李 琰，慕珂珂，董炎紅，蔣曉欽

(中國人民解放軍第一五三中心醫(yī)院檢驗科，河南 鄭州 450007)

潰瘍性結(jié)腸炎(ulcerative colitis，UC)是臨床常見慢性腸道疾病，近年來發(fā)病率明顯上升[1]。目前認為UC發(fā)病與遺傳、免疫、環(huán)境、感染及心理應(yīng)激等多因素有關(guān)[2]。且近年來，研究發(fā)現(xiàn)，結(jié)腸黏膜炎癥反應(yīng)可誘發(fā)自身免疫異常，造成級聯(lián)性免疫反應(yīng)及細胞凋亡，導(dǎo)致炎癥持續(xù)反復(fù)發(fā)作[3]。而腸道黏膜免疫細胞對病原微生物清除主要通過吞噬與自噬兩種途徑，前者系殺滅細胞內(nèi)微生物的細胞防御機制，由TLR-LC3/beclin1介導(dǎo)，巨噬細胞吞噬微粒并活化TLR，促進自噬體分子LC3聚集至吞噬體，促進吞噬體與自噬體融合，引起快速酸性化反應(yīng)，殺滅吞噬外源物[3]。其中Beclin為人類特異性自噬相關(guān)基因，其可與PI3K結(jié)合形成復(fù)合物，作用于ATG自噬基因，調(diào)節(jié)自噬活性[4]。但對其在UC發(fā)病中的確切機制尚未見報道。C反應(yīng)蛋白(CRP)則為與組織損傷及炎癥相關(guān)性的急性時相反應(yīng)蛋白，對機體炎癥反應(yīng)有較高的敏感度，常用于UC輔助診斷中。25羥維生素D[25(OH)D]則為維生素D在體內(nèi)存在的關(guān)鍵形式，不僅參與鈣磷代謝，同樣對感染、機體免疫存在一定的調(diào)節(jié)作用。近年來發(fā)現(xiàn)大部分炎癥性常伴患者均存在維生素D缺乏表現(xiàn)[5]。本文探討血清CRP、Beclin1、25(OH)D聯(lián)合檢測對UC病情活動性評估的臨床價值，現(xiàn)報道如下。

1 資料與方法

1.1一般資料2015年1月至2017年10月我院收治的100例UC患者。納入標準：年齡>18歲；均經(jīng)結(jié)腸鏡確診為UC；臨床表現(xiàn)為持續(xù)、反復(fù)發(fā)作腹瀉，伴腹痛，里急后重，黏液凝血；結(jié)腸鏡下見黏膜血管紋理模糊或紊亂、充血、水腫，見膿性分泌物附著，病變處見明顯多發(fā)性潰瘍或彌漫性糜爛；病情分級參照Truelove-wiffs內(nèi)鏡下分級標準，分為緩解期、活動期(Ⅰ～Ⅲ級)；患者及家屬知情同意。排除標準：合并嚴重心肝腎肺疾病者；合并類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎、系統(tǒng)性紅斑狼瘡者；感染性、寄生蟲性、放射性、缺血性自身結(jié)腸炎者；合并嚴重精神疾病者；既往有腸道切除史者；有非甾體類抗炎藥物及質(zhì)子泵抑制劑長期應(yīng)用史者；乙醇成癮者；合并內(nèi)分泌及代謝性疾病者；妊娠及哺乳期女性。其中男59例，女41例；年齡20～76歲[(49.5±10.7)歲]；居住地：城鎮(zhèn)67例，農(nóng)村33例；其中緩解期28例，活動期72例(Ⅰ級26例，Ⅱ級34例，Ⅲ級12例)。

1.2Truelovee-wiffs內(nèi)鏡下分級標準[6]Ⅰ級：內(nèi)鏡下檢查見接觸性出血、水腫、黏液附著；Ⅱ級：鏡下見黏膜脆性增加，伴點狀出血、顆粒樣改變，有黃色或綠色膿液，擦拭見潰瘍；Ⅲ級：鏡下見明顯黏膜水腫，有膿血性滲出，潰瘍大片融合，見血性滲出物。

1.3主要儀器與試劑微量高速離心機-TG16 W(北京永光明醫(yī)療儀器廠)，紫外分光光度計(上海圣科設(shè)備有限公司)，酶標儀(芬蘭Lab systems Multiskan MS公司，450 nm)，Cobas 6000型全自動生化免疫分析儀(羅氏公司)；Beclin 酶聯(lián)免疫(ELISA)試劑盒、鼠抗人Beclin1單克隆抗體、辣根酶標記羊抗兔/小鼠二抗試劑盒(美國Santa Cruz公司)，引物設(shè)計及合成(上海Sangon Biotech公司)，CRP檢測試劑盒(福州邁新生物科技有限公司)。

1.4方法所有患者入院后均采集空腹肘靜脈血3 ml，3000 r/min離心5 min，分離血清，采用全自動生化免疫分析儀，應(yīng)用電化學(xué)發(fā)光法測定外周血25(OH)D水平，嚴格按照試劑使用說明進行操作；采用免疫比濁法測定血清CRP水平；采用ELISA法測定血清Beclin1水平，設(shè)置標準品孔、樣本孔、空白孔，標準品孔內(nèi)加0.75～12 ng/ml標準品50 μl，加入辣根過氧化物酶標記抗體50 μl；待測樣品孔加入待測樣本10 μl+稀釋液40 μl+辣根過氧化物酶標記抗體50 μl，封孔，室溫孵育1 h，加洗滌液，靜置60 s，棄洗滌液，清除水分，洗板6次，加入底物，37 ℃避光孵育15 min，加入終止液，采用紫外分光光度計測定450 nm波長各孔吸光度(OD)值。

1.5統(tǒng)計學(xué)方法采用SPSS 19.0統(tǒng)計學(xué)軟件分析數(shù)據(jù)，計量資料以均數(shù)±標準差表示，組間比較采用t檢驗，計數(shù)資料比較采用χ2檢驗，相關(guān)性分析采用Spearman相關(guān)分析，并繪制各指標反應(yīng)疾病活動性的ROC曲線，計算Youden指數(shù)。P<0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1不同病情活動性UC患者血清CRP、Beclin1、25(OH)D水平比較活動期UC患者血清CRP、Beclin1水平均高于緩解期，25(OH)D低于緩解期，其中Ⅱ～Ⅲ級患者CRP、Beclin1高于Ⅰ級，25(OH)D低于Ⅰ級，Ⅲ級患者血清CRP、Beclin1水平高于Ⅱ級，25(OH)D水平低于Ⅱ級(P<0.05)，見表1。

表1 不同病情活動性UC患者血清CRP、Beclin1、25(OH)D水平比較

2.2血清各指標與UC疾病活動性相關(guān)性分析CRP、Beclin1表達與UC緩解期無相關(guān)性(P>0.05)，CRP、Beclin1與UC活動期內(nèi)鏡下分級呈正相關(guān)，25(OH)D與UC活動期內(nèi)鏡下分級呈負相關(guān)(P<0.05)，見表2。

表2 血清各指標與UC疾病活動性相關(guān)性分析

2.3血清各指標對UC活動期診斷ROC分析當CRP為3.02 mg/L，Beclin1為2.00 ng/ml，25(OH)D為20 ng/ml時，以Beclin1診斷UC活動期敏感度最高，其次為CRP，但三者聯(lián)合診斷敏感度、特異度及Youden指數(shù)最高，見表3。ROC曲線圖見圖1。

表3 血清各指標對UC活動期診斷ROC分析

圖1 各指標診斷UC活動期ROC曲線

3 討論

UC屬慢性非特異性炎癥性疾病，發(fā)生于直、結(jié)腸，表現(xiàn)為腹瀉、腹痛、里急后重、黏液膿血便等特點，其疾病活動期癥狀表現(xiàn)與急性時相性反應(yīng)類似，可伴明顯白細胞計數(shù)、血沉、血小板計數(shù)等水平發(fā)生改變，但作為臨床診斷診斷敏感度及特異度均較低，無法動態(tài)反映UC患者腸道炎癥活動狀態(tài)[7]。目前臨床用于評估UC病情方式主要為內(nèi)鏡檢查及結(jié)腸鏡檢查，兩者均有入侵性，患者耐受性差，痛苦大，可接受度低[8]。而尋求準確、快捷且無創(chuàng)的監(jiān)測指標評估UC病情已成為臨床研究者關(guān)注的重點課題。

CRP為重要炎癥標志物，屬機體炎癥反應(yīng)血清高敏感度標志物，當機體發(fā)生炎癥或損傷時，巨噬細胞釋放大量炎癥遞質(zhì)，刺激肝臟合成無活性維生素K依賴性蛋白，與凝血酶結(jié)合轉(zhuǎn)化為活化CRP，強化吞噬細胞活性，促進細胞凋亡，同時可增加單核細胞表面組織因子表達，放大免疫效應(yīng)，加重組織損傷[9]。早期研究發(fā)現(xiàn)，炎癥性疾病及惡性腫瘤患者均伴血清CRP水平明顯上調(diào)[10]。也有學(xué)者[11]指出大部分UC患者均伴高CRP水平。本研究發(fā)現(xiàn)，UC活動期患者CRP水平明顯高于UC緩解期，且隨活動期患者病情的進展，CRP水平逐漸上升，與Schoepfer等[12]研究結(jié)論相符。同時進行相關(guān)性分析發(fā)現(xiàn)，CRP與UC患者活動性呈正相關(guān)，提示CRP可能參與UC病情進展。

25(OH)D為體內(nèi)維生素D的表現(xiàn)形式，屬具生物活性脂溶性類固醇衍生物，可與維生素D受體結(jié)合發(fā)揮生物學(xué)效應(yīng)，調(diào)節(jié)鈣磷代謝，在維持骨骼、牙齒正常發(fā)育中有重要作用。近年來發(fā)現(xiàn)，維生素D及其受體在拮抗細菌感染及調(diào)節(jié)機體免疫中均有其作用[13]。楊劍等[14]表示，維生素D為炎癥性腸病關(guān)鍵的環(huán)境因子，可調(diào)節(jié)機體適應(yīng)性免疫反應(yīng)，抑制淋巴細胞增殖，下調(diào)免疫應(yīng)答反應(yīng)。托靜美等[15]發(fā)現(xiàn)，有超過50%的炎性腸病患者均伴維生素D缺乏。本研究發(fā)現(xiàn)，UC活動期患者25(OH)D水平較緩解期明顯降低，且隨病情嚴重程度的提升，25(OH)D水平逐漸降低，且相關(guān)性分析顯示，25(OH)D水平與UC疾病活動性呈負相關(guān)，提示25(OH)D缺乏可能在UC疾病活動及進展過程中發(fā)揮重要作用。

Beclin1則為與自噬相關(guān)特異性基因，可抑制細胞周期增殖、腫瘤新生血管生成及機體炎癥反應(yīng)，可通過調(diào)節(jié)其他自噬基因蛋白在自噬前體結(jié)構(gòu)中的定位來調(diào)節(jié)機體自噬活性，其表達上調(diào)提示機體自噬水平強化。熊真[16]發(fā)現(xiàn)，在正常黏膜組織中，Beclin1表達極低，而病理及應(yīng)激狀態(tài)可刺激Beclin1表達，且隨著病情加重，Beclin1表達上升。也有研究者發(fā)現(xiàn)，自噬蛋白過度表達提示機體炎癥反應(yīng)強化，可作為炎癥性腸病診斷的依據(jù)[17，18]。本研究對UC患者血清Beclin1水平進行監(jiān)測發(fā)現(xiàn)，UC患者血Beclin1處于高水平，且活動期患者血Beclin1水平明顯高于緩解期，同時隨UC活動性提升，Beclin1水平逐漸上調(diào)，分析可能原因為Beclin1過度自噬可能引起結(jié)腸炎癥，增加病原菌感染風(fēng)險，導(dǎo)致自身免疫功能異常，誘導(dǎo)缺氧缺血性應(yīng)激反應(yīng)。

此外，本研究還發(fā)現(xiàn)，CRP、25(OH)D、Beclin1三者均對UC活動期診斷有較高的敏感度，但前兩者特異度較低，單項檢測中以Beclin1綜合價值最高，但三者聯(lián)合診斷可提高UC活動期診斷的敏感度、特異度均較高，可彌補單項診斷的缺陷。