研究技術(shù)極大可能是以這種mirRNA芯片技術(shù)為基礎(chǔ)來(lái)研發(fā)的，但目前由于miRNA芯片技術(shù)大多被商業(yè)化，以及基金問(wèn)題，miRNA芯片技術(shù)沒(méi)有及時(shí)得到推廣，但未來(lái)這種技術(shù)可能會(huì)隨著基金的增長(zhǎng)與該技術(shù)的不斷改進(jìn)被普及，相信不久后，miRNA的研究又會(huì)更上一個(gè)臺(tái)階。

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