加蘇爾·阿不都克里木，努爾古麗·熱合曼

（新疆師范大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，新疆烏魯木齊 830054）

坎兒井“karez”，從漢朝時(shí)期開始，在新疆吐魯番等特殊干旱地就已經(jīng)出現(xiàn)坎兒井，巧妙的利用豐富的地下水資源，古稱“井渠”（鄧正新和胡居紅，2008）。據(jù)公開發(fā)表的研究資料顯示，69條天然坎兒井水中57%滿足生活飲用水標(biāo)準(zhǔn)，83%適合于農(nóng)田灌溉用水（林亞，2010）。

蛋白酶是催化蛋白和多肽分子中肽鍵的斷裂，產(chǎn)生肽片段和游離氨基酸的一類酶的總稱。蛋白酶是一種蛋白質(zhì)，具有蛋白質(zhì)特殊的4級(jí)結(jié)構(gòu)（宋熙熙，2017；Grzonka等，2000；Horton等，1996；Brünger等，1986）。蛋白酶具有較高的穩(wěn)定性，是一類重要的工業(yè)用酶，廣泛分布在動(dòng)物內(nèi)臟、植物莖葉、果實(shí)和微生物中，目前占據(jù)了全球酶制劑市場(chǎng)中蛋白酶銷售額的50%左右（秦艷梅等，2017）。其中來(lái)源于細(xì)菌的蛋白酶占據(jù)了全球市場(chǎng)的20%（郇惠杰等，2013）。

微生物的生長(zhǎng)繁殖迅速，培養(yǎng)成本低；微生物分泌的蛋白酶大多數(shù)屬于胞外酶類，具有容易分離純化（黃文濤和胡學(xué)智，1989）等特點(diǎn)，也被認(rèn)為是安全微生物（GRAS）；同時(shí)對(duì)載體的要求不高，易開展基因工程研究（Pop等，2003；Emmert等，1999），且與動(dòng)植物來(lái)源蛋白酶相比，微生物產(chǎn)生的酶水解能力強(qiáng)、速度快、水解產(chǎn)物苦味少，所以在食品等眾多行業(yè)得到廣泛應(yīng)用。

蛋白酶在生物技術(shù)、食品工業(yè)、釀造工業(yè)、飼料工業(yè)、洗滌劑工業(yè)、制革工業(yè)、醫(yī)藥工業(yè)、日用化學(xué)品、紡織及廢物處理等領(lǐng)域也有廣泛應(yīng)用（Temiz等，2013；Ktari等，2012；Rao等，1998）。蛋白酶可用于提高食品的質(zhì)地和風(fēng)味，比如干酪制造、焙烤工業(yè)、肉類嫩化等。在食品發(fā)酵和釀造時(shí)，蛋白酶可分解面粉和谷物中的蛋白質(zhì)，增加酵母營(yíng)養(yǎng)，從而促進(jìn)酵母的繁殖和發(fā)酵速度（何林玲等，2014）。隨著對(duì)蛋白酶需求的日益增多，提高菌株產(chǎn)酶能力顯得尤為重要，但酶在體外酶制劑開發(fā)利用時(shí)，易受pH、溫度和酶的變性劑等環(huán)境因素影響，因此，研究酶學(xué)特征是酶資源開發(fā)利用的理論基礎(chǔ)（王俊等，2012）。

蛋白酶參與生物體生理活動(dòng)和疾病的發(fā)生，與生物體中消化和吸收食物蛋白、組織蛋白的酶促降解、血液凝固、溶血功能、消炎、動(dòng)物血壓調(diào)節(jié)、細(xì)胞分化自溶、生物體的衰老、癌癥轉(zhuǎn)移和生物活性肽的活化等有密切關(guān)系（胡學(xué)智，2006）。

1 材料、菌株的分離篩選與蛋白酶活力測(cè)定

1.1 樣品采集 2015年6月份從吐魯番市亞爾鄉(xiāng)亞爾村米依木阿吉坎兒井、瓊波斯塔克坎兒井，葡萄鄉(xiāng)英薩村阿吾提坎兒井，葡萄鄉(xiāng)達(dá)甫散蓋村的達(dá)甫散蓋坎兒井和沙依坎兒井等6條坎兒井采集5份水樣。

1.2 培養(yǎng)基 牛肉膏分離培養(yǎng)基，產(chǎn)蛋白酶菌株篩選培養(yǎng)基（陳國(guó)參等，2013；張銳等，2001），初始產(chǎn)蛋白酶培養(yǎng)基（陳顯玲，2014）。

1.3 菌株的分離純化 從坎兒井水樣為實(shí)驗(yàn)材料按常規(guī)稀釋涂布法進(jìn)行分離菌株，用線法進(jìn)行純化并保藏（柯野等，2015；李國(guó)娟等，2009）

1.4 產(chǎn)蛋白酶菌株的篩選 將已分離純化的76株菌株用點(diǎn)種法接種在蛋白酶產(chǎn)生菌篩選平板上，37℃培養(yǎng)5 d，菌落周圍有透明圈出現(xiàn)的為陽(yáng)性，為蛋白酶產(chǎn)生菌。

1.5 蛋白酶活力測(cè)定 采用文獻(xiàn)（金玉蘭和王玉榮，2014；魏群，2009）方法測(cè)蛋白酶活。以2%酪蛋白（0.05moL/L Tirs-HCL緩沖液，pH=8）為底物，將粗酶液和底物溶液分別置于37℃保溫10 min后，準(zhǔn)確吸取 1000 μL底物溶液與1000 μL適度稀釋的粗酶液充分混勻，在溫度37℃下振蕩反應(yīng)1 h后，加入2000 μL終止液（三氯乙酸18 g/L，乙酸20 g/L，醋酸鈉18 g/L）終止反應(yīng)，靜置15 min，離心取上清液，用紫外分光光度計(jì)測(cè)定280 nm處吸光值，以0.05 mol/L Tirs-HCL 緩沖液為空白，采用37℃恒溫振蕩前添加終止液的反應(yīng)管對(duì)照，測(cè)定酶活。酶活計(jì)算公式：

酶活力（U/mL）=△ A280×1000×n

式中：△A為反應(yīng)液吸光度值-對(duì)照液的吸光度值；n為樣品的稀釋倍數(shù)。

酶活單位定義：在一定條件下，每分鐘粗酶液中的蛋白酶水解底物酪蛋白使△A280增加0.001個(gè)單位所需要的酶量1個(gè)蛋白酶活力單位，以U/mL表示。

1.6 試劑與儀器 2800UV/VIS 型紫外分光光度計(jì)（龍尼柯（上海）儀器有限公司），722型可見光分光光度計(jì)（上海菁華科技儀器有限公司），搖床TS-211F（上海天呈實(shí)驗(yàn)儀器制造有限公司），酪蛋白（中國(guó)醫(yī)藥上海試劑站），Yeast Extract（Oxoid公司產(chǎn)品），葡萄糖（上?；瘜W(xué)試劑分裝廠）等主要藥品均為分析純。

2 實(shí)驗(yàn)方法和結(jié)果

2.1 產(chǎn)蛋白酶菌株的篩選 已分離純化的76株菌株中篩選出一株產(chǎn)蛋白酶活性較高的X-34菌株。將菌株點(diǎn)種法接種于脫脂牛奶平板培養(yǎng)基上，37℃培養(yǎng)5 d后，X-34菌株形成的產(chǎn)蛋白酶透明圈與菌落直徑比值較大，X-34菌株的產(chǎn)蛋白酶透明圈直徑為50 mm，菌落直徑為14 mm。因此，選擇X-34菌株作為后續(xù)實(shí)驗(yàn)對(duì)象。

2.2 菌株鑒定 將菌株X-34鑒定按文獻(xiàn)（東秀珠等，2001；布坎南等，1984）進(jìn)行。菌株能形成乳白色緣毛狀菌落，具有菌體桿狀，G+，能產(chǎn)生蛋白酶、淀粉酶、氧化酶、過(guò)氧化氫酶等產(chǎn)酶特性，能形成芽孢；芽孢位于菌體中央?？尚纬筛鶢罹浜途ぃ钸m生長(zhǎng)溫度為37℃、能生長(zhǎng)于3%氯化鈉濃度的培養(yǎng)基上和pH7.5時(shí)生長(zhǎng)最好，呼吸代謝類型等特征。根據(jù)X-34菌株的菌體和菌落特性、生理生化實(shí)驗(yàn)結(jié)果和16s rRNA基因序列分析結(jié)果，鑒定為枯草芽孢桿菌（Bacillus subtilis）。

2.3 發(fā)酵粗酶液的制備 量取X-34菌株種子液10 mL，接種于含90 mL發(fā)酵培養(yǎng)液的三角瓶中，震蕩培養(yǎng)72 h，取10 mL培養(yǎng)液6000 r/min離心10 min，收集上情液并冰箱保存?zhèn)溆谩?/p>

2.4 產(chǎn)蛋白酶產(chǎn)生菌X-34的產(chǎn)酶條件

2.4.1 發(fā)酵時(shí)間對(duì)X-34菌株產(chǎn)蛋白酶的影響將菌株X-34種子液按10%的比例接入到產(chǎn)蛋白酶培養(yǎng)液中，置于37℃，搖床180 r/min，培養(yǎng)12、24、36、48、60 h時(shí)測(cè)酶活力（結(jié)果見圖 1）。結(jié)果表明，產(chǎn)蛋白酶菌株X-34發(fā)酵時(shí)間48 h時(shí)，蛋白酶酶活力達(dá)到1547 U/mL，所以該菌株的最佳發(fā)酵時(shí)間為48 h。

圖1 培養(yǎng)時(shí)間對(duì)X-34菌株產(chǎn)酶活性的影響

2.4.2 溫度對(duì)產(chǎn)蛋白酶菌株X-34產(chǎn)酶的影響將產(chǎn)蛋白酶菌株X-34種子液接種于5份產(chǎn)酶培養(yǎng)液后，在溫度分別為 20、25、37、40℃的條件下，180 r/min振蕩培養(yǎng)48 h，測(cè)定酶活力（結(jié)果見圖2）。實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，產(chǎn)酶菌X-34發(fā)酵溫度為37℃時(shí)，蛋白酶活力達(dá)到1538 U/mL，該菌株最佳發(fā)酵溫度為37℃。

圖2 發(fā)酵溫度對(duì)X-34菌株產(chǎn)酶活力的影響

2.4.3 初始pH對(duì)產(chǎn)蛋白酶菌株X-34產(chǎn)酶的影響 菌株X-34的種子液和初始pH分別為6，6.5，7，7.5，8的產(chǎn)酶培養(yǎng)液中按1∶10的比例加入后，37℃振蕩速度180 r/min的條件下培養(yǎng)48 h，測(cè)定酶活力（結(jié)果見圖3）。結(jié)果可以看到，產(chǎn)酶菌X-34發(fā)酵初始pH為7時(shí)，蛋白酶活力達(dá)到1543 U/mL，所以該菌株最適發(fā)酵初始pH為7。

圖3 初始pH對(duì)X-34菌株產(chǎn)酶活性的影響

2.4.4 裝液量對(duì)菌株X-34產(chǎn)酶的影響 按無(wú)菌操作要求，準(zhǔn)確量取菌株X-34的種子液2、4、6、8、10 mL，分別加入于裝 18、36、54、72、90 mL產(chǎn)酶培養(yǎng)液的250 mL錐形瓶?jī)?nèi)，初始pH為7，在37℃，180 r/min速度振蕩培養(yǎng)48 h，測(cè)定酶活力（結(jié)果見圖4）。結(jié)果顯示，裝液量為80 mL時(shí)，產(chǎn)蛋白酶活力達(dá)到1532 U/mL。

圖4 裝液量對(duì)X-34菌株產(chǎn)酶活性的影響

2.4.5 金屬離子對(duì)菌株X-34產(chǎn)酶活性的影響將菌株X-34種子液按10%的比例分別加含0.05%金屬離子 Na+、Ca2+、Mg2+、Al3+、Fe3+的產(chǎn)酶培養(yǎng)液中，在37℃，pH 7，180 r/min速度的條件下振蕩培養(yǎng)48 h，測(cè)定酶活力（結(jié)果見圖5）。結(jié)果顯示，培養(yǎng)基含 Na+、Ca2+、Mg2+、Al3+時(shí)，菌株X-34的產(chǎn)蛋白酶活性不同程度的下降，培養(yǎng)基含F(xiàn)e3+時(shí)產(chǎn)酶活性影響不大。

圖5 金屬離子對(duì)X-34菌株酶活的影響

2.4.6 碳源對(duì)菌株X-34產(chǎn)酶活性的影響 菌株X-34種子液按培養(yǎng)基10%的比例接種到碳源濃度為1%葡萄糖和1%麥芽糖，1%淀粉，1%蔗糖，1%乳糖代替葡萄糖作為唯一碳源的培養(yǎng)基中，在37℃，pH 7，振蕩速度為180 r/min的條件下振蕩培養(yǎng)48 h，測(cè)定酶活力（結(jié)果見圖6）。結(jié)果顯示，菌株X-34的最適碳源為葡萄糖。

圖6 碳源對(duì)雙重產(chǎn)酶菌X-34菌株產(chǎn)酶活性的影響

2.4.7 氮源對(duì)菌株X-34產(chǎn)酶活性的影響 菌株X-34的種子液按10%的比例分別加入含1%牛肉膏，1%胰蛋白胨，1%硝酸鈉，1%硝酸鉀，1%尿素代替1%蛋白胨作為氮源的培養(yǎng)基中，以葡萄糖為唯一碳源，37℃，pH 7，振蕩速度180 r/min的條件培養(yǎng)48 h，測(cè)定酶活力（結(jié)果見圖7）。X-34菌株的最適氮源為牛肉膏，其次為蛋白胨。

圖7 氮源對(duì)X-34菌株產(chǎn)酶活性的影響

2.5 菌株X-34產(chǎn)生的蛋白酶部分酶學(xué)特性 微生物細(xì)胞繁殖過(guò)程中可以產(chǎn)生胞外酶和胞內(nèi)酶，菌株X-34產(chǎn)生的蛋白酶是胞外酶。微生物發(fā)酵液中提取胞外酶的一般方法是將菌株培養(yǎng)液，離心除菌體，收集上清液，接著用鹽析，透析，最后保存于緩沖溶液中（Fuji等，1983）。影響蛋白酶活力的因素很多，比如酶濃度、底物濃度、溫度、pH、激活劑和抑制劑等。本文中報(bào)道菌株X-34產(chǎn)生蛋白酶的最適反應(yīng)溫度和最適反應(yīng)pH。

2.5.1 反應(yīng)溫度對(duì)蛋白酶活力的影響 應(yīng)用50 mmol/L，pH7.2的磷酸鹽緩沖溶液適當(dāng)稀釋粗酶液后，在最適pH條件下分別在30、32.5、35、37.5、40、42.5、45、47.5、50、52.5、55℃ 等 不 同 溫度下測(cè)定菌株粗酶液的蛋白酶活力（結(jié)果如圖8），結(jié)果表明，X-34菌株產(chǎn)生胞外蛋白酶的最適催化溫度為40℃。

圖8 溫度對(duì)X-34菌株蛋白酶活力的影響

2.5.2 反應(yīng)pH對(duì)蛋白酶活力的影響 使用檸檬酸-磷酸氫二鈉緩沖液、碳酸鈉-碳酸氫鈉緩沖液、廣泛緩沖液，分別配成酸堿度為4.0、4.5、5.0、5.5、6.0、6.5、7.0、7.5、8.0、8.5和 9.0的不同緩沖溶液。用不同pH的緩沖液配制2%的酪蛋白溶液并用不同pH的緩沖液適當(dāng)稀釋粗酶液，并稀釋粗酶液和2%的酪蛋白溶液混合，按文獻(xiàn)（金玉蘭和王玉榮，2014；魏群，2009）方法測(cè)酶活（結(jié)果如圖9）。結(jié)果顯示，X-34菌株的蛋白酶在pH7.0～8時(shí)酶活力較高；在pH7.5時(shí)酶活達(dá)到最高值。確定菌株產(chǎn)生蛋白酶的最適催化pH值為7.5。

圖9 pH對(duì)X-34菌株蛋白酶活力的影響

3 結(jié)論

各項(xiàng)產(chǎn)酶條件優(yōu)化實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，X-34菌株是產(chǎn)蛋白酶菌株，最適生長(zhǎng)溫度和最適產(chǎn)酶溫度為37℃，最佳產(chǎn)酶時(shí)間為48 h，最適初始pH為7；裝液量為80 mL，碳源為葡萄糖，氮源為牛肉膏，其次為蛋白胨。在最適產(chǎn)酶條件下發(fā)酵時(shí)，菌株X-34產(chǎn)生的蛋白酶活力達(dá)到1558 U/mL。菌株X-34產(chǎn)生的蛋白酶最適催化溫度為40℃和最適催化pH為7.5。