張 兵，張麗娜，韓鵬軍，黃 瑞，祁東利，劉志東

（1.天津中醫(yī)藥大學(xué)，現(xiàn)代中藥發(fā)現(xiàn)與制劑技術(shù)教育部工程中心，天津 300193；2.天津中醫(yī)藥大學(xué)，天津市現(xiàn)代中藥重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室-省部共建國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室培育基地，天津 300193）

中藥白術(shù)為菊科植物白術(shù)（Atractylodesmacrocephala Koidz.）的干燥根莖。中醫(yī)認(rèn)為白術(shù)味苦、甘，性溫。歸脾、胃經(jīng)。具有健脾益氣，燥濕利水，止汗，安胎功效。用于脾虛食少，腹脹泄瀉，痰飲眩悸，水腫，自汗，胎動(dòng)不安等癥[1]。近年來(lái)的研究表明白術(shù)具有抗炎、利尿、抗衰老、抑制腫瘤、促進(jìn)胃腸運(yùn)動(dòng)、提高機(jī)體免疫力等作用[2-7]，同時(shí)對(duì)神經(jīng)系統(tǒng)與子宮平滑肌也有一定調(diào)節(jié)作用[8-9]。2015年版中國(guó)藥典中僅收錄了白術(shù)飲片，并未指明其藥材、飲片的含量測(cè)定項(xiàng)。本文研究建立了白術(shù)內(nèi)酯Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ含量測(cè)定方法，對(duì)來(lái)自4個(gè)產(chǎn)地的12批次白術(shù)飲片進(jìn)行了上述成分的含量測(cè)定，測(cè)定了白術(shù)飲片的指紋圖譜，并對(duì)結(jié)果進(jìn)行聚類分析，以期為白術(shù)的質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)研究提供依據(jù)和參考。

1 儀器與試藥

島津LC-20A液相色譜儀（日本島津公司），安捷倫1200LC-DAD液相色譜儀（美國(guó)安捷倫公司），XP205型十萬(wàn)分之一天平（METTLER TOLEDO），F(xiàn)124型萬(wàn)分之一天平（天津億諾科學(xué)儀器有限公司），Q-300B型超聲波清洗儀（昆山市超聲儀器有限公司），Mill-QⅡ型超純水系統(tǒng)（Millipore公司），中草藥粉碎機(jī)（天津市泰斯特儀器有限公司）。

白術(shù)內(nèi)酯Ⅰ（天津中新藥業(yè)，Lot.No.:W10-3-1，純度≥98.0%）；白術(shù)內(nèi)酯Ⅱ（天津中新藥業(yè)，Lot.No.:W13-4-9，純度≥98.0%）；白術(shù)內(nèi)酯Ⅲ（天津中新藥業(yè)，Lot.No.:W09-9-8，純度≥98.0%）；乙腈為色譜級(jí)（天津康科德試劑有限公司）；水為超純水；白術(shù)飲片來(lái)源見表1。

表1 白術(shù)產(chǎn)地與批次

2 方法與結(jié)果

2.1 白術(shù)飲片中白術(shù)內(nèi)酯含量測(cè)定

2.1.1 標(biāo)準(zhǔn)對(duì)照品儲(chǔ)備液制備 分別精密稱取白術(shù)內(nèi)酯Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ對(duì)照品適量，加甲醇制成每1 mL含76.83、77.61、156.40μg的標(biāo)準(zhǔn)對(duì)照品儲(chǔ)備液。

2.1.2 供試品溶液制備 精密稱取樣品粉末（過(guò)5號(hào)篩）2 g，置具塞錐形瓶中，精密加入甲醇25 mL，稱定質(zhì)量，超聲處理（功率300 W，頻率45 kHz）30 min，取出，再稱質(zhì)量，用甲醇補(bǔ)足減失質(zhì)量，搖勻，濾過(guò)，取續(xù)濾液，即得。

2.1.3 色譜條件 色譜柱Agilent ZORBAX Eclipse Plus C18（5μm,250 mm×4.6 mm），流動(dòng)相為乙腈-水=50∶50（v/v），流速 1.0 mL/min，柱溫 30 ℃，進(jìn)樣量10 μL，檢測(cè)波長(zhǎng) 222 nm（白術(shù)內(nèi)酯 I、III）[10-11]與278 nm（白術(shù)內(nèi)酯 II）[10-14]。

2.1.4 線性關(guān)系考察 取各對(duì)照品溶液，用甲醇稀釋成系列濃度，按2.1.3中條件測(cè)定色譜峰面積，以標(biāo)準(zhǔn)品濃度（μg/mL）為橫坐標(biāo)（X），色譜峰面積為縱坐標(biāo)（Y），繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，白術(shù)內(nèi)酯Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ回歸方程分別為：Y=44219X-1399.9（r2=0.9985），Y=57339X-1 035.3（r2=0.999 2），Y=27 654X-3 278.8（r2=0.996 9）；線性范圍分別為 0.015～0.768μg，0.016～0.776μg和0.031～1.594 μg。

2.1.5 精密度實(shí)驗(yàn) 精密吸取安徽20150603批次白術(shù)飲片供試品溶液10μL，連續(xù)進(jìn)樣6次，測(cè)定色譜峰面積，結(jié)果白術(shù)內(nèi)酯Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ的RSD（n=6）分別為1.58%、2.28%和1.03%。數(shù)據(jù)表明本實(shí)驗(yàn)精密度良好。

2.1.6 穩(wěn)定性實(shí)驗(yàn) 精密吸取安徽20150603批次白術(shù)飲片供試品溶液 10 μL，于 0、2、4、8、12、24 h分別進(jìn)樣分析，測(cè)定色譜峰面積，結(jié)果白術(shù)內(nèi)酯Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ的 RSD（n=6）分別為 1.46%、3.81%和0.96%。表明供試品溶液在制備后24 h內(nèi)穩(wěn)定。

2.1.7 重復(fù)性實(shí)驗(yàn) 精密稱取安徽20150603批次白術(shù)飲片粉末6份，每份2 g，按2.1.2項(xiàng)下方法制備供試品溶液，精密吸取10μL進(jìn)樣測(cè)定。結(jié)果白術(shù)內(nèi)酯Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ的RSD分別為2.61%、2.35%和3.50%。結(jié)果表明方法重復(fù)性良好。

表2 白術(shù)飲片中白術(shù)內(nèi)酯含量測(cè)定結(jié)果（%，n=2）

2.1.8 加樣回收實(shí)驗(yàn) 取已知白術(shù)內(nèi)酯含量的樣品粉末6份，每份1 g，精密稱定，置錐形瓶中，加入濃度為76.83μg/mL的白術(shù)內(nèi)酯Ⅰ對(duì)照品溶液10 mL，濃度為77.61μg/mL的白術(shù)內(nèi)酯Ⅱ?qū)φ掌啡芤? mL，加入濃度為78.20μg/mL的白術(shù)內(nèi)酯Ⅲ對(duì)照品溶液各6 mL，按2.1.2項(xiàng)下方法制備供試溶液，精密吸取10μL進(jìn)樣測(cè)定，計(jì)算回收率。結(jié)果白術(shù)內(nèi)酯Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ的平均回收率分別為100.98%，95.35%和95.23%，RSD分別為0.78%，2.40%和4.46%。結(jié)果表明方法加樣回收率結(jié)果良好。

2.1.9 樣品測(cè)定結(jié)果 分別取4個(gè)產(chǎn)地12批次白術(shù)樣品粉末，每個(gè)樣品取2份，按2.1.2項(xiàng)下方法制備供試品溶液，精密吸取10μL進(jìn)樣測(cè)定，樣品中白術(shù)內(nèi)酯Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ的含量結(jié)果見表2。

2.2 白術(shù)飲片指紋圖譜的建立與測(cè)定

2.2.1 標(biāo)準(zhǔn)對(duì)照品溶液和供試品溶液制備 見2.1項(xiàng)下內(nèi)容。

2.2.2 色譜條件 色譜柱Agilent ZORBAX Eclipse Plus C18（5μm,250 mm×4.6 mm），流動(dòng)相為乙腈（A）-水（B），梯度洗脫程序?yàn)椋?～15 min，45%～55%A；15～20 min，55%A；20～40 min，55%～61%A；40～51 min，61%～69%A；51～80 min，69%～100%A；80～87 min，100%A；流速 1.0 mL/min，進(jìn)樣量 10μL，柱溫 25℃，檢測(cè)波長(zhǎng)220 nm。

2.2.3 精密度實(shí)驗(yàn) 取供試品溶液，連續(xù)進(jìn)樣6次，按2.2.2項(xiàng)下的色譜條件測(cè)定，以參比峰的保留時(shí)間和峰面積為參照，計(jì)算得供試品溶液中各共有峰相對(duì)保留時(shí)間的RSD為0.04%～2.61%，相對(duì)峰面積的RSD為0.59%～6.91%，表明儀器穩(wěn)定，儀器精密度良好。

2.2.4 穩(wěn)定性實(shí)驗(yàn) 取供試品溶液，在0、2、4、8、12、24、48 h按2.2.2項(xiàng)下的色譜條件測(cè)定6次。以參比峰的保留時(shí)間和峰面積為參照，計(jì)算得供試品溶液中各共有峰相對(duì)保留時(shí)間RSD在0.003%～1.82%，相對(duì)峰面積的RSD在1.09%～7.58%，表明供試品溶液在48 h內(nèi)穩(wěn)定。

2.2.5 重復(fù)性實(shí)驗(yàn) 取6份供試品溶液，按2.2.2項(xiàng)下的色譜條件測(cè)定。以參比峰的保留時(shí)間和峰面積為參照，計(jì)算得供試品溶液中各共有峰相對(duì)保留時(shí)間的RSD為0.00%～0.08%，相對(duì)峰面積的RSD為1.46%～6.28%，表明方法重復(fù)性好。

2.2.6 樣品的測(cè)定和指紋圖譜的建立 取標(biāo)準(zhǔn)對(duì)照品溶液和12批白術(shù)供試品溶液，分別進(jìn)樣10μL，液相測(cè)定。將色譜數(shù)據(jù)導(dǎo)入“中藥色譜指紋圖譜相似度評(píng)價(jià)系統(tǒng)（2004A版）”，7號(hào)峰峰面積最大且穩(wěn)定，故選擇作為參比峰（S），以A1圖譜為校正參照，時(shí)間窗寬度設(shè)為1.0 min，建立12批次白術(shù)飲片指紋圖譜疊加圖，見圖1，確定10個(gè)共有峰，得到白術(shù)飲片共有峰指紋圖譜（R），每批樣品與R比較，計(jì)算12批樣品的指紋圖譜相似度，其相似度在0.972～0.998之間，見表3。

圖1 白術(shù)飲片的指紋圖譜疊加圖和共有峰圖譜（R）

表3 12批白術(shù)指紋圖譜相似度

2.2.7 系統(tǒng)聚類分析 以12批白術(shù)飲片中的3種成分含量、10種共有成分的相對(duì)峰面積為變量，采用SPSS22.0統(tǒng)計(jì)軟件對(duì)樣品進(jìn)行聚類分析。采用利差平方和法（Ward法），以歐氏距離平方作為樣品測(cè)度，聚類樹狀圖見圖2。

由系統(tǒng)聚類樹狀圖可以看出，12批白術(shù)飲片樣品被分為4類，與白術(shù)飲片產(chǎn)地具有較好的一致性，根據(jù)聚類分析的結(jié)果可大致判斷白術(shù)飲片的產(chǎn)地。

圖2 白術(shù)飲片聚類分析

3 討論

分析4個(gè)產(chǎn)地12批次白術(shù)飲片中白術(shù)內(nèi)酯Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ的含量結(jié)果，發(fā)現(xiàn)白術(shù)內(nèi)酯的單一成分含量和3個(gè)成分總含量的高低順序具有一致性，各產(chǎn)地飲片中白術(shù)內(nèi)酯含量由高至低依次為浙江、河北、湖南、安徽，而這可能與其產(chǎn)地、生長(zhǎng)年限、環(huán)境、采收加工等因素有關(guān)。

在指紋圖譜相似度評(píng)價(jià)中，4個(gè)產(chǎn)地12批次白術(shù)飲片指紋圖譜與共有峰R圖譜的相似度在0.972～0.998之間。其中A8樣品（浙江20150701）的相似度最低（0.972），這可能是該樣品中白術(shù)內(nèi)酯總量最高所造成的。

在系統(tǒng)聚類分析中，A7～A9樣品被分為一類，表明該產(chǎn)地（浙江）白術(shù)飲片不同批次之間質(zhì)量均一性良好，這與其內(nèi)酯類含量在4個(gè)產(chǎn)地中最高的含量測(cè)定結(jié)果和最低的指紋圖譜相似度結(jié)果相一致。而A4與A5、A1與A3各被分至一類，表明這兩個(gè)產(chǎn)地（安徽、湖南）的白術(shù)飲片質(zhì)量較為均一。

高效液相色譜法含量測(cè)定結(jié)合指紋圖譜分析與系統(tǒng)聚類分析的評(píng)價(jià)方法，適用于中藥質(zhì)量控制與評(píng)價(jià)。在本實(shí)驗(yàn)中，通過(guò)三者結(jié)合的方法，在一定程度上表征了不同產(chǎn)地不同批次白術(shù)飲片在化學(xué)成分方面的共性與差異，并大致區(qū)別出了白術(shù)飲片的產(chǎn)地，基于三者的綜合信息，可以為白術(shù)飲片質(zhì)量控制與評(píng)價(jià)提供參考。