張金旺 李代麗 尚峰男 阿茹娜 鐵 龍 王 君 姜 鵬

(1. 內(nèi)蒙古通遼市林業(yè)科學(xué)研究院，內(nèi)蒙古 通遼 028000；2. 北京市黃垡苗圃，北京 102601；3. 北京林業(yè)大學(xué)林木育種國家工程實(shí)驗(yàn)室，林木花卉遺傳育種教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，生物科學(xué)與技術(shù)學(xué)院，北京 100083)

楊樹 (Populusspp.) 是中國北方地區(qū)重要的造林樹種，尤其在 “三北防護(hù)林體系” 建設(shè)中發(fā)揮重要價(jià)值[1]。近年來，隨著林木育種技術(shù)的不斷進(jìn)步以及國家對(duì)林木種業(yè)的高度重視，楊樹速生優(yōu)良新品種的選育速度逐漸加快。然而，由于楊樹馴化歷史相對(duì)悠久，新品種遺傳基礎(chǔ)狹窄，且生物學(xué)性狀受生長發(fā)育階段和環(huán)境影響較大，單純以形態(tài)學(xué)差異作為品種區(qū)分標(biāo)準(zhǔn)越發(fā)困難，而且不利于新品種權(quán)的保護(hù)[2]。為保證品種的特異性，利用分子標(biāo)記技術(shù)開展遺傳分析并構(gòu)建指紋圖譜信息已逐漸成為品種鑒定的重要手段及良種審定的基本信息。

在眾多分子標(biāo)記技術(shù)中，簡單重復(fù)序列 (SSR) 分子標(biāo)記以其多態(tài)性高、重復(fù)性好、共顯性、多等位位點(diǎn)變異、成本低廉等優(yōu)點(diǎn)，在林木遺傳育種研究中日漸受到青睞[3]。Yin等[4]在毛果楊 (P.trichocarpa) 測序[5]完成后公布了大量的楊樹SSR引物信息，以及一批楊樹EST-SSR信息的發(fā)表[6-7]極大地推動(dòng)了楊樹SSR分子標(biāo)記技術(shù)在楊樹品種鑒定、親本分析、遺傳圖譜構(gòu)建等的應(yīng)用[2,8-15]。其中，賈會(huì)霞等[2]利用SSR分子標(biāo)記技術(shù)構(gòu)建包括 ‘中林46’ (P.×euramericanacl. ‘Zhonglin 46’)、‘中懷1號(hào)’ (P.deltoidescl. ‘Zhonghuai 1’) 等24個(gè)楊樹新品種指紋圖譜的同時(shí)，甚至發(fā)現(xiàn)其中存在5個(gè)三倍體品種。然而，對(duì)在中國東北地區(qū)廣泛栽培的 ‘白城’ 系列、‘黑林’ 系列等楊樹品種的分子鑒定研究較少。本研究對(duì)中國北方地區(qū)的15個(gè)楊樹栽培品種進(jìn)行了收集，在利用流式細(xì)胞儀和染色體技術(shù)法進(jìn)行倍性分析的基礎(chǔ)上，進(jìn)一步利用SSR分子標(biāo)記技術(shù)進(jìn)行了遺傳基礎(chǔ)分析，豐富了楊樹栽培種的指紋圖譜庫，為繼續(xù)開展北方地區(qū)楊樹遺傳改良提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料來源

供試的15份楊樹品種 (表1) 收集后保存于內(nèi)蒙古通遼市林科院舍伯吐苗圃，春季從扦插苗上摘取新鮮幼嫩葉片，液氮冷凍后保存于-80 ℃冰箱中待用。同時(shí)，采集少量幼嫩葉片利用流式細(xì)胞儀 (BD FACSCalibur) 分析其倍性水平；莖尖材料用于染色體制片。

表1 試驗(yàn)材料Table 1 Experimental materials

1.2 研究方法

1.2.1倍性檢測

對(duì)所有15個(gè)品種首先通過流式細(xì)胞儀進(jìn)行倍性分析。參考Galbraith等[16]的方法，取50 mg待測植株的幼嫩葉片，置于冰上，加入1 mL預(yù)冷的細(xì)胞核分離緩沖液 (45 mmol/L MgCl2·6H2O, 20 mmol/L MOPS, 30 mmol/L Sodium citrate, 1% PVP-10, 0.5% Triton X-100, pH 7.0)，用刀片迅速剁60 s成碎片。包含細(xì)胞核的分離緩沖液經(jīng)40 μm孔徑紗網(wǎng)過濾后，向?yàn)V液中加入含有50 μg/mL RNA酶的50 μg/mL PI (propidium iodide) 溶液，混合均勻，置冰浴中孵育染色30 min。使用BD公司生產(chǎn)的FACSCalibur流式細(xì)胞儀進(jìn)行細(xì)胞核DNA含量分析。

對(duì)經(jīng)流式細(xì)胞儀篩選出的多倍體品種，利用壓片法進(jìn)行了體細(xì)胞染色體計(jì)數(shù)。參考王君等[17]的方法，取生長旺盛的莖尖材料，經(jīng)飽和對(duì)二氯苯預(yù)處理3～4 h后，用卡諾固定液在4 ℃下固定2～24 h，然后用解離液 (V(38%HCl)∶V(乙醇)=1∶1) 解離20～25 min，改良卡寶品紅染色壓片，Olympus BX51顯微鏡下觀察15～20個(gè)分裂相，并采用Olympus DP70數(shù)碼攝像系統(tǒng)拍照。

1.2.2葉片DNA的提取

各樣品葉片DNA采用植物基因組DNA提取試劑盒 (天根生化科技 (北京) 有限公司)，根據(jù)說明書進(jìn)行提取。抽提的DNA經(jīng)1%瓊脂糖凝膠電泳檢測含量后保存于-20 ℃待用。

1.2.3SSR引物的篩選

從Yin等[4]和Du等[7]所報(bào)道的楊樹SSR引物中選取150對(duì)進(jìn)行序列合成，對(duì)遺傳背景差異較大的4份品種樣品通過聚丙烯酰胺凝膠電泳法進(jìn)行引物篩選，選出12對(duì)擴(kuò)增條帶清晰、具有多態(tài)性且重復(fù)性好的引物 (表2) 進(jìn)行毛細(xì)管電泳檢測。

表2 篩選出的12對(duì)SSR引物信息表Table 2 Information of screened 12 pairs of SSR primers

1.2.4毛細(xì)管電泳檢測與數(shù)據(jù)分析

采用TP-M13-SSR法進(jìn)行PCR擴(kuò)增，PCR產(chǎn)物的毛細(xì)管電泳檢測由北京睿博興科生物科技有限公司完成。SSR-PCR體系為20 μL，包括10～15 ng基因組DNA，10 μL 2 × Master Mix (北京擎科新業(yè)生物技術(shù)有限公司)，0.4 pmol正向引物，1.6 pmol反向引物和1.6 pmol通用熒光引物。PCR反應(yīng)程序?yàn)椋?4 ℃預(yù)變性5 min；94 ℃變性30 s，56 ℃退火45 s，72 ℃延伸45 s，30個(gè)循環(huán)；94 ℃變性30 s，53 ℃退火45 s，72 ℃延伸45 s，8個(gè)循環(huán)；72 ℃繼續(xù)延伸10 min。

1.2.5數(shù)據(jù)分析

參照麻麗穎等[18]的方法，利用Gene-Marker軟件 (Soft Genetics LLC, USA) 對(duì)毛細(xì)管電泳檢測結(jié)果進(jìn)行數(shù)據(jù)分析。Gene-Marker軟件獲得的原始數(shù)據(jù)經(jīng)Flexibin程序[19]修正后轉(zhuǎn)化成0，1格式，建立原始矩陣后用NTSYS-pc 2.10e軟件[20]進(jìn)行后續(xù)分析。其中，多態(tài)性等位變異百分率=(k/n)×100%，式中k是多態(tài)等位變異數(shù)，n為所測等位變異總數(shù)；特異性等位變異百分率=(s/n)×100%，式中s為特異等位變異數(shù)，n為所測等位變異總數(shù)。利用NTSYS-pc 2.10e軟件計(jì)算任意2個(gè)品種間的相似系數(shù) (GS)：GS=2Nij/(Ni+Nj)，式中Nij為材料i和j共有的擴(kuò)增片段總數(shù)，Ni為材料i中出現(xiàn)的擴(kuò)增片段數(shù)，Nj為材料j中出現(xiàn)的擴(kuò)增片段數(shù)。對(duì)各供試材料采用非加權(quán)組平均法 (UPGMA) 進(jìn)行聚類分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 三倍體種質(zhì)的發(fā)現(xiàn)

經(jīng)流式細(xì)胞分析及染色體計(jì)數(shù)發(fā)現(xiàn)，在供試的15個(gè)品種中，存在2份三倍體 (2n=3x=57，圖1) 種質(zhì)，分別為 ‘黑林1號(hào)楊’ 和 ‘白林3號(hào)楊’，其余均為二倍體 (2n=2x=38)，表明在北方地區(qū)栽培的楊樹品種中存在一些三倍體種質(zhì)，這些品種在選育過程中正是由于其生長優(yōu)勢而被選中。

a和b分別為二倍體 ‘哲引3號(hào)楊’ 的流式細(xì)胞分析及染色體壓片；c和d分別為三倍體 ‘黑林1號(hào)楊’ 的流式細(xì)胞分析及染色體壓片。

圖1‘哲引3號(hào)楊’和‘黑林1號(hào)楊’的倍性分析
Fig.1 Determination of ploidy levels ofP. × ‘Zheyin3’ andP. × ‘Heilin 1’

2.2 SSR引物多態(tài)性分析

利用篩選的12對(duì)SSR引物在供試的15個(gè)品種中共擴(kuò)增出106個(gè)等位變異，其中多態(tài)性等位變異105個(gè)，多態(tài)性等位變異百分率為99.06%。各對(duì)引物擴(kuò)增的多態(tài)性等位變異數(shù)量為2～13個(gè)，平均每對(duì)引物能擴(kuò)增出8.75個(gè)多態(tài)性等位變異，引物L(fēng)G1216擴(kuò)增的多態(tài)性等位變異數(shù)最少 (2個(gè))，而引物L(fēng)G1714擴(kuò)增的多態(tài)性等位變異數(shù)最多，達(dá)13個(gè)。12對(duì)引物共擴(kuò)增出特異性等位變異46個(gè)，特異性等位變異率為43.40%。各引物擴(kuò)增的特異性等位變異數(shù)量變化為0～8個(gè)，平均每對(duì)引物能擴(kuò)增出3.83個(gè)特異性等位變異，引物L(fēng)G1216和LG1930沒有擴(kuò)增出特異性等位變異，而引物L(fēng)G1224擴(kuò)增出了8個(gè)特異性等位變異 (表3)。

表3 SSR引物的多態(tài)性檢測Table 3 Polymorphism detection of SSR primers

圖2是引物L(fēng)G1926在對(duì)部分品種中的擴(kuò)增圖譜。

圖2引物L(fēng)G1926在4個(gè)品種中的毛細(xì)管電泳檢測
Fig.2 Analysis of capillary electrophoresis detection of 4 samples with LG1926 primer

2.3 指紋圖譜構(gòu)建

引物L(fēng)G1926可區(qū)分除 ‘黑林3號(hào)楊’ 和 ‘法庫1號(hào)楊’ 之外的13個(gè)品種，而利用引物L(fēng)G1937可區(qū)分除 ‘箭黑楊楊’ 和 ‘法庫1號(hào)楊’ 之外的13個(gè)品種，將兩者進(jìn)行組合，可對(duì)本研究的所有15個(gè)品種進(jìn)行有效區(qū)分。因此，選擇LG1926和LG1937這2對(duì)引物，對(duì)毛細(xì)管電泳的等位位點(diǎn)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)，以每個(gè)標(biāo)記在樣本上擴(kuò)增的等位位點(diǎn)分子量大小作為帶型編號(hào)，按照固定引物排列順序綜合不同引物擴(kuò)增結(jié)果，串聯(lián)各帶型編號(hào)，構(gòu)建了本研究15個(gè)品種的SSR指紋圖譜，具體結(jié)果見表4。

表4 15個(gè)楊樹栽培品種的SSR指紋圖譜Table 4 SSR fingerprint of 15 Populus cultivars

2.4 聚類分析

以各品種經(jīng)12對(duì)引物擴(kuò)增的等位變異為基礎(chǔ)，建立0,1矩陣，利用NTSYS-pc 2.10e軟件分析遺傳多樣性，并使用UPGMA法繪制聚類分析圖 (圖3)。各品種間的相似系數(shù)范圍為0.622 6～0.886 8，平均相似系數(shù)0.733 7。其中，‘西豐25號(hào)楊’ 與 ‘西豐77號(hào)楊’ 相似系數(shù)最大，為0.886 8，這2個(gè)品種都是從美洲黑楊與青楊雜交子代中選育產(chǎn)生的；‘白城2號(hào)楊’ 和 ‘法庫1號(hào)楊’ 都是小葉楊與鉆天楊的天然雜種，其親源關(guān)系也較近，相似系數(shù)為0.858 5，它們共同與 ‘匯林88號(hào)楊’ 聚成了一個(gè)小類群，表明作為小葉楊對(duì)其遺傳差異造成了較大的影響； ‘匯林88號(hào)楊’ 與 ‘西豐25號(hào)楊’ 和 ‘西豐77號(hào)楊’ 的相似系數(shù)分別為0.622 6和0.641 5，說明 ‘匯林88號(hào)楊’ 與2個(gè)西豐系列的品種之間的親緣關(guān)系均較遠(yuǎn)。

圖3基于SSR等位變異的15個(gè)楊樹品種聚類分析
Fig.3 Dendrogram of 15Populusgermplasms based on SSR markers

3 結(jié)論與討論

近年來，三倍體楊樹種質(zhì)在中國林業(yè)生產(chǎn)中廣泛推廣的楊樹品種中陸續(xù)被發(fā)現(xiàn)， ‘中林46’、‘銀中楊’ (P.alba×P.berolinensis‘Yinzhong’)、‘中懷1號(hào)’、‘森海1號(hào)’(P.deltoides×P.cathayanacl. ‘Senhai 1’)、‘森海2號(hào)’ (P.deltoides×P.ca-thayanacl. ‘Senhai 2’) 等原本通過雜交選育的楊樹雜種均被證明是三倍體品種[2,21-23]。本研究發(fā)現(xiàn)的 ‘白林3號(hào)楊’ 和 ‘黑林1號(hào)楊’ 2個(gè)三倍體品種進(jìn)一步豐富了楊樹三倍體種質(zhì)資源庫，也進(jìn)一步證明了三倍體育種在楊樹遺傳改良中的優(yōu)勢。鑒于楊樹天然未減數(shù)配子在自然界普遍發(fā)生[24-25]，推測這些三倍體種質(zhì)可能來源于天然未減數(shù)配子的雜交。未來可以通過對(duì)這些雜交品種的雙親進(jìn)行分析，研究雙親未減數(shù)配子的發(fā)生情況，探討三倍體雜種的產(chǎn)生原因。

利用SSR毛細(xì)管電泳檢測可對(duì)植株倍性水平進(jìn)行檢測[10, 26]。賈會(huì)霞等[2]發(fā)現(xiàn) ‘森海1號(hào)’、‘森海2號(hào)’、‘中懷1號(hào)’、‘中林46’ 以及1份青楊種質(zhì)均檢測到3個(gè)不同的SSR等位位點(diǎn)，流式細(xì)胞儀分析也證明了這些種質(zhì)都是三倍體。然而，馮錦霞等[11]對(duì) ‘森海1號(hào)’ 和 ‘森海2號(hào)’ 進(jìn)行SSR分析，都只檢測到2個(gè)等位位點(diǎn)。2個(gè)研究間似乎存在矛盾，實(shí)則可能與等位位點(diǎn)的雜合性有關(guān)[26]。本研究在檢測 ‘白林3號(hào)’ 和 ‘黑林1號(hào)’ 三倍體品種時(shí)，LG1937引物擴(kuò)增的SSR等位位點(diǎn)均為2個(gè)。因此，在利用SSR分子標(biāo)記手段進(jìn)行植株倍性分析時(shí)，應(yīng)充分利用單拷貝SSR引物結(jié)合毛細(xì)管電泳檢測結(jié)果中熒光信號(hào)的倍數(shù)性變化信息加以分析，尤其能借助雙親的SSR等位位點(diǎn)分布及熒光強(qiáng)度信息綜合分析更為可靠[27]。

楊樹馴化歷史相對(duì)悠久，品種繁多，新品種遺傳基礎(chǔ)狹窄，單純以形態(tài)學(xué)差異作為品種區(qū)分標(biāo)準(zhǔn)容易受到環(huán)境差異的影響，因此，開發(fā)分子標(biāo)記指紋圖譜是開展楊樹品種注冊(cè)、品種鑒定的主要趨勢。本研究利用毛細(xì)胞電泳檢測技術(shù)，針對(duì)中國北方地區(qū)的15個(gè)楊樹品種建立了SSR指紋圖譜。與傳統(tǒng)的聚丙烯酰胺凝膠電泳法相比，毛細(xì)管電泳技術(shù)具有成本低、污染少、精確度高等優(yōu)點(diǎn)，尤其適合于大量樣本的高通量檢測[18]。同時(shí)，本研究篩選的12對(duì)引物，擴(kuò)增位點(diǎn)清晰，均具有較好的多態(tài)性，可進(jìn)一步用于擴(kuò)展楊樹種質(zhì)材料的遺傳分析。