劉聰聰，王樹輝，涂治驍，陳少魁，汪龍梅，秦 琴，張 琳，王秀英，劉玉蘭，朱惠玲

（武漢輕工大學動物營養(yǎng)與飼料科學湖北省重點實驗室，湖北武漢 430023）

小腸是動物消化吸收的主要器官，也是細菌、病毒、寄生蟲和過敏大分子等有害物質的物理和免疫屏障[1]。在生豬飼養(yǎng)過程中，仔豬易受各種病原體和非病原體感染，刺激豬產生免疫應激，進而使腸黏膜屏障功能遭到破壞，導致豬腸道通透性增加，使炎癥和腸道損傷加劇，最終導致動物器官多功能衰竭[2]。因此，借助于營養(yǎng)調控手段來改善腸道的應激反應對保護腸黏膜結構和屏障功能的完整性非常重要。

中鏈脂肪酸是由6～12個碳原子組成的飽和脂肪酸，其酯化形式為中鏈甘油三酯，包括己酸（C6）、辛酸（C8）、癸酸（C10）和月桂酸（C12）。中鏈脂肪酸不僅能快速供能而且具有抑制有害細菌、改善腸道微生物菌群、降低炎性細胞因子水平、提高新生仔豬免疫功能等生物學特性[3]。中鏈脂肪酸還可改善哺乳仔豬腸道結構，緩解腸道損傷[4]。

脂多糖（LPS）是革蘭氏陰性菌細胞膜的成分，LPS注射后3～6 h內會引起腸黏膜形態(tài)急性損傷和腸道屏障功能障礙[5]?；诖?，本試驗旨在研究中鏈脂肪酸對LPS誘導的斷奶仔豬腸黏膜免疫屏障損傷的保護作用，為其在仔豬生產中的推廣與應用提供借鑒。

1 材料與方法

1.1 試驗材料 LPS（大腸桿菌血清型O55: B5，Sigma公司）；中鏈脂肪酸（購自連云港華成飼料有限公司）。玉米油和中鏈脂肪酸的組成成分見表1。

1.2 試驗設計與管理 選取24頭（21±1）d、體重為（9.0±0.7）kg的杜×長×大三元雜交斷奶仔豬，經過7 d預試后，按照體重相近原則隨機分為4個處理組，每個處理組6個重復，每個重復1頭豬。試驗用玉米油作為對照，采用2×2因子設計，主因子分別為日糧處理（中鏈脂肪酸日糧或玉米油日糧）和免疫應激（LPS或生理鹽水）。按照NRC（1998）配制基礎日糧，日糧組成與營養(yǎng)成分見表2。中鏈脂肪酸日糧含有4%中鏈脂肪酸+1%玉米油，玉米油日糧含有5%的玉米油。試驗期為21 d。在試驗第21天，每個日糧組中選3個重復注射100 μg/kg 體重（BW）的LPS，剩余的3個重復注射等量的生理鹽水。試驗期間，豬舍進行常規(guī)消毒，仔豬自由采食及飲水。

表1 玉米油和中鏈脂肪酸的組成成分 %總脂肪酸（重量）

1.3 樣品采集與處理 本試驗注射LPS或生理鹽水4 h后屠宰仔豬，剖開腹腔取空腸、回腸樣品，制作組織切片。

1.4 檢測指標及方法

1.4.1 絨毛高度和隱窩深度 取腸道切片，在10×10倍光鏡下，選取10根最長且完整的絨毛，測定絨毛高度、隱窩深度，計算其比值。

1.4.2 上皮間淋巴細胞、杯狀細胞數 取腸道切片，在40×10倍光鏡下，選取6個完好絨毛和隱窩，計數每100個腸上皮細胞內所含淋巴細胞數、杯狀細胞數，并計算每張切片上皮間淋巴細胞、杯狀細胞平均值。

1.4.3 嗜中性粒細胞數 取腸道切片，在40×10倍光鏡下，隨機選取6個視野計數嗜中性粒細胞數，并測量每個視野的面積，求出該切片嗜中性粒細胞的密度。

1.4.4 固有層細胞密度的測定 取腸道腸切片，在40×10倍光鏡下，選取6根完好絨毛，計數腸絨毛固有層細胞數，并測量每個固有層的面積，計算該切片固有層細胞密度。

1.4.5 派氏結（Peyers Pathch，PP結）細胞密度 取回腸切片，在40×10倍光鏡下，選取6個完好的PP結，每個PP結隨機選取6個視野計數細胞數，并測量每個視野的面積，并計算該切片PP結細胞密度。

1.5 統(tǒng)計分析 數據采用SPSS 22.0進行雙因子方差分析。模型主效應包括日糧處理、免疫應激及二者的互作關系。

表2 日糧配方和營養(yǎng)成分（風干基礎）

2 結 果

2.1 中鏈脂肪酸對LPS刺激仔豬腸黏膜形態(tài)的影響 由圖1可知，LPS刺激導致空腸絨毛萎縮、上皮脫落；飼糧中添加中鏈脂肪酸導致空腸絨毛上皮輕度脫落。LPS和中鏈脂肪酸對腸黏膜形態(tài)的影響無互作關系（P＞0.10）（表3）。LPS刺激顯著降低空腸的絨毛高度和隱窩深度（P＜0.05），同時顯著降低回腸的絨毛高度和絨毛高度/隱窩深度（P＜0.05）。日糧中添加中鏈脂肪酸顯著提高了空腸絨毛高度（P＜0.05），對回腸黏膜形態(tài)沒有影響（P＞0.05）。

圖1 仔豬空腸黏膜形態(tài)

2.2 中鏈脂肪酸對LPS刺激仔豬腸黏膜免疫屏障的影響上皮間淋巴細胞（多數分布在上皮細胞基底膜附近）和杯狀細胞都分布在腸上皮柱狀細胞間，以小型細胞為主，胞核大而圓，深染，胞漿少；杯狀細胞多呈柱狀或圓錐形。由表4可知，LPS刺激顯著降低回腸上皮間淋巴細胞及杯狀細胞數（P＜0.05），且有降低空腸上皮間淋巴細胞的趨勢（P＜0.10）；中鏈脂肪酸與LPS對空腸杯狀細胞（P＜0.05）及上皮間淋巴細胞（P＜0.10）存在互作關系，即中鏈脂肪酸緩解了LPS刺激導致的空腸杯狀細胞數的升高和上皮間淋巴細胞數的減少。嗜中性粒細胞主要分布在小腸黏膜固有層，胞核多為腎形，胞漿豐富。LPS刺激顯著增加了回腸嗜中性粒細胞密度（P＜0.05），中鏈脂肪酸對小腸嗜中性粒細胞密度沒有影響（P＞0.10），二者也沒有互作關系（P＞0.05）。

由表5可知，LPS刺激顯著增加回腸固有層細胞密度（P＜0.05），日糧添加中鏈脂肪酸降低了空腸、回腸固有層細胞密度（P＜0.05），且LPS與中鏈脂肪酸之間存在互作關系（P＜0.05），即中鏈脂肪酸能緩解LPS刺激所引起的空腸固有層細胞密度的增加。LPS刺激可使回腸PP結細胞密度顯著增加（P＜0.05）。日糧中添加中鏈脂肪酸則顯著降低了回腸PP結細胞密度（P＜0.05），兩者沒有互作關系（P＞0.05）。

表3 中鏈脂肪酸對LPS刺激仔豬腸黏膜形態(tài)的影響

表4 中鏈脂肪酸對LPS刺激仔豬腸黏膜免疫細胞的影響

表5 中鏈脂肪酸對LPS刺激仔豬小腸黏膜固有層細胞密度和PP結細胞密度的影響

3 討 論

腸道是動物消化吸收的主要器官，同時作為機體最大的保護屏障，可以阻止腸道內病原微生物入侵，保護機體健康[1]。 腸黏膜屏障功能的完整性主要由腸黏膜上皮屏障、腸道免疫屏障和腸道內正常微生物群這三大屏障來維持[2]，通過絨毛高度、隱窩深度和絨毛高度/隱窩深度等指標來反映。本試驗結果顯示，LPS刺激導致空腸絨毛萎縮、上皮脫落，小腸絨毛高度和絨毛高度/隱窩深度顯著降低，與相關研究結果一致[1]。小腸上皮細胞的更新和屏障功能的維持是一個動態(tài)過程，受機體營養(yǎng)水平、飼喂方式及營養(yǎng)素的影響，在應激狀態(tài)下需要足夠的能量來維持和修復小腸的完整性和屏障功能[6]。本研究發(fā)現(xiàn)，日糧中添加中鏈脂肪酸可以提高小腸絨毛高度，這是因為在應激狀態(tài)下，中鏈脂肪酸可直接被小腸上皮細胞吸收利用，快速供能以促進上皮細胞的更新和修復，維持腸黏膜屏障功能的完整性。而且有研究表明，中鏈脂肪酸可以提高小腸絨毛高度，同時降低隱窩深度，對腸道形態(tài)有積極的作用[7]。LPS主要引起動物急性的炎癥反應和腸道損傷，如果長期用LPS刺激會使仔豬的敏感性降低。飼糧中添加4%中鏈脂肪酸對仔豬的生長性能并沒有影響，這主要是由于仔豬在應激及炎癥的情況下，中鏈脂肪酸可通過保護仔豬腸道形態(tài)結構來改善生產性能，而仔豬在健康狀況下，飼喂中鏈脂肪酸不會影響生 長性能（數據未發(fā)表）。

腸道免疫屏障主要是由腸道免疫細胞和相關淋巴組織組成。上皮間淋巴細胞是腸道免疫屏障的重要組成成分之一，也是機體對抗感染或過敏原的第1道防線，在維持腸黏膜屏障功能方面發(fā)揮著重要作用。研究發(fā)現(xiàn)，動物小腸黏膜屏障完整性破壞往往伴隨著上皮間淋巴細胞數目的減少[8]，中鏈脂肪酸可降低新生仔豬食糜沙門氏菌和大腸桿菌的濃度，如月桂酸可顯著抑制革蘭氏陰性菌[9]。本研究中，在LPS刺激后，腸上皮間淋巴細胞數顯著降低，說明腸黏膜免疫屏障遭受破壞，而日糧中添加中鏈脂肪酸則提高了上皮間淋巴細胞數，這可能與中鏈脂肪酸抑制腸道有害菌群、減少其對腸黏膜的損傷有關。

嗜中性粒細胞作為機體的天然免疫細胞，具有趨化、吞噬和殺菌功能。趨化物質使嗜中性粒細胞滲出血管壁迅速聚集在炎癥部位，發(fā)揮抗炎和殺菌的作用[10]。本研究表明，腸黏膜的炎癥反應是由LPS刺激導致的腸黏膜嗜中性粒細胞密度增加引起的。

固有層中含有大量的免疫細胞（如淋巴細胞、樹突狀細胞、巨噬細胞、肥大細胞和嗜中性粒細胞等），是腸黏膜免疫應答的主要效應場所，也是腸黏膜的過濾器[11]。研究發(fā)現(xiàn)，腸黏膜固有層細胞密度增大是由黏膜炎癥和抗原刺激引起的[12]。本試驗結果表明，LPS刺激可導致腸固有層細胞密度顯著增大，表明LPS刺激可引起腸黏膜炎癥及屏障功能受損。有研究指出，在魚油基礎日糧中添加中鏈甘油三酯可以降低小鼠的炎癥反應，而且中鏈甘油三酯可顯著降低LPS刺激誘導的炎性細胞因子及趨化因子水平[13]。本研究發(fā)現(xiàn)，日糧中添加中鏈脂肪酸降低了腸固有層細胞密度，說明中鏈脂肪酸可能降低了LPS刺激導致的炎性細胞因子的升高，對LPS所誘導的炎癥反應有緩解作用，維持了腸黏膜屏障功能。

回腸在腸黏膜免疫系統(tǒng)中具有重要的地位，其黏膜層有大量的免疫細胞，黏膜下層還有集合淋巴結即PP結，在歸巢受體介導下，PP結中致敏的淋巴細胞可移行到致敏部位的腸黏膜上皮和固有層發(fā)揮作用。當機體發(fā)生炎癥或抗原入侵時，PP結細胞密度增大。本研究中，LPS刺激引起PP結細胞密度增大，表明LPS刺激能夠導致腸黏膜出現(xiàn)炎癥反應。中鏈脂肪酸可通過免疫細胞GPR84參與機體的免疫調節(jié)，其中辛酸和癸酸都具有抗病毒活性[14]。PP結細胞密度因中鏈脂肪酸的添加而降低，可能是由于中鏈脂肪酸參與了機體的免疫調節(jié)，對腸道內的病毒入侵有抵抗作用，同時緩解了LPS刺激所導致炎癥反應，從而對腸黏膜屏障功能起到保護作用。

杯狀細胞可以分泌黏蛋白進入管腔內，從而阻止病原微生物和有害物質的入侵，對黏膜上皮有潤滑和保護作用[15]，是機體重要的防御細胞。此外，杯狀細胞分泌的三葉因子可減少炎性細胞的浸潤，從而起到維護和修復腸黏膜的作用。在本研究中，LPS及中鏈脂肪酸都降低了腸杯狀細胞數。但中鏈脂肪酸及LPS對腸黏膜杯狀細胞的影響未見報道，其機體的機理還有待進一步研究。

4 結 論

綜上分析，LPS刺激會引起腸黏膜結構受損，破壞免疫屏障功能；日糧中添加中鏈脂肪酸可有效緩解LPS引起的仔豬腸黏膜結構損傷，維持和保護腸黏膜免疫屏障功能。