蔣東方，卜 強(qiáng)，曾明輝，秦鎖炳，夏東東，彭 毅

目前，前列腺癌發(fā)病率在全世界男性惡性腫瘤中位居第2[1]。隨著我國(guó)逐步進(jìn)入老齡社會(huì)，預(yù)計(jì)10年后前列腺癌的每年新發(fā)病例將達(dá)到60～70/10萬(wàn)[2]。與歐美國(guó)家不同，國(guó)人中約30%的前列腺癌患者初診時(shí)已屬侵襲性前列腺癌，手術(shù)機(jī)會(huì)少，預(yù)后差。因此，研究適合國(guó)情的前列腺癌個(gè)體化診療方案迫在眉睫。二甲雙胍是廣泛用于治療2型糖尿病的雙胍類藥物。除了能降低血糖外，研究表明，二甲雙胍在多種腫瘤中具有抗癌作用，能顯著提高合并2型糖尿病的惡性腫瘤患者的生存率，其中包括前列腺癌[3-4]。大量研究證明，胰島素樣生長(zhǎng)因子受體（IGF-1R）在包括前列腺癌、乳腺癌、直腸癌等多種惡性腫瘤組織中異常高表達(dá)[5]。研究發(fā)現(xiàn)，前列腺癌細(xì)胞中的IGF-1R被上游信號(hào)通路激活后，自身的酪氨酸殘基發(fā)生磷酸化[6]，從而促進(jìn)癌細(xì)胞生長(zhǎng)。目前二甲雙胍對(duì)前列腺癌的作用及其相關(guān)機(jī)制尚未闡明，本研究通過(guò)建立小鼠前列腺癌腫瘤模型，分析IGF-1R/STAT3信號(hào)通路是否參與二甲雙胍對(duì)前列腺癌細(xì)胞的抑制作用，探索二甲雙胍抑制前列腺癌發(fā)生、發(fā)展的分子機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 細(xì)胞培養(yǎng) 前列腺癌細(xì)胞株DU145由上海中科院細(xì)胞庫(kù)提供，培養(yǎng)于含10%FBS的1640完全培養(yǎng)基中，37℃、5%C02、飽和濕度。取處于對(duì)數(shù)期生長(zhǎng)的DU145細(xì)胞，加入0.25%胰酶消化3 min，1000 r/min離心3 min，棄上清，PBS洗滌細(xì)胞，用細(xì)胞計(jì)數(shù)板進(jìn)行細(xì)胞計(jì)數(shù)，調(diào)整細(xì)胞濃度至2×107/ml。

1.2 前列腺癌小鼠模型的建立 18只雄性SPF級(jí)BALB/c裸鼠（4～6 w齡）購(gòu)自中國(guó)醫(yī)學(xué)科學(xué)院實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心（動(dòng)物合格證號(hào)：2008001658794），均飼養(yǎng)于恒溫（25～27 ℃）、恒濕（25%～50%）和無(wú)特殊病原菌（SPF）條件下。于注射腫瘤細(xì)胞前，高糖飲食2 d，消毒裸鼠，用無(wú)菌套管針抽吸上述DU145細(xì)胞懸液200 μl，接種于實(shí)驗(yàn)鼠右腹股溝皮下，觀察腫瘤生長(zhǎng)情況。7 d后，將荷瘤裸鼠編號(hào)后，按不同處理方式隨機(jī)分為對(duì)照組、二甲雙胍組、PPP組，每組6只。對(duì)照組給予100 μl生理鹽水，二甲雙胍組給予50 μl生理鹽水+50 μl二甲雙胍（250 mg/kg），PPP 組給予 50 μl生 理 鹽 水+50 μl 0.1 μM 鬼 柏 苦 （picropodophyllin，PPP），每日瘤內(nèi)注射1次，每周稱重小鼠。二甲雙胍購(gòu)自上海信誼藥廠有限公司（國(guó)藥準(zhǔn)字H20050699），PPP購(gòu)自Sigma-Aldrich公司。

1.3 檢測(cè)指標(biāo)

1.3.1 腫瘤生長(zhǎng)情況 接種DU145細(xì)胞后3 w，處死小鼠，取出種植瘤并稱質(zhì)量。用游標(biāo)卡尺測(cè)量腫瘤的長(zhǎng)軸（L）和短軸（W），按公式 V=1/2×LW2計(jì)算腫瘤體積。腫瘤組織移至凍存管中，保存于液氮待用。同時(shí)觀察實(shí)驗(yàn)過(guò)程中，小鼠的體重、飲食、活動(dòng)等情況。

1.3.2 qRT-PCR檢測(cè)IGF-1R和STAT3 mRNA腫瘤組織提取總RNA后，逆轉(zhuǎn)錄獲得cDNA，逆轉(zhuǎn)錄試劑盒為PrimeScript1st Strand cDNA Synthesis Kit，購(gòu)自大連寶生物公司。采用qR T-PCR進(jìn)行mR NA定量分析，SYBRPremixExTaqII（TliR NaseHPlus）試劑盒購(gòu)自大連寶生物公司；PCR引物由上海生工生物合成，序列如下，IGF1R：F：5'-ATGCTGTTTGAA C TGATGCGCA-3'，R：5'-GCCCCCGGCGTTCTTGCTC GCC-3'，354 bp；STAT3：F：5'-TTCTGGGCACAAACAC A AAAG-3'，R：5'-TCAGTCACAATCAGGGAAGC 3'，145 bp；GAPDH：F：5'-CGCGAGAAGATGACCCAGAT-3'，R：5'-GCACTGTGTTGGCGTACAGG-3'，169 bp。 在ABI7500快速型實(shí)時(shí)定量PCR儀進(jìn)行檢測(cè)。根據(jù)PCR儀測(cè)得的 Ct值，使用 2-⊿⊿Ct法計(jì)算IGF-1R和STAT3 mR NA相對(duì)表達(dá)水平。

1.3.3 Western blot檢測(cè)IGF-1R β和Stat3蛋白

提取腫瘤組織總蛋白，以GAPDH為內(nèi)參，檢測(cè)腫瘤組織中IGF1R、STAT3蛋白表達(dá)情況。一抗IGF-I R eceptor β （111A9）Mouse mAb、Stat3 （124H6）Mouse mAb（稀釋比例 1:1000）和二抗 Anti-Mouse IgG，HR P-linkedAntibody（稀釋比例1:5000）均購(gòu)自CellSignaling Technology （CST）公司。 用 Image-Pro Plus軟件分析各樣品的目的蛋白、內(nèi)參蛋白條帶的灰度值，計(jì)算目的蛋白的相對(duì)表達(dá)量。

1.3.4 ELISA檢測(cè)血清IL-6和TNF-α 小鼠處死前，采集小鼠腹主動(dòng)脈外周血2 ml，3000轉(zhuǎn)/min離心5 min，收集血清，置于-80℃待用。采用雙抗體夾心法檢測(cè)IL-6和TNFVα ELISA水平，試劑盒購(gòu)自Biolegend公司。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法應(yīng)用SPSS17.0統(tǒng)計(jì)軟件分析數(shù)據(jù)，計(jì)量數(shù)據(jù)以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示，多組間比較采用方差分析，采用LSD-t法進(jìn)行兩組間比較，P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 3組腫瘤生長(zhǎng)情況比較 在實(shí)驗(yàn)過(guò)程中，3組體重?zé)o明顯差異（P＞0.05，表1），飲食及活動(dòng)均正常，均表現(xiàn)出良好的耐受性。小鼠經(jīng)不同處理3 w后，與對(duì)照組相比，二甲雙胍組與PPP組的腫瘤大小、體積明顯減小（P＜0.05），而二甲雙胍組與PPP組間比較無(wú)顯著差異（P＞0.05，表2）。

表2 各組腫瘤大小和體積比較

2.2 3組 IGF1R、Stat3蛋白和 IGF-1R、STAT3 mR NA表達(dá)水平比較 Western blot實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，二甲雙胍能顯著降低IGF-1R和Stat3蛋白的表達(dá)（P＜0.05），PPP組 IGF-1R和 Stat3表達(dá)量亦顯著降低（P＜ 0.05，圖 1）。

qPCR實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，二甲雙胍組與PPP組的IGF1R、STAT3 mR NA表達(dá)顯著低于對(duì)照組（P＜0.05），二甲雙胍組STAT3 mR NA表達(dá)顯著低于PPP組（P＜0.05），但二甲雙胍組IGF1RmR NA顯著高于PPP組（P＜0.05）。 見(jiàn)表3。

圖1 Western blot電泳圖

表1 各組不同處理后體重變化（g）

表33 組IGF1R、Stat3蛋白和IGF-1R、STAT3mRNA表達(dá)水平比較

2.3 3組血清IL-6和TNF-α水平比較 二甲雙胍組血清IL-6顯著低于對(duì)照組和PPP組（P＜0.05），對(duì)照組和PPP組IL-6比較無(wú)顯著性差異（P＞0.05）；3組間 TNF-α 比較無(wú)顯著差異（P＞ 0.05，表 4）。

表33 組血清IL-6和TNF-α水平比較

3 討論

二甲雙胍為一種胰島素增敏劑，可改善患者的胰島素抵抗，降低其體內(nèi)高胰島素血癥。近年來(lái)研究發(fā)現(xiàn)，二甲雙胍具有抗癌作用，其可能的抗癌機(jī)制是：激活A(yù)MP活化的蛋白激酶（AMPK），進(jìn)而抑制mTOR通路活性[7]，抑制惡性膠質(zhì)瘤的生長(zhǎng)和轉(zhuǎn)移；下調(diào)細(xì)胞周期蛋白D1，使卵巢腫瘤細(xì)胞有絲分裂受抑制[8]。二甲雙胍通過(guò)介導(dǎo)AMPK減少肝臟糖異生，并刺激肌肉組織攝取葡萄糖，降低空腹血糖及胰島素水平。在高胰島素濃度的環(huán)境下，腫瘤細(xì)胞膜表面的胰島素受體（IR）和IGF1R結(jié)合后，可激活下游ERK和PI3K等信號(hào)通路，促進(jìn)腫瘤細(xì)胞的惡性進(jìn)展[9]。IGF1和IGF2是正常機(jī)體組織中骨骼肌生長(zhǎng)、分化的重要因子，然而研究表明，在多種腫瘤組織中存在IGF-1R的過(guò)表達(dá)現(xiàn)象，使得封閉IGF-1R活性的靶向治療成為腫瘤治療的研究熱點(diǎn)。PPP是一種環(huán)木脂體，抗腫瘤活性天然產(chǎn)物鬼臼毒素的差位異構(gòu)體，可通過(guò)抑制IGF-1R活性及其下游信號(hào)通路Akt、Erk 活化，從而誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞凋亡[10]，因此，在本實(shí)驗(yàn)中作為陽(yáng)性對(duì)照。本研究結(jié)果顯示，經(jīng)二甲雙胍和PPP處理后，小鼠前列腺腫瘤大小、體積明顯縮小，證實(shí)二甲雙胍具有抑制前列腺癌生長(zhǎng)的作用，并且小鼠耐受性較好，表明二甲雙胍和PPP較安全，毒性作用小。

二代抗雄激素藥物恩雜魯胺能顯著抑制前列腺癌的進(jìn)展，然而因恩雜魯胺耐藥的發(fā)生，導(dǎo)致其僅能延長(zhǎng)患者4～6個(gè)月生存期。有研究顯示，二甲雙胍能增強(qiáng)恩雜魯胺的抑制作用，可通過(guò)抑制恩雜魯胺誘導(dǎo)的STAT3活化以及抑制TGF-β1表達(dá)，從而抑制上皮向間葉轉(zhuǎn)化[11]。為進(jìn)一步研究二甲雙胍抑制前列腺癌生長(zhǎng)的機(jī)制，本實(shí)驗(yàn)分析了IGF-1R/STAT3通路活化情況以及下游細(xì)胞因子代謝，探討其是否參與二甲雙胍抑制腫瘤的過(guò)程。PCR結(jié)果顯示，二甲雙胍和PPP能顯著下調(diào)前列腺癌中IGF-1R、STAT3 mRNA的表達(dá)，其中PPP對(duì)IGF-1R的抑制作用強(qiáng)于二甲雙胍。Western blot結(jié)果顯示，二甲雙胍和PPP處理后，腫瘤細(xì)胞IGF-1R、Stat3表達(dá)量亦顯著降低，表明IGF-1R/STAT3通路在二甲雙胍抑制前列腺癌生長(zhǎng)過(guò)程中具有重要作用。

STAT3通路是IL-6、TNF-α的主要分子途徑，參與調(diào)節(jié)細(xì)胞的生長(zhǎng)、增殖和凋亡抵抗，IL-6、TNF-α表達(dá)水平異常與前列腺癌的進(jìn)展有密切關(guān)聯(lián)。本研究結(jié)果表明，二甲雙胍可顯著降低前列腺癌小鼠血清中IL-6的表達(dá)。

綜上所述，二甲雙胍可通過(guò)下調(diào)IGF-1R/STAT3信號(hào)通路以及IL-6的表達(dá)，有效抑制前列腺癌的生長(zhǎng)，且二甲雙胍經(jīng)濟(jì)、安全、毒性小，對(duì)前列腺癌的治療作用值得深入研究。