張根生,岳曉霞,王 芮,常 虹

(哈爾濱商業(yè)大學,黑龍江省普通高等學校食品科學與工程重點實驗室,黑龍江哈爾濱 150076)

金屬硫蛋白(MTs)是廣泛存在于生物體中,具有低分子質(zhì)量、富含半胱氨酸(20%～30%)、缺乏芳香族氨基酸的一類金屬結(jié)合蛋白質(zhì)[1-4]。金屬硫蛋白可以調(diào)節(jié)生物體內(nèi)微量元素濃度,對人體內(nèi)重金屬有解毒的作用,除此之外,金屬硫蛋白對激素的調(diào)節(jié)、細胞代謝的調(diào)節(jié)、細胞分化和增殖的控制、紫外(UV)誘導反應以及清除自由基都有重要作用[5-7]。Alonso等[8]的研究表明硫蛋白可以使豬肝腎中的鎘含量顯著降低。MTs具有清除自由基、抑制脂質(zhì)過氧化過程[9],在對保護心肌的過程中也起到了一定的作用[10]。目前已從許多海洋動物的消化腺或肝胰腺、生殖腺、肝、腦、鰓、肌肉、外套膜等組織以及幼體或成體中提取到MTs[11-15]。

近些年,在金屬硫蛋白的前處理方法研究中,各國的科學家采用的方法主要為勻漿后離心法[16]。此種方法在提取MTs過程中,提取不完全,樣品有損失,會影響測定結(jié)果,酸水解法的特點是水解迅速徹底,產(chǎn)物為L型氨基酸,不會發(fā)生消旋作用。且在酸性條件下，樣品中含有巰基,較為穩(wěn)定，不易被氧化,酸水解蛋白成本低、投資小,是一種被廣泛使用的生產(chǎn)方法[17]。同時,酸水解方法中,樣品在固定容器里水解,水解液過濾后進行測定[18],樣品沒有損失,且樣品水解后澄清不影響比色,是一種比較可行的樣品前處理方法,可以為金屬硫蛋白樣品測定前處理提供一種參照方法。

隨著技術(shù)的不斷改進,MTs的測定方法也逐漸精細化,從傳統(tǒng)的金屬結(jié)合法到現(xiàn)在的分子生物學測定手段,在技術(shù)層面極大地推動了對MTs功能及作用機制的研究[19]。除金屬結(jié)合法外,MTs的檢測方法還有:電化學法、免疫法、色譜分析法[20]、色質(zhì)聯(lián)用法[21]等。目前尚未發(fā)現(xiàn)一種簡便快捷適用于產(chǎn)業(yè)化的檢測技術(shù)。因此,當前亟需建立檢測MTs的統(tǒng)一標準。巰基(SH)定量法[22],是以5,5′-二硫硝基苯甲酸(DTNB)作為巰基定量試劑,通過測定412 nm波長處顯色產(chǎn)物硫代硝基苯甲酸陰離子(TNBA)的量,確定金屬硫蛋白含量[23]。DTNB比色法操作簡便易行,快速直觀,可用于測定生物體中金屬硫蛋白的含量,對MTs快速檢測提供了一種快速檢測的方法。

因此,本文將對DTNB比色法的測定條件進行優(yōu)化,對其準確性進行驗證,并使用酸水解作為DTNB比色法的前處理方法,對雞全蛋粉中的MTs進行檢測,以探索樣品中MTs檢測的新途徑,為今后的MTs檢測提供新的方法。

1 材料和方法

1.1 材料與儀器

金屬硫蛋白雞蛋粉 哈爾濱春源生物科技開發(fā)有限公司提供;DTNB 美國Sigma公司;兔肝金屬硫蛋白(MTs,純度≥95%) 上海源葉生物科技有限公司;鹽酸胍、乙二胺四乙酸(EDTA)、甲醛、鹽酸、檸檬酸、磷酸氫二鈉等 均為國產(chǎn)分析純。

雙束紫外可見分光光度計 北京是普析通用儀器有限責任公司;電子天平(讀數(shù)精度0.1 mg) 瑞士Mettler Toledo公司;電熱鼓風干燥箱 上海東星建材試驗設(shè)備有限公司;定氮儀 湖南湘儀實驗室儀器開發(fā)有限公司;pH計 德國賽多利斯股份有限公司。

1.2 實驗方法

1.2.1 金屬硫蛋白標準曲線的繪制 在試管中加入標準金屬硫蛋白溶液(質(zhì)量濃度為1 μg/μL),加入25 μL 1.2 mol/L HCl和100 μL 0.1 mol/L EDTA,置暗處反應10 min,加入500 μL 5 mmol/L Ellma試劑混勻3 min,使MTs與DTNB形成黃色絡(luò)合物,用0.1 mol/L磷酸氫二鈉-檸檬酸緩沖液定容至10 mL,在412 nm波長處測定吸光度,并繪制標準曲線。

1.2.2 酸水解法前處理條件單因素實驗

1.2.2.1 原料與鹽酸用量質(zhì)量體積比對處理效果的影響 稱取適量樣品,按照質(zhì)量體積比1∶10、1∶15、1∶20、1∶25、1∶30 g/mL加入6 mol/L HCl,充入N2密封,置于110 ℃電熱干燥箱內(nèi)水解16 h,水解完成后過濾水解液,取水解液測定MTs含量和水解度。

1.2.2.2 鹽酸濃度對處理效果的影響 稱取適量樣品,按照質(zhì)量體積比1∶20 g/mL加入2、4、6、8、10 mol/L HCl,充入N2封口,置于110 ℃電熱干燥箱內(nèi)水解16 h,水解完成后過濾水解液,取水解液測定MTs含量和水解度。

1.2.2.3 水解時間對處理效果的影響 稱取適量樣品,按照質(zhì)量體積比1∶20 g/mL加入6 mol/L HCl,充入N2封口,置于110 ℃電熱干燥箱內(nèi)水解12、14、16、20、24 h,水解完成后過濾水解液,取水解液測定MTs含量和水解度。

1.2.2.4 水解溫度對處理效果的影響 稱取適量樣品,按照質(zhì)量體積比1∶20 g/mL加入6 mol/L HCl,充入N2封口,置于100、110、120、130、140 ℃電熱干燥箱內(nèi)水解16 h,水解完成后過濾后,取水解液測定MTs含量和水解度。

1.2.3 酸水解法前處理條件正交實驗設(shè)計 為確定最佳水解方案,在單因素實驗基礎(chǔ)上,進行L9(34)正交試驗,優(yōu)化水解方案。正交實驗設(shè)計見表1。

表1 酸水解法正交實驗設(shè)計Table 1 Orthogonal design of acid hydrolysis

1.2.4 Ellma試劑最佳pH的確定 DTNB 0.297 g,鹽酸胍0.086 g,EDTA 0.056 g,用pH為4、5、6、7、8的0.1 mol/L磷酸氫二鈉-檸檬酸緩沖液,溶解并定容到500 mL,并每隔2 h于412 nm處測定吸光度。

1.2.5 DTNB比色法條件的研究和方法學考察

1.2.5.1 DTNB比色法反應最佳pH 吸取金屬硫蛋白溶液(質(zhì)量濃度為1 μg/μL),加入100 μL 1.2 mol/L鹽酸溶液和200 μL 0.1 mol/L EDTA,置暗處反應10 min脫去金屬,加入0.5 mL Ellma試劑,使MTs與DTNB形成黃色絡(luò)合物(TNBA),再分別用pH3、4、5、6、7、8的0.1 mol/L磷酸氫二鈉-檸檬酸緩沖液定容至10 mL,混勻靜置反應3 min,在反應時間為3、10、20、30、40、50、60 h,分別于412 nm處測定吸光度。

1.2.5.2 反應的最佳pH及最佳測定時間 吸取金屬硫蛋白溶液(質(zhì)量濃度為1 μg/μL),加入100 μL 1.2 mol/L鹽酸和200 μL 0.1 mol/L EDTA,置暗處反應10 min脫去金屬,加入0.5 mL Ellma試劑,用0.1 mol/L pH7.0、7.2、7.4、7.6、7.8、8.0磷酸氫二鈉-檸檬酸緩沖液定容至10 mL,混勻靜置反應3 min,當反應時間為3、10、20、30、40、50、60 h于412 nm處測定吸光度。

1.2.5.3 DTNB比色法加標回收率 取一定量雞蛋粉,分別加入不同量MTs標準溶液(質(zhì)量濃度為1 μg/μL),按照測定方法做加標回收實驗。計算其回收率。

1.2.5.4 精密度 配制MTs標準溶液10 μg/μL,分別取標準溶液200 μL,連續(xù)吸取6個標準溶液與500 μL 5 mmol/L DTNB試劑反應,計算得相對標準偏差(RSD),來評價其精密度。

1.2.5.5 方法檢測限 取7份空白組織MTs提取液,進行測定,并計算MTs含量,按公式(1)計算方法檢測限[20]。

方法檢測限=t(n-1,0.99)×s

式(1)

式中:S為7次空白測定的標準差;t(6,0.99)=3.143。

1.2.6 指標測定 MTs含量計算按下式(2);

式(2)

式中:C-金屬硫蛋白濃度,mg/mL;V1-測定定容體積體積,mL;V2-粗提液體積,mL;V3-粗提液測定體積,mL;m-樣品質(zhì)量,g。

水解度測定按下式(3);總氮測定參照GB 5009.5-2016凱氏定氮法進行[24];氨基態(tài)氮參照GBT 5009.235-2016甲醛法進行[25]。

式(3)

1.3 數(shù)據(jù)處理

試驗統(tǒng)計分析采用Mircosoft Office 2007軟件的Excel 2007進行統(tǒng)計分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 金屬硫蛋白標準曲線

金屬硫蛋白標準曲線見圖1,回歸方程為Y=0.019x+0.027,R2=0.999,在MTs濃度為5～40 μg/mL內(nèi)成良好的線性關(guān)系。

圖1 金屬硫蛋白標準曲線Fig.1 Standard curve of metallothionein

2.2 酸水解前處理方法單因素實驗結(jié)果

2.2.1 質(zhì)量體積比對前處理效果的影響 由圖2可以看出,水解度隨著原料質(zhì)量與鹽酸體積比增大而增大,在1∶30 g/mL時,水解度增加到最大值,但當質(zhì)量體積比大于1∶20 g/mL時,水解度增加不明顯。MTs的含量隨著質(zhì)量體積比的增大,先增大后減小,在1∶20 g/mL時,MTs含量取得最大值。原因可能是,一定量的鹽酸有助于蛋白質(zhì)水解,提高水解度,從而雞全蛋粉中MTs含量較高,但是隨著鹽酸用量的增加，也存在著鹽酸過量的情況,而且過量的鹽酸也不利于后期的廢液處理。所以,綜合考慮選取1∶20 g/mL比較適宜的質(zhì)量體積比。

圖2 質(zhì)量體積比對前處理的影響Fig.2 Effect of mass volume ratio on pretreatment

2.2.2 鹽酸濃度對前處理效果的影響 由圖3可知,鹽酸濃度在2～6 moL/L時,水解度和MTs含量隨著鹽酸濃度的增加呈現(xiàn)上升的趨勢,鹽酸濃度繼續(xù)增大時,水解度趨于穩(wěn)定,MTs含量在鹽酸濃度8 mol/L時達到最大,但與6 mol/L時的水解度相比,差異不明顯。當增加到10 mol/L時含量反而有所下降,前處理效果較差,可能是鹽酸濃度過高破壞了MTs的巰基,影響比色,使含量降低。為避免巰基被破壞,綜合選用6 mol/L的鹽酸進行前處理。

圖3 鹽酸濃度對前處理的影響Fig.3 Effect of hydrochloric acid concentration on pretreatment

2.2.3 水解時間對前處理效果的影響 由圖4可知,隨著水解時間的延長,水解度和MTs含量呈現(xiàn)上升的趨勢,在12～20 h內(nèi),水解度和MTs含量增加速度較大,說明前處理效果較好,在超過20 h后,其增加速度減緩,尤其是水解度增加幅度不大,在24 h時,均達到最大值。所以綜合考慮,選取24 h為最佳酸水解前處理時間。

圖4 水解時間對前處理的影響Fig.4 Effect of hydrolysis time on pretreatment

2.2.4 水解溫度對前處理效果的影響 由圖5可知,當溫度為100～130 ℃時,MTs含量隨著溫度的升高而增大,在130 ℃時達到最大值,在140 ℃時含量稍有減少,而水解度在140 ℃時達到最大,但與130 ℃相比,水解度相差僅1.18%,另外,隨著溫度的升高水解液顏色逐漸變深,溫度越高耗能也越高。所以應選130 ℃為適宜前處理水解溫度。

圖5 水解溫度對前處理的影響Fig.5 Effect of hydrolysis temperature on pretreatment

2.3 酸水解法前處理方法正交實驗結(jié)果

由表2可以得出,以水解度為評價指標,因素影響主次為C>B>A>D，即:影響水解效果最大的因素為水解時間,其次為鹽酸濃度、原料與鹽酸用量質(zhì)量體積比,水解溫度影響較小。以MTs含量為評價指標,影響因素主次為C>B>D>A,即:影響水解效果最大的因素為水解時間,其次為鹽酸濃度、水解溫度、原料與鹽酸用量質(zhì)量體積比。

表2 正交試驗結(jié)果Table 2 Orthogonal test results

單獨以水解度為指標時,由于水解度越大,蛋白質(zhì)水解效果越好,可以得到更小分子的蛋白質(zhì),所以最佳的實驗方案是A1B2C2D2,即水解時間20 h,鹽酸濃度6 mol/L,質(zhì)量體積比1∶10 g/mL,水解溫度130 ℃。單獨分析以MTs含量為指標的實驗結(jié)果,可以得出的最佳實驗方案是A3B2C3D2,即水解時間24 h,鹽酸濃度6 mol/L,水解溫度130 ℃,質(zhì)量體積比1∶20 g/mL。分析兩個指標所得到的最佳方案不同,由于較大的質(zhì)量體積比1∶20 g/mL更有利于樣品在鹽酸內(nèi)部的均勻分散,這與單因素實驗結(jié)果一致,較長的時間24 h相較20 h可以使樣品更大程度上的水解成小分子,所以最終選取水解時間24 h,鹽酸濃度6 mol/L,質(zhì)量體積比1∶20 g/mL,水解溫度130 ℃為最佳前處理水解方案。對此條件進行驗證,得到水解度為55.28%,MTs含量為0.4821 mg/g,所以此實驗方案為最佳水解條件。

2.4 配制Ellma試劑緩沖液最佳pH的選擇

由圖6可以看出,DTNB在偏酸性的pH環(huán)境中，吸光度值較小且比較穩(wěn)定,在pH為4時,24 h內(nèi)吸光度值基本上沒有明顯變化,在24 h后吸光度值變化也比較小。在pH為5時,24 h內(nèi)吸光度變化比較小,超過24 h后有較大變化。在pH為6時,吸光度值變化仍比較小,但是存在一些波動,尤其是在超過24 h后,吸光度有明顯的提高。在pH為7、8時,吸光度值大于pH為4、5、6時的吸光度值,并且隨著時間的增長,吸光度值在不斷上升,這是因為，DTNB在中性或偏堿性條件下可以發(fā)生離子化,生成NTB2-,呈現(xiàn)黃色,在412 nm可以檢測,因此為降低DTNB自身在Ellma試劑中的離子化裂解現(xiàn)象影響最終顯色反應,應選用偏酸的緩沖液配制,這與吳云輝等[26]的研究結(jié)果一致。因此,綜合評價,選擇pH為4的磷酸氫二鈉-檸檬酸緩沖液進行配制,且為了可以準確進行實驗,Ellma試劑應現(xiàn)用現(xiàn)配,避免過長時間的存放,以免影響實驗結(jié)果。

圖6 Ellma試劑緩沖液pH對吸光度的影響Fig.6 Optimal pH for formulation of Ellma reagent buffer

2.5 反應的最佳pH及最佳測定時間

由圖7可以看出，生成物TNBA在pH7、8時,吸光度值最高,且在60 min內(nèi)穩(wěn)定性較好,說明TNBA在堿性條件下比較穩(wěn)定。這與王俊坤[27]在DTNB比色法測定金屬硫蛋白含量中的研究規(guī)律一致。

圖7 Ellma試劑緩沖液在pH3～8的穩(wěn)定性Fig.7 Stability of Ellma reagent buffer solution in pH3～8

由圖8可知,在堿性條件下,當pH=7.2時,吸光度值最大,說明TNBA生成量最多,且TNBA在30 min內(nèi)變化不大,比較穩(wěn)定,而且結(jié)合Ellma試劑在中性或者偏堿性條件下會出現(xiàn)裂解,為保證TNBA的穩(wěn)定又考慮到顯色劑的性質(zhì),最終選擇pH7.2的磷酸氫二鈉-檸檬酸緩沖液進行定容,并在30 min內(nèi)進行檢測。

圖8 Ellma試劑緩沖液在pH7～8下的穩(wěn)定性Fig.8 Stability of Ellma reagent buffer solution at pH7～8

2.6 DTNB比色法加標回收率、精密度、方法檢測限

加標回收率、精密度、方法檢測限結(jié)果分別見表4～表6,加標回收率為75.83%～88.15%,相對標準偏差為3.10%<5%,表明該方法具有較好的重現(xiàn)性和準確度。DTNB比色法的方法檢測限為7.57 μg/g。

表3 DTNB比色法加標回收率實驗結(jié)果Table 3 The results of spiked recovery by DTNB colorimetric method

表4 DTNB比色法測定結(jié)果的相對標準偏差(RSD)Table 4 Relative standard deviation(RSD)of DTNB colorimetric assay

表5 DTNB比色法方法檢測限Table 5 DTNB colorimetric method detection limit

3 結(jié)論

酸水解法前處理條件為:水解時間24 h,鹽酸濃度6 mol/L,質(zhì)量體積比1∶20 g/mL,水解溫度130 ℃,測定雞全蛋粉中MTs含量為0.4821 mg/g,水解度為55.28%。優(yōu)化了DTNB比色法測定條件,并使用DTNB比色法測定雞全蛋粉中MTs含量,最終選用pH為4.0的磷酸氫二鈉-檸檬酸緩沖液配制Ellman試劑,反應最佳pH為7.2。使用DTNB比色法測量樣品中MTs含量,加標回收率最高為88.15%,相對標準偏差小于5%,DTNB比色法的方法檢測限為7.57μg/g,由此可以得出該方法具有較好的重現(xiàn)性和準確度,本方法可以用于樣品中MTs的快速檢測。