岳敏，趙熙寧，宋亞楠，安茜，薛金愛，季春麗，崔紅利，李潤植

(山西農(nóng)業(yè)大學(xué) 分子農(nóng)業(yè)與生物能源研究所，山西 太谷 030801)

微藻是一類能光自養(yǎng)的單細(xì)胞或多細(xì)胞群體藻類，生長速度快、單位面積生物質(zhì)產(chǎn)量高，特別是一些微藻能高水平合成積累油脂，可用于生產(chǎn)食用油、工業(yè)用油和生物柴油。微藻光合作用還可以吸收并有效利用大量工業(yè)廢氣中的CO2及氮化物，可用于生物減排和治理環(huán)境污染[1]。此外，微藻細(xì)胞還能合成積累多種化合物，亦可用來生產(chǎn)具有高附加值生物基產(chǎn)品，如脂肪、多糖、色素、抗氧化劑、蝦青素、優(yōu)質(zhì)蛋白質(zhì)、不飽和脂肪酸、維生素等多種營養(yǎng)及生物活性物質(zhì)，這些化合物已廣泛應(yīng)用于化妝品、藥物、食品、農(nóng)業(yè)以及化學(xué)工業(yè)等多個領(lǐng)域[2]。

蛋白核小球藻(Chlorellapyrenoidosa)是一種球形單細(xì)胞淡水藻類，光合效率高、繁殖能力強(qiáng)，分布范圍廣，分類上為綠藻門、小球藻屬[3]。蛋白核小球藻不僅含有豐富的蛋白質(zhì)、氨基酸、不飽和脂肪酸、葉綠素、多種維生素和礦物質(zhì)等營養(yǎng)物質(zhì)[4]，且含有大量的油脂，既可用于食品、醫(yī)藥、飼料等行業(yè)，還可以用于生產(chǎn)生物柴油等。尤其是蛋白核小球藻營養(yǎng)成分全面均衡，被譽(yù)為完美的天然營養(yǎng)食品[5]。幾年來，蛋白核小球藻規(guī)?；B(yǎng)殖聯(lián)產(chǎn)健康食品等產(chǎn)業(yè)化發(fā)展迅速、市場需求日益增加。然而，蛋白核小球藻具有堅韌的細(xì)胞壁結(jié)構(gòu)，制約著細(xì)胞內(nèi)儲存的蛋白質(zhì)、油脂、藻多糖等營養(yǎng)物質(zhì)有效萃取和產(chǎn)品加工[6]。未破壁的全藻細(xì)胞作為食物原料直接食用，其營養(yǎng)成分被吸收和利用率極低。因此，建立安全、有效的藻細(xì)胞破壁工藝是蛋白核小球藻等微藻營養(yǎng)及功能產(chǎn)品生產(chǎn)的關(guān)鍵環(huán)節(jié)之一[7]。目前，微藻細(xì)胞破壁的方法主要分為機(jī)械法和非機(jī)械法[8]。非機(jī)械法如酸熱法、有機(jī)溶劑和生物酶法等使用大量的化學(xué)試劑或生物酶，不僅成本高、還會影響到萃取化合物的質(zhì)量，這些方法多用于實驗室規(guī)模破壁，不具備規(guī)?；a(chǎn)的潛力[9]。機(jī)械法破壁如超聲波、研磨法等優(yōu)勢在于破壁較充分，適用于各種藻類，無污染且適用于大規(guī)模生產(chǎn)。與研磨法耗時長、成本高以及僅限于實驗室規(guī)模相比，超聲波破壁作為一種物理方法有明顯優(yōu)勢，它是利用大于20kHZ的超聲波使細(xì)胞壁破碎，耗能較低、細(xì)胞破碎均勻、物質(zhì)萃取率較高、無污染，操作簡單便捷，有望實現(xiàn)連續(xù)化和規(guī)?；票赱10]。迄今，還沒有建立應(yīng)用超聲波處理對蛋白核小球藻進(jìn)行破壁的較完善技術(shù)工藝。本文以本實驗室分離獲得的富油蛋白核小球藻藻株CP-SX05為試材，以藻細(xì)胞破碎率和油脂萃取率為評判指標(biāo)，通過對超聲波處理所涉及到的藻細(xì)胞密度(g·mL-1)、藻細(xì)胞含水量、濕藻液pH、藻液量/體積和超聲波輸出功率、處理時間以及溫度等參數(shù)進(jìn)行優(yōu)化，以期建立蛋白核小球藻簡易有效的超聲波破壁方法，為后續(xù)建立規(guī)模化微藻破壁及油脂等天然化合物萃取的高效低成本工藝奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

1.1.1 藻種及培養(yǎng)

藻種為本實驗室前期分離鑒定純化獲得的一株蛋白核小球藻(Chlorellapyrenoidosa)Cp-SX05，該藻株生長速度很快，且油脂和蛋白質(zhì)含量高，是可商業(yè)化應(yīng)用的一個優(yōu)良株系。

培養(yǎng)：本研究選出了最適合上述藻株生長和油脂積累的BG-11培養(yǎng)基，其母液成分及工作液組分見表1和表2。培養(yǎng)液pH為7左右，室溫23 ℃，光照3 500 lx，通氣條件：CO2含量為3%，通氣速率為5 L·min-1，培養(yǎng)9～10 d。

表1 BG-11培養(yǎng)基(母液)配方Table 1 Medium composition of BG11

1.1.2 試劑與儀器

試劑：蒸餾水，三氯甲烷，甲醇，正己烷，石油醚，濃鹽酸，氫氧化鈉，氯化鈉，乙醚，濃硫酸。

儀器：AX523ZH/E精密電子天平，Jan-78磁力加熱攪拌器，HY-2 A調(diào)速多用振蕩器，PS-100AL超聲波儀，HHS-21-4電熱恒溫水浴鍋，MLS-3 781 L-PC高壓滅菌鍋，KH-55AS電熱恒溫干燥箱，BCD-539WT冰箱，ALLEGRA X-30R離心機(jī)，ALPHA 1-4LD冷凍干燥機(jī)，STARTER2100pH計，BIC-400光照培養(yǎng)箱，JTONE-J1-3微波爐，BC-R205C旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀，DHG-9 076 A數(shù)顯鼓風(fēng)干燥箱，GCMS-QP2010 Ultra氣相色譜質(zhì)譜聯(lián)用儀，Agilent 7890B氣相色譜儀。

表2 BG-11工作液配方Table 2 Working solution formulations of BG11

1.2 試驗方法

1.2.1 油脂含量的測定

取蛋白核小球藻50 mL，與正己烷1∶1混勻，在搖床上過夜12 h，離心收集上清液，蒸餾干燥放入烘箱烘干后稱重。油脂提取率按下式計算：

油脂提取率/%=W/(Wn×V)×100%

式中: W為提取的油脂質(zhì)量/g；Wn為每毫升藻液藻粉干重/g·mL-1；V為藻液體積/mL

1.2.2 OD值測定及藻細(xì)胞計數(shù)

利用可見光分光光度計測定蛋白核小球藻的OD680值，藻細(xì)胞的個數(shù)利用血球計數(shù)板進(jìn)行計數(shù)。

1.2.3 蛋白核小球藻細(xì)胞干重的測量

取對數(shù)期的蛋白核小球藻的藻液，8 000 r·min-1離心5 min，倒掉上清液，用蒸餾水重懸洗滌3次后離心棄上清，置于冷凍干燥機(jī)中24 h以后稱重。

1.2.4 藻細(xì)胞破碎率計算

細(xì)胞破碎率=(M-Mn)/M×100%

式中：M為視野中藻細(xì)胞原始個數(shù)；Mn為經(jīng)過細(xì)胞破碎后視野中藻細(xì)胞個數(shù)。

2 結(jié)果與分析

2.1 蛋白核小球藻生長曲線

每天在同一時間取蛋白核小球藻液，在最佳波長OD680進(jìn)行吸光度測定，3組平行重復(fù)，繪制生長曲線。如圖1所示，蛋白核小球藻生長曲線呈“S”型。培養(yǎng)前3 d，蛋白核小球藻生長速度緩慢，處于生長停滯(緩慢)期。在生長4 d后，蛋白核小球藻細(xì)胞生長速度大幅度增長，細(xì)胞數(shù)量也呈指數(shù)遞增，進(jìn)入對數(shù)生長期。從第11天開始蛋白核小球藻進(jìn)入了靜止期，細(xì)胞生長速度下降。

圖1 蛋白核小球藻的生長曲線Fig.1 Growth curve of Chlorella pyrenoidosa

2.2 含水量對藻細(xì)胞破壁率的影響

分別取不同含水量的蛋白核小球藻100 mL，搖勻。在溫度為20 ℃，輸出功率為200 W，超聲時間為 6 min，破碎 10 s 后間歇 10 s。在顯微鏡下統(tǒng)計破壁前后視野中完整細(xì)胞的個數(shù)，然后計算細(xì)胞破碎率，3次平行計數(shù)。由圖2可見，藻細(xì)胞破壁率隨著含水量的增加呈上升趨勢。含水量為20%～50%，破壁率均達(dá)到90%以上。含水量大于50%時，破壁率可上升到95%以上。但是，藻細(xì)胞含水量越大，藻液濃度低，處理效率和油脂提取率也降低。因此，藻細(xì)胞含水量在20%～50%之間，破壁效益最佳。

圖2 含水量對藻細(xì)胞破壁率的影響Fig.2 Effect of water content on the broken rate of algae cells

2.3 超聲時間對藻細(xì)胞破壁率的影響

取含水量為30%的蛋白核小球藻100 mL，在溫度為20 ℃，輸出功率為200 W，不同的超聲時間下，破碎10 s 后間歇10 s。在顯微鏡下統(tǒng)計破壁前后視野中完整細(xì)胞的個數(shù)，然后計算細(xì)胞破碎率，3次平行計數(shù)。結(jié)果如圖3所示，破壁率隨著時間的增加逐漸增大，但是在前15 min，細(xì)胞破壁率隨著超聲時間增加大幅度上升，在第15 min時破壁率達(dá)到93.8%，在15 min以后增長不明顯。綜合考慮成本，超聲15 min效益最佳。

圖3 超聲時間對藻細(xì)胞破壁率的影響Fig.3 Effect of ultrasonic time on the rate of rupture of algae cells

2.4 超聲功率對藻細(xì)胞破壁率的影響

取含水量為30%的藻液100 mL，溫度為20 ℃，不同的超聲功率下，超聲時間為 6 min，破碎10 s 后間歇10 s。在顯微鏡下統(tǒng)計破壁前后視野中完整細(xì)胞的個數(shù)，然后計算細(xì)胞破碎率，3次平行計數(shù)。結(jié)果如圖4所示，隨著超聲功率的增加，細(xì)胞破壁率逐漸增加，在250 W的時候破壁率達(dá)到94.1%，250 W以后基本沒什么變化。因此，最佳超聲功率選為250 W。

圖4 超聲功率對藻細(xì)胞破壁率的影響Fig.4 Effect of ultrasonic power on Shock broken rate of algae cells

2.5 超聲處理溫度對藻細(xì)胞破壁率的影響

取含水量為30%的藻液100 mL，不同溫度下，超聲功率為200 W，超聲時間為 6 min，破碎10 s 后間歇10 s。在顯微鏡下統(tǒng)計破壁前后視野中完整細(xì)胞的個數(shù)，然后計算細(xì)胞破碎率，3次平行計數(shù)。結(jié)果如圖5所示，隨著溫度增加，蛋白核小球藻的破壁率也在增加，在25 ℃時，細(xì)胞破壁率達(dá)到94.3%。在溫度超過25 ℃以后，細(xì)胞破碎率增加緩慢，且過高的溫度會破壞細(xì)胞的有機(jī)化合物。因此，最佳溫度確定為25 ℃。

圖5 溫度對細(xì)胞破壁率的影響Fig.5 Effect of temperature on cell breakdown rate

2.6 濕藻液pH對藻細(xì)胞破壁率的影響

取含水量為30%的藻液100 mL，設(shè)置不同pH，溫度為20 ℃，超聲功率為200 W，超聲時間為 6 min，破碎10 s 后間歇10 s。在顯微鏡下統(tǒng)計破壁前后視野中完整細(xì)胞的個數(shù)，然后計算細(xì)胞破碎率，3次平行計數(shù)。結(jié)果如圖6所示，藻細(xì)胞在強(qiáng)酸性條件下，破壁率高，因為酸性會使細(xì)胞壁結(jié)構(gòu)變疏松。但是，強(qiáng)酸會使脂肪酸等有機(jī)物水解，而且不適于進(jìn)行大規(guī)模處理。所以，確定濕藻液最佳pH為5。

圖6 pH對藻細(xì)胞破壁率的影響Fig.6 Effect of pH on cell breakdown rate in algae

2.7 藻液體積對細(xì)胞破壁率的影響

取含水量為30%的不同體積的藻液，pH為5，溫度為20 ℃，超聲功率為200 W，超聲時間為6 min，破碎10 s 后間歇10 s。在顯微鏡下統(tǒng)計破壁前后視野中完整細(xì)胞的個數(shù)，然后計算細(xì)胞破碎率，3次平行計數(shù)。如圖7所示，隨著藻液量的增加，小球藻的破壁率逐漸降低,在藻液體積為120 mL時破壁率最高達(dá)到94.8%。因此，最佳藻液量確定為120 mL。

圖7 藻液量對細(xì)胞破碎率的影響Fig.7 Effect of algae volume on cell broken rate

2.8 優(yōu)化后的超聲法對油脂提取率的影響

由上述測試結(jié)果可知，超聲波破壁的優(yōu)化參數(shù)為：藻液含水量為30%，溫度為25 ℃，藻業(yè)體積為120 mL,超聲時間為15 min，超聲功率為250 W，pH為5。如表3所示，沒有超聲破壁處理的蛋白核小球藻提取的油脂含量為20.4%，經(jīng)過研磨破壁處理后提取的油脂含量為39.8%，比未破壁增加95%。經(jīng)過優(yōu)化的超聲破壁后，蛋白核小球藻提取的油脂含量為40.1%，比未破壁增加96.8%。

表3不同破壁方法對蛋白核小球藻油脂萃取的影響

Table3 Effect of different cell wall breaking methods on oil extraction inC.pyrenoidosa

未破壁Unbroken cell wall研磨破壁Grinding 超聲波破壁Ultrasonic treatment油脂含量/%20.4±0.2339.8±0.5640.1±0.24

3 討論

微藻光合固碳能力強(qiáng)，具有較高的生長速度和較大的油脂積累量,可廣泛應(yīng)用于能源、醫(yī)藥、食品等行業(yè),亦是最有前景的可再生能源的優(yōu)質(zhì)生物原料[11]。微藻破壁是微藻制油工藝以及其他化合物萃取工藝中的至關(guān)重要環(huán)節(jié)[12]。已有研究探討提高細(xì)胞破壁率和減低成本的方法，但現(xiàn)階段微藻下游加工環(huán)節(jié)干燥和破壁耗能過高，制約其產(chǎn)業(yè)化[13]。孫利芹等[14]采用反復(fù)凍融法，在冷凍溫度為-30 ℃，對紫球藻細(xì)胞進(jìn)行破碎，破碎率達(dá) 70%左右?？追裁舻萚15]利用酸熱法提取酵母細(xì)胞內(nèi)的油脂，結(jié)果表明油脂最高提取率為39.87%。歐陽琴等[16]利用超聲法和凍融法對雨生紅球藻進(jìn)行破壁處理，細(xì)胞破碎率高達(dá)91.4%。

與其它已有的破壁方法相比，超聲法是一種操作簡單、無污染、耗液量小的物理破壁方法，且細(xì)胞破壁率較高。王雪青等[17]采用超聲破碎處理衣藻，破碎率可達(dá) 90%以上。湯衛(wèi)華等[18]利用超聲波法、反復(fù)凍融法和勻漿法對三角褐指藻進(jìn)行細(xì)胞壁破碎處理，結(jié)果破壁率最高的為超聲波破碎法，破壁率達(dá)到91.5%,油脂提取率為18.1%。

本研究以蛋白核小球藻為試材，對超聲破壁條件和參數(shù)進(jìn)行了探索與優(yōu)化。最佳條件為超聲溫度25 ℃，超聲時間為15 min，超聲功率為250 W，破碎率達(dá)到90%以上，這與孫利芹等[15]研究的超聲對紫球藻破碎效果相似，并且蛋白核小球藻破壁率比紫球藻高?？追裁舻萚16]的研究中發(fā)現(xiàn)酸會使細(xì)胞壁的結(jié)構(gòu)變疏松，有助于細(xì)胞壁裂解。本文研究了藻液pH對蛋白核小球藻破壁率的影響，結(jié)果表明pH越高細(xì)胞破壁率越低。pH低，細(xì)胞破碎率高。但是，大量的酸會增加成本，不利于大規(guī)模培養(yǎng)和應(yīng)用。所以，本研究選擇最佳pH為5，細(xì)胞破壁率達(dá)到93.8%(圖6)。大多數(shù)的研究報道，微藻油脂提取通常利用干藻粉，然而微藻干燥過程會增加成本[19]。為了降低成本達(dá)到規(guī)?；纳a(chǎn)，本試驗選擇濕藻體用于破壁和提油。結(jié)果表明，隨著藻細(xì)胞含水量的增大，細(xì)胞破壁率逐漸增大，在含水量達(dá)到20%～50%時，細(xì)胞破壁率變化不明顯，均能達(dá)到92%以上(圖2)。當(dāng)含水量達(dá)到50%，破壁率高達(dá)95%，含水量高于50%，破壁率雖然升高但油脂提取率明顯降低?？紤]對油脂提取率和能量消耗的影響，藻細(xì)胞含水量選擇20%～50%為最佳，易于規(guī)?；瘧?yīng)用，這為蛋白核小球藻規(guī)模化養(yǎng)殖聯(lián)產(chǎn)高營養(yǎng)價值及產(chǎn)品的生產(chǎn)加工提供了科學(xué)依據(jù)。利用研磨破碎法為對照，測定優(yōu)化的超聲波破壁法對蛋白核小球藻油脂萃取效果的影響，結(jié)果顯示，研磨破碎藻細(xì)胞后提取油脂得到的藻細(xì)胞含油量比沒有破壁的藻細(xì)胞油脂萃取所得含油量增加了95%。利用優(yōu)化的超聲波法對蛋白核小球藻破壁處理后提取油脂所得含油量比沒有破壁藻細(xì)胞萃取油脂所得含油量增加了96.8%。

4 結(jié)論

本文建立了簡易有效的蛋白核小球藻超聲波破壁最佳條件和參數(shù)：室溫25 ℃，濕藻液pH5,藻細(xì)胞含水量20%～50%，超聲波輸出功率250 W，處理時間為15 min，和處理量每次120 mL。依此條件和參數(shù)進(jìn)行處理，蛋白核小球藻破壁率達(dá)到94.8%，油脂萃取率達(dá)40.1%。這為蛋白核小球藻優(yōu)異藻株CP-SX05規(guī)模化養(yǎng)殖聯(lián)產(chǎn)高值營養(yǎng)及功能產(chǎn)品生產(chǎn)工藝的建立提供了科學(xué)依據(jù)。